Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell des Parkinsonismus zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Medikamente für die Operation vorbereitet werden. Im nächsten Schritt wird die chirurgische Apparatur eingerichtet, anschließend erfolgt eine einseitige Läsionsoperation mit sechs Hydroxydopamin, gefolgt von einer angemessenen postoperativen Versorgung.

Die sechs mit Hydroxydopamin läsionierten Tiere können für Verhaltensversuche verwendet werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse eine mehr als 95 %ige Dopaminderpletion im medialen vorderen Gehirnbündel einseitig. Die beiden wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens, auf die geachtet werden muss, sind in erster Linie eine angemessene postoperative Versorgung, um das Überleben der Tiere sicherzustellen.

Und zweitens ist darauf zu achten, dass die Vorbereitung der Ausrüstung zur Infusion von sechs Hydroxydopamin sorgfältig durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Gabe des Neurotoxins vollständig erfolgt. Beginnen Sie dieses Verfahren damit, dass Sie die chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven sterilisieren. Reinigen Sie anschließend alle Oberflächen und Geräte mit Isopropylalkohol.

Bereiten Sie dann die Nachsorge vor, indem Sie einen Erholungskäfig für die Maus mit Papiertüchern auf dem Boden ausstatten. Stellen Sie den Käfig unter eine Wärmelampe oder auf eine beheizte Unterlage, um den Narkosewagen vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Sauerstoffzulauf angeschlossen und geöffnet ist und das Isofluran-Reservoir vollständig gefüllt ist.

Danach stellen Sie den Sauerstofffluss auf 1 % und den Isofluran auf zwei bis 4 % ein. Als nächster Schritt folgt die Montage der Infusionsapparatur. Ziehen Sie eine RN-Muttern aus Metall auf eine Seite des Spitzenrohrs, gefolgt von der Spitzenhülse feral. Dann die kanonische PFA-Hülse ausrichten, sodass der Kegel an der kanonischen PPFA-Hülse in das passende Teil der Spitzenhülse gleitet. Feral.

Danach die gekoppelte Spitzenhülse und die kanonische PFA-Ferula in beide Enden des doppelten kleinen Naben-RN-Kupplungsstücks einsetzen und die RN-Muttern an den anderen Enden des doppelten kleinen Naben-RN-Kupplungsstücks festziehen. Eine Injektionsnadel mit 33 Gauge einführen. Die Nadel durch eine der RN-Muttern einfädeln und festziehen.

Stellen Sie sicher, dass die Nadel mit 33 Gauge einen Winkel von 180 Grad zum doppelten kleinen Hub-RN-Kupplungsstück hat. Danach wird am anderen Ende des Peak-Schlauchs eine der RN-Metallmuttern, gefolgt von einer Peak-Cup-Feral, aufgeschraubt. Anschließend wird die kanonische PFA-Feral in die tiefere Nut des zweiten doppelten kleinen Hub-RN-Kupplungsstücks eingeführt und die RN-Metallmutter festgezogen, um die Verbindung zu sichern.

Als Nächstes wird am anderen Ende des zweiten kleinen Dual-RN-Hub-Kupplungsstücks der Lockstoff in den kleinen Hub-RN-Adapter eingeführt und die RN-Metallmutter des Lockstoffs festgezogen, um die Verbindung zu sichern. Die Montage der Infusionsapparatur ist damit abgeschlossen. Ein weiterer Vorbereitungsschritt ist das Spülen der Infusionsapparatur.

Füllen Sie zunächst die 250-Mikroliter- und die Ein-Mikroliter-Hamilton-Spritze mit steriler Wasser. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Befestigen Sie dann die 250-Mikroliter-Spritze am Lockstoff-Adapter und drücken Sie den Kolben der 250-Mikroliter-Spritze so zusammen, dass Wasser durch die Injektionsnadel mit 33 Gauge am anderen Ende des Schlauches austritt.

Setzen Sie den Wasserfluss durch das System fort, während Sie die 250-Mikroliter-Spritze aus dem Köderadapter herausziehen. Lassen Sie einen kleinen Wassertropfen an der Spitze des Köderadapters verbleiben und drücken Sie den Kolben der Ein-Mikroliter-Spritze nach unten, bis ein kleiner Wassertropfen austritt. Setzen Sie danach die Ein-Mikroliter-Spritze vorsichtig in den Köderadapter ein.

Stellen Sie sicher, dass die Wasserperle auf der Ein-Mikroliter-Spritze mit der Wasserperle auf dem Lockstoff-Adapter verbunden ist. Stecken Sie anschließend die Ein-Mikroliter-Spritze vollständig in den Lockstoff-Adapter und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen im kleinen Dual-RN-Hub-Kupplungsstück befinden. Befestigen Sie nun die Perfusionsapparatur am stereotaktischen Rahmen und klemmen Sie mit der Infusionspumpe das kleine Dual-RN-Hub-Kupplungsstück mit der 33-Gauge-Injektionsnadel am Manipulatorarm des stereotaktischen Rahmens fest.

Danach die Ein-Mikroliter-Spritze an der Perfusionspumpe befestigen. Anschließend die Infusionspumpe so programmieren, dass sie 30 Minuten vor dem Eingriff eine Infusionsgeschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute ermöglicht. Das Tier wiegen und sein Gewicht dokumentieren.

Geben Sie eine Mischung aus 2,5 Milligramm pro Milliliter Dopaminhydrochlorid und 0,5 Milligramm pro Milliliter Parlinehydrochlorid in einer Dosis von 10 Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht mittels intraperitonealer Injektion dem Maus zu. Danach platzieren Sie eine warme Heizplatte unter die Ohrhalterungen und die Zahthalterung, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation aufrechtzuerhalten, und positionieren das Tier in idealer Höhe, damit die Ohr- und Zahthalterungen des stereotaktischen Rahmens passen. Stellen Sie den stereotaktischen Rahmen 15 Minuten nach der Injektion der Mischung aus Dopaminhydrochlorid und Parlinehydrochlorid auf.

Platzieren Sie die Maus in eine geschlossene Anästhesiekammer. Betäuben Sie das Tier durch Inhalation von Isofluran. Das Tier ist ausreichend anästhesiert, wenn es nicht auf einen Reiz am Hinterbein reagiert und kein Augenreflex mehr vorhanden ist.

Rasieren Sie dann den Kopf der Maus. Platzieren Sie die Maus anschließend in den stereotaktischen Halter. Führen Sie die Eckzahnstange in ihren Mund ein und legen Sie eine Anästhesiemaske über ihr Gesicht.

Danach die Flussrate von Isofluran anpassen. Das topische Analgetikum Lidocain mithilfe von Watte direkt auf die Haut auftragen. Den Schneidezahnhalter und die Ohrbügel so einstellen, dass die Schädeloberseite horizontal ausgerichtet ist.

Desinfizieren Sie die Haut anschließend mit Betadine-Lösung. Danach setzen Sie die Ohrstifte ein. Die Ohrstifte sind korrekt eingesetzt, wenn der Kopf vollständig flach liegt und sich in keine Richtung mehr bewegen lässt.

Danach entlang der Mittellinie des Kopfes mit einer Skalpellklinge schneiden und die Haut zurückziehen. Die Oberfläche des Schädels mit einem Mulltupfer trocken tupfen. Den Kolben der Ein-Mikroliter-Spritze herunterdrücken und die Injektionsnadel mit 33 Gauge in die Ein-Milliliter-Röhrchen mit 15 Milligramm pro Milliliter einführen.

Sechs-Hydroxy-Dopamin-Lösung, abgedeckt mit Aluminiumfolie. Ziehen Sie den Kolben langsam zurück, während die Injektionsnadel mit 33 Gauge weiterhin in der Sechs-Hydroxy-Dopamin-Lösung eingetaucht bleibt. Bewegen Sie anschließend die Nadelspitze zur B bgma und geben Sie eine kleine Menge der Sechs-Hydroxy-Dopamin-Lösung ab, um eine kleine Perle zu bilden.

Danach senken Sie die Injektionsnadel langsam bis zur Foramen-Magendicula ab. Wenn die Perle das BGMA berührt, stoppen Sie das Vorschieben der Nadel und notieren Sie diese Koordinaten. Ziehen Sie die Injektionsnadel zwei Millimeter in dorsaler Richtung zurück und bewegen Sie sich entlang der Sagittalfuge in rostraler Richtung in Richtung Lambda.

Wenn sich die Spitze über Lambda befindet, geben Sie eine kleine Menge der Sechs-Hydroxy-Dopamin-Lösung aus der Injektionsnadel ab, um einen kleinen Tropfen zu bilden. Senken Sie dann die Nadelspitze langsam auf Lambda ab. Sobald der Tropfen Lambda berührt, stoppen Sie die Vorschubbewegung der Nadel und notieren Sie diese Koordinaten.

Die mediolateralen und dorsoventralen Koordinaten sollten für BMA und Lambda identisch sein. Falls dies nicht der Fall ist, passen Sie die Zahnhalterung entsprechend an. Für die anteroposterioren Koordinaten und die Ohrhalterungen für die mediolateralen Koordinaten bewegen Sie die Nadel zu den Injektionskoordinaten.

AP minus 1,2 Millimeter ml minus 1,1 Millimeter relativ zum Rema eine kleine Menge der Lösung aus der Injektionsnadel abgeben, um eine kleine Perle zu bilden. Die kleine Perle auf den Schädel absenken, um die Stelle zu markieren, an der das Loch gebohrt wird. Danach die Nadel zurückziehen und mit einer 25-Gauge-Nadel ein Loch in den Schädel bohren.

Bringen Sie die Injektionsnadel zu den Injektionskoordinaten zurück und führen Sie die Nadel fünf Millimeter in minus dorsovenstraler Richtung ein. Injizieren Sie anschließend 0,2 µL Sechs-Hydroxy-Dopamin oder Fahrzeuglösung einseitig in das mediale Vorderhirnbündel mit einer Geschwindigkeit von 0,1 µL pro Minute. Nach Abschluss der Gabe von Sechs-Hydroxy-Dopamin oder Fahrzeuglösung belassen Sie die Nadel weitere fünf Minuten an Ort und Stelle, um die Diffusion aus der Injektionsstelle zu ermöglichen.

Anschließend die Nadel langsam zurückziehen, die Kopfhautinzision mit drei Nähten verschließen und dann ein Milliliter Ringer-Laktat-Lösung subkutan verabreichen. Zum Schluss das Tier aus dem stereotaktischen Rahmen nehmen und in den Erholungskäfig stellen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. 15 bis 21 Tage nach der Sechs-Hydroxy-Dopamin-Läsionsoperation.

Wenn die durch das Neurotoxin verursachte Zellsterblichkeit ihren Höhepunkt erreicht hat, können spontane 360-Grad-Drehungen gemessen werden, um den Erfolg der Sechs-Hydroxydopamin-Läsion zu beurteilen. Bei dieser Verhaltensprüfung zeigen Mäuse mit einer durch Sechs-Hydroxydopamin hervorgerufenen Dopaminderpletion von mehr als 95 % signifikant mehr ipsiversale Drehungen als Mäuse mit einer partiellen Sechs-Hydroxydopamin-Läsion oder einer Scheinoperation. Durch die Korrelation der SAL-Dopaminspiegel mit dem Anteil an spontanen ipsiversalen Drehungen bei jedem Tier zeigt sich, dass Mäuse, die bei einer Sechs-Hydroxydopamin-Läsion 70 % oder mehr ipsiversale Drehungen aufwiesen, mehr als 95 % des SAL-Dopamins verloren hatten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine stereotaktische und perfusionsgesteuerte Sechs-Hydroxydopamin-Läsion bei Mäusen effektiv durchführt. Dies führt zu einer Dopaminderpletion von mehr als 95 %. Außerdem sollten Sie verstehen, wie man die Verhaltensbewertung von Parkinsonismus bei Mäusen durchführt.