Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

Dieses Video zeigt ein Verfahren, mit dem die Auswirkungen von reiner Belastung auf die bakterielle Adhäsion untersucht werden können. Während einer schweren Infektion mit einem bakteriellen Krankheitserreger wie z.B. Sirium mens gelangt der Erreger dort in den Blutkreislauf, er heftet sich an Wirtszellen und besiedelt sie, während sich unter mechanischer Belastung durch fließendes Blut nach der Proliferation einige Bakterien ablösen und neue Stellen besiedeln, und der Zyklus beginnt erneut, um Faktoren zu untersuchen, die die bakterielle Adhäsion an Wirtszellen beeinflussen. Endothelzellen werden in Einweg-Flusskammern und -Kulturen eingeführt, damit die Zellen den Zusammenfluss erreichen können.

Fluoreszierende Bakterien werden hinzugefügt und der schiere Stress wird experimentell kontrolliert. Mit einer Spritzenpumpe wird die Adhäsion der Bakterien an den Wirtszellen und die Proliferation mikroskopisch verfolgt. Die daraus resultierenden Videos werden analysiert, um den Einfluss von Scherspannungen auf den Prozess der Endothelbesiedlung zu bestimmen.

Dieses Verfahren kann sehr nützlich sein, um die Pathogenese der schönen Meningitis zu untersuchen, aber es kann auch für andere Bakterien verwendet werden, die während des gesamten Pathogeneseprozesses Scherbelastungen ausgesetzt sind. Diese Technik kann etwas knifflig sein, insbesondere wenn es darum geht, Blasen in das System einzuführen, was ein Problem sein kann. Heute wird es mega sein, das Verfahren zu demonstrieren, ein Doktorand, der in meinem Labor arbeitet.

Die in diesem Video beschriebenen Experimente werden mit Zellen durchgeführt, die in einem IDI-Mikroobjektträger six 0,4 kultiviert wurden, der aus einem sterilen Einweg-Kunststoffobjektträger mit sechs 17 Millimeter langen und 3,8 Millimeter breiten Kanälen besteht, die 0,4 Millimeter tief sind. Jeder Kanal verfügt über zwei Zugangsöffnungen mit Köderadaptern, einen an jedem Ende, um Uve-Zellen einzuführen und 30 Mikroliter einer einmal 10 auf die Sechs-Zellen-Suspension in jeden der Kanäle zu pipettieren. Lassen Sie die Zellen auf dem Objektträger drei Stunden lang bei 37 Grad und einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 haften.

Fügen Sie nach der Inkubation weitere 120 Mikroliter Endo-SFM hinzu. Um die Vertiefungen zu füllen, sollten die Zellen nach etwa 20 Stunden eine subkonfluente Monoschicht bilden. In der Zwischenzeit, Streak GFP exprimiert schöne Sirium-Meningitis auf APLs, das Bakterium ist ein menschlicher Krankheitserreger.

Daher sollte jede Manipulation dieses Mikroorganismus in einer Sicherheitseinrichtung der Stufe zwei mit geschultem Personal durchgeführt werden, das einen Kittel und Handschuhe trägt, und es wird empfohlen, das Personal gegen die verwendete Sero-Gruppe zu impfen. Hier ist die Sorte 8 0 1 3. Die Expression von GFP wird unter der Kontrolle eines IPDG-induzierbaren Promotorstreifens kultiviert.

Die Bakterien auf GC BPLs, die Kellogg-Nahrungsergänzungsmittel und fünf Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthalten, werden in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % CO2 für 16 Stunden behandelt. Sobald die Säugetierzellkulturen etabliert sind, werden Bakterien zu den Wirtszellen im Kanal hinzugefügt. Zur Vorbereitung des Flow-Assays werden die Bakterien mit einer Impfschlaufe aus der Petrischale entnommen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das eine vorwarme, ergänzte Endothelzellkultur enthält.

Medium Endo SFM. Die optische Dichte wird auf einen OD 600 von 0,05 eingestellt, indem die Probe im selben Medium auf ein Endvolumen von fünf Millilitern verdünnt wird. Um die GFP-Expression zu induzieren, geben Sie IPTG in eine Endkonzentration von einem Millimolar und inkubieren Sie die Kultur 120 Minuten lang.

In einem befeuchteten 37 Grad Celsius 5%CO2 Inkubator mit sanftem Schütteln. Platzieren Sie den Objektträger mit einer zuvor vorbereiteten kultivierten Endothelzelle auf dem Tisch eines inversen Mikroskops, das mit einer beheizten Plattform ausgestattet ist, um die Probentemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Gießen Sie vorwärmtes Endo-SFM, ergänzt mit 2%FBS, in einen sterilen Glaslautsprecher und füllen Sie die 50-Milliliter-Spritze, indem Sie am Kolben ziehen.

Der Einführungsschlauch ist mit einem Dreiwege-Absperrhahn verbunden. Befestigen Sie dann den Einführschlauch an der Spritze und drücken Sie den Kolben, um den Schlauch mit Medium zu füllen. Verbinden Sie das andere Ende des Einführungsschlauchs vorsichtig mit den mitgelieferten rechtwinkligen Verbindungsstücken mit der Mikrorutsche.

Vermeiden Sie das Einleiten von Luft in die Kammer. Setzen Sie die Spritze auf die Pumpe und legen Sie dann eine Schnittspritze von einem Milliliter auf den dafür vorgesehenen Schlitz am Absperrhahn als Reservoir. Befestigen Sie dann das Austrittsrohr am anderen Ende des Kanals und füllen Sie den Kanal vorsichtig mit Medium, indem Sie den Spritzenkolben in einem Abstand von etwa einem Zentimeter zum Kammerausgang drücken.

Messen Sie den bakteriellen OD 600 und stellen Sie ihn auf 0,15 ein und endo SFM mit 2 % FBS wie zuvor wirbeln Sie die Probe kräftig vor, um bakterielle Aggregate zu stören. Anschließend werden mit einer Einweg-Weidepipette aus Kunststoff 100 Mikroliter Endos fm, ergänzt mit 2% FBS-Medium, in das Reservoir übertragen. Aspirieren Sie dann 100 Mikroliter der bakteriellen Lösung von der Oberseite der Wirbellösung und geben Sie sie in das Reservoir.

Drehen Sie den Absperrhahn vorsichtig und injizieren Sie die Bakterien in die Kammer des Mikroobjektträgers, damit die Adhäsion bei kontrolliertem Scharspannungsniveau fortgesetzt werden kann. Führen Sie Endo SFM mit 2 % FBS mit der Spritzenpumpe 15 Minuten lang mit 3,5 Millilitern pro Stunde in die Kammer ein. Dieses Video wird 60-mal beschleunigt.

Die tatsächliche Dauer beträgt 10 Minuten. Nach diesem Schritt kann die Adhäsion und Ablösung von Bakterien an Wirtszellen unter verschiedenen Bedingungen beurteilt und in den folgenden Abschnitten des Videos beschrieben werden. Um die anfängliche Adhäsion einzelner Bakterien an Wirtszellen zu quantifizieren, beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern nach 15 Minuten Strömung, während die Flüssigkeit noch zirkuliert, und nehmen Sie Bilder von 10 zufälligen Feldern auf, um die mittlere Anzahl der adhärenten Bakterien pro abgebildetem Feld zu bestimmen.

Öffnen Sie zunächst die Image Day-Software und öffnen Sie das zu analysierende Bild. Klicken Sie zunächst auf das Bildmenü und wählen Sie aus. Passen Sie den Helligkeitskontrast an.

Optimieren Sie die Visualisierung einzelner anhaftender fluoreszierender Bakterien im Hintergrund, indem Sie die Intensitätsstufen durch Bewegen des Cursors anpassen. Analysieren Sie dann im Plugin das Menü Zellzähler. Öffnen Sie das Zellzähler-Werkzeug, initialisieren Sie das Bild, wählen Sie das Objekt aus, geben Sie es ein und klicken Sie auf jedes einzelne Bakterium.

Die Gesamtzahl der Bakterien wird im Fenster angezeigt. Exportieren Sie schließlich die Daten für jedes Bild, um sie zu übertreffen und zu mitteln, um die durchschnittliche Anzahl anhaftender Bakterien pro Feld zu quantifizieren und so den Widerstand einzelner anhaftender Bakterien gegen das Fließen zu messen. Nach den ersten 15 Minuten des Durchflussprogramms wird die Spritzenpumpe so eingerichtet, dass sie fünf Minuten lang eine Scherspannung von drei bis 100 Cent pro Quadratzentimeter erzeugt.

Stoppen Sie am Ende der fünf Minuten den Fluss und erfassen und analysieren Sie wie zuvor 10 zufällige Felder, um die mittlere Anzahl der verbleibenden Bakterien pro Feld zu bestimmen. Stellen Sie die Spritzenpumpe nach den ersten 15 Minuten des Durchflusses auf die gewählte Scherspannung ein. Lassen Sie es mehrere Stunden lang fließen und nehmen Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von einem Bild alle fünf Minuten auf.

Im Idealfall können mehrere Positionen eingehalten werden, wenn das Mikroskop mit einer motorisierten XY-Plattform ausgestattet ist. Stoppen Sie nach der Videomikroskopie den schieren Stress, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Erfassen Sie sofort zwei bis drei weitere Bilder und stoppen Sie dann die Bildaufnahmesequenz in der Software.

Ein Beispiel für die Vermehrung von Bakterien ist hier zu sehen. Um Bilder zu analysieren, verwenden Sie schließlich das Menü zum Anpassen des Bildschwellenwerts von Bild J, um die Bilder in binäre Bilder zu konvertieren. Wählen Sie dann im Menü "Analysieren" unter "Messung einstellen" die Bereichsmessung aus.

Verwenden Sie dann das Werkzeug Partikel analysieren, um die Größe der Kolonien automatisch zu bestimmen. Große Mikrokolonien bilden sich nach fünf bis sieben Stunden auf der Zelloberfläche, unabhängig davon, ob der Fluss an dieser Stelle aufrechterhalten wird oder nicht. Um den Fließwiderstand der Mikrokolonie zu messen, nehmen Sie zunächst zwei bis drei Bilder beider Zellen durch Phasenkontrast und Bakterien durch GFP-Fluoreszenz auf.

Wenden Sie fünf Minuten lang eine hohe Scherspannung an und nehmen Sie alle fünf Sekunden Fluoreszenzbilder mit einem Bild auf. Stoppen Sie die Scherspannung, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Erfassen Sie zwei bis drei zusätzliche Bilder und stoppen Sie dann die Bildaufnahmesequenz in der Software daneben, um das Medium für einen Plattierungsassay zu sammeln.

Entfernen Sie zuerst den Auslassschlauch und achten Sie darauf, dass der Kanal nicht entleert wird. Frisches Medium vorwärmen, um die Vertiefungen zu füllen. Entfernen Sie dann den Einführschlauch und sammeln Sie das restliche Medium mit einer Mikropipette und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Um das restliche Medium aus dem Kanal zu entfernen, spülen Sie den Mikroobjektträger zweimal aus, indem Sie 120 Mikroliter PBS in den Kanal geben.

Kippen Sie den Schieber zweimal und entsorgen Sie das Medium. Um die infizierten Zellen zu sammeln, geben Sie 50 Mikroliter Tripsin EDTA in den Mikroobjektträger und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad, um sie aus dem Kanal zu lösen, und mischen Sie diese abgelöste Probe mit einer im vorherigen Schritt gesammelten Suspension. Nach Durchführung der seriellen Verdünnung in PBS-Platten werden 10 Mikroliterfraktionen auf GCB-Agri-Platten aufgefüllt und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 dreifach inkubiert.

Am nächsten Tag bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten, um die bakterielle Ablösung von Mikrokolonien zu beurteilen. Infizieren Sie die Zellen in der Durchflusskammer wie zuvor bei einem niedrigen Durchfluss von 3,5 Millilitern pro Stunde nach 30 Minuten, entfernen Sie ungebundene Bakterien, indem Sie den Durchfluss für einen Zeitraum von zwei Minuten auf fünf Milliliter pro Minute erhöhen, und kehren Sie dann zu einem niedrigen Durchfluss von 3,5 Millilitern pro Stunde zurück und lassen Sie die Infektion zwei Stunden lang andauern. Sammeln Sie dann stündlich einen Tropfen Medium, das aus der Durchflusskammer austritt, in einem Mikrozentrifugenröhrchen für vier Stunden.

Sobald alle Proben entnommen wurden, bestimmen Sie wie zuvor die Anzahl der koloniebildenden Einheiten. Dabei handelt es sich um eine grafische Darstellung der anfänglichen Adhäsion von Bakterien auf der Zelloberfläche. Jede Linie im Diagramm stellt die kumulative Anzahl der in einem bestimmten Feld gebundenen Bakterien als Funktion der Zeit dar.

Die Werte für drei Felder sind angegeben, um eine Vorstellung von der Feld-zu-Feld-Variation zu geben, die nach der Proliferation auf der Zelloberfläche zu erwarten ist. Die mechanische Beständigkeit von Mikrokolonien wurde getestet, indem das Scherspannungsniveau auf 10 Dines pro Quadratzentimeter erhöht wurde, aber während Mikrokolonien vom Typ resistent sind, werden Mikrokolonien, die durch die Pill-V-Mutante gebildet werden, durch eine Erhöhung der Strömung gestört. Diese Mutante ist nicht in der Lage, den Umbau der Plasmamembran unter Mikrokolonien zu induzieren und ist daher empfindlicher gegenüber erhöhter Scherspannung nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für andere Forscher auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten, um die Auswirkungen von Scherbelastung auf die Interaktion verschiedener Krankheitserreger mit verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Maßnahmen der Stufe zwei oder drei ergriffen werden sollten.