Name: Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie Schubspannung die bakterielle Adhäsion an Endothelzellen beeinflusst. Diese Methode mit Flusskammern ermöglicht die Untersuchung von Infektionsmechanismen unter physiologischen Bedingungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Emilie Mairey und Emmanuel Donnadieu für die Ersteinrichtung des Verfahrens zu danken.

1. Menschlichen Wirtszelle und Bakterienkultur <ol><li> Kultur HUVECs zwischen Passage 1 und 9 bei 37 ° in einem befeuchteten Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. Passage der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz Ansatz mit Trypsin / EDTA bis zur Wartung Kulturen auf 75 cm 2 Kulturflaschen und experimentellen Kulturen in Einweg-Flow Kammern (μ-Slides VI) liefern. </li><li> Ziehen Medium aus den Flaschen zu passagiert werden, waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS, zurückzutreten und ersetzen Sie sie mit 1,5 ml Trypsin / EDTA. Lassen Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator für 5 Minuten lösen bei 37 ° C. </li><li> Sammeln Sie die Zellen mit 10 ml Zellkulturmedium in eine 15 ml-Collection-Tube. Pellet die Zellen mit einem 5 Minuten Zentrifugation (bei 200 g), bei Raumtemperatur. Die Zellen in 4 ml Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und zählen sie auf einem Malassez Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Einführung 30 ul einer 1x10 6 HUVEC Zellen pro ml Suspension in den Kanal (3x10 4 insgesamt) und damit die Zellen für 3 Stunden bei 37 haften ° in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% (v / v) CO 2. Fügen Sie ein zusätzliches Volumen von 120 ul Endo-SFM in die Vertiefungen füllen. Die Zellen sollten bilden eine subkonfluenten Monoschicht (Abbildung 2). </li><li> Wachsen Sie N. meningitidis, die GFP (in diesem Fall Stammes 8013, die GFP unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotor), auf GCB-Agarplatten mit Kellogg Ergänzungen und 5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2 für 16 Stunden. </li></ol> 2. Initial Haftung der einzelnen Bakterien an Wirtszellen <ol><li> Die Konzentration der Bakterien auf GCB Agarplatten zu einer OD600 von 0,05 gewachsen mit vorgewärmten Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und inkubieren für 120 Minuten bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2, unter leichtem Schütteln (130 rpm). Induce GFP-Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG in das Kulturmedium für die ganze Inkubationszeit. </li><li> Legen Sie die Einweg-μ-Slide auf der Bühne eines inversen Mikroskops mit einem beheizten Plattform, um die Temperatur der Probe bei 37 ° C zu halten ausgestattet </li><li> Gießen vorgewärmten Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS in ein steriles Becherglas und füllen eine sterile 50 ml Spritze mit diesem Medium. Bringen Sie die "Eingabe"-Schlauch auf die Spritze und füllen Sie durch die Einführung Medium. </li><li> Verbinden Sie den "Eintrag" Schlauch an den μ-Slide, mit Sorgfalt, um zu vermeiden, Einleiten von Luft in die Kammer. Dann füllen Sie das Anbringen der "exit" Rohr an das andere Ende und vorsichtig den Kanal mit mittleren bis ca. 1 cm Abstand von der Kammer "exit". </li><li> Messen Sie die bakterielle OD600 und passen auf 0,15 in Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS. Um an den einzelnen Bakterien aussehen, müssen alle Aggregate durch kräftiges Vortexen der bakteriellen Probe gestört werden. </li><li> Platz 100 ul der Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS-Medium in das Reservoir ergänzt und 100 ul der bakteriellen Lösung von der Oberseite des gevortext Lösung zu vermeiden, Probenahme alle verbleibenden bakteriellen Aggregaten genommen. </li><li> Sorgfältig stellen die 200 ul Volumen in den μ-Slide, indem Sie den Hahn, um die Bakterien in die Kammer zu injizieren. </li><li> Einführung Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit einer Schubspannung mit Adhäsion von 0,044 dyn / cm 2 für 15 Minuten. </li></ol> Siehe zum Beispiel Video-1 oder Abbildung 3 dargestellt. Nach diesem Schritt, entweder den § § 3, 4 oder 6 zu bewegen. 3. Die Quantifizierung der Anfangshaftung von einzelnen Bakterien an Wirtszellen <ol><li> Nach anfänglichen Haftung für die 15 Minuten, zu erwerben Bildern von zehn Feldern zufällig während Flüssigkeit immer noch im Umlauf ist. </li><li> Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit dem ImageJ-Software 8, um die mittlere Anzahl der adherant Bakterien pro Feld zuzugreifen. Dies geschieht wie folgt: Zunächst einmal, jedes Bild wird Schwellenwert mit dem "Threshold"-Fenster in der "Bild"-Menü auf einzelne haftende fluoreszierende Bakterien zu markieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrund aus den Zellen. Dann wird jedes einzelne Bakterium gezählt, mit dem Plug-In "Cell Counter" ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). Die Daten für jedes Bild in einer Excel-Tabelle angegeben und sind gemittelt, um die mittlere Anzahl der adhärenten Bakterien pro Feld zu quantifizieren. </li></ol> 4. Die Messung der Strömungswiderstand einzelner Bakterien Anhänger Wirtszellen <ol><li> Programm der Spritzenpumpe Set-up zu Schubspannung zwischen 3 bis 100 dyn / cm 2 für 5 Minuten zu generieren. </li><li> Am Ende der 5 Minuten zu erwerben zehn Felder zufällig gewählt, wie in Schritt 3.1 beschrieben, aber mit der Strömung gestoppt prior auf den Erwerb. </li><li> Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder wie in Schritt 3.2 beschrieben und quantifiziert die mittlere Anzahl der verbleibenden Bakterien pro Feld. </li></ol> 5. Die Messung des Wachstums eines isolierten Anhänger Bakterium zu einem Mikrokolonie <ol><li> Einführung Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit dem gewählten Schubspannung für mehrere Stunden. Bilder aufzeichnen für die Echtzeit-Video-Mikroskopie mit einem Bild alle 5 Minuten. </li><li> Nach Video-Mikroskopie, stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. Ein Beispiel der bakteriellen Vermehrung kann auf Video 2 zu sehen. </li></ol> 6. Die Messung der Strömungswiderstand von anhaftenden Bakterien Mikrokolonien <ol><li> Nach der Bildung der großen Mikrokolonien auf der Zelloberfläche (step5.2) erwerben 2-3 Bilder der beiden Zellen (durch Phasenkontrast) und Bakterien (durch GFP-Fluoreszenz), bevor flow Anwendung. Für den Rest des Experiments wird die Übernahme-Protokoll-Monitor nur die Fluoreszenz. </li><li> Die Anwendung hoher Scherspannung für 5 Minuten (300 bis 100 dyn / cm 2) und Aufnehmen von Bildern in einem Frame pro 5 Sekunden. </li><li> Stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. </li><li> Dann entfernen Sie den "exit"-Schlauch erste und sorgfältig zu vermeiden, das Leeren des Kanals und fügen Sie dann vorgewärmte frisches Medium in die Vertiefungen vor dem Entfernen der "entry"-Schlauch zu füllen. </li><li> Zur quantitativen Bestimmung der Wirkung von Schubspannung auf bakterielle Resistenz kann eine Beschichtung Test wie folgt durchgeführt werden: collect die übrigen mittel-und waschen Sie die μ-Slide zweimal mit 120 ul PBS, die verbleibenden Medium entfernt vom Kanal (beide Waschungen werden auch gesammelt). </li><li> Lösen Sie die infizierten Zellen mit der Zugabe von 50 ul von Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° und mischen dieses freistehende Probe mit der Suspension in den vorherigen Schritt gesammelt. </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen in PBS und Platte eine 10 ul Bruchteil auf GCB Agarplatten, in dreifacher Ausfertigung, um die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) auf den nächsten Tag zu bestimmen, nach der Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. </li></ol> Videos 3 und 4 vergleichen die Wildtyp-Stamm mit der pilV Mutante. 7. Bakterielle Loslösung von Mikrokolonien <ol><li> Zellen infizieren in der Strömungskammer durch Wiederholen der Schritte 2,1 bis 2,8 und damit die Infektion für 30 Minuten gehen. </li><li> Entfernen ungebundenen Bakterien durch zunehmenden Durchfluss bis 10 dyn / cm 2 für einen Zeitraum von 2 Minuten und lassen Infektion für 2h weiter. </li><li> Durchfluss reduzieren auf 0,15 dyn / cm 2. </li><li> Jede Stunde, sammeln ein Tropfen des Mediums, die aus dem Strömungsraum. </li><li> Führen Sie serielle Verdünnungen der Proben und die Platte sie auf GCB Agarplatten. </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag, nach Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Verschiedene Stufen eines zellulären Monoschicht, die beobachtet und gemessen werden kann in der Gegenwart fließen in das Verfahren. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Endothelial Zellmonolayer in der Strömungskammer am Anfang eines Experiments (ohne Scherbeanspruchung). Etwa 50 Endothelzellen sind in einem sub-Monolayer organisiert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Grafische Darstellung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der Zelloberfläche. Die Werte für die drei Felder sind angegeben, um eine Vorstellung von der Feld-zu-Feld-Variante, die zu erwarten (0044 dyn / cm 2) ist zu geben. Video 1. Visualisierung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der zellulären Monoschicht als eine Funktion der Zeit (0044 dyn / cm 2). GFP-exprimierenden Bakterien sind nach der Richtung des strömenden Mediums. Der Film beschleunigt wird 60-fache, ist die wirkliche Dauer des Videos 10 Minuten. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 2. Nach anfänglichen Haftung Bakterien durften auf der Zelloberfläche vermehren für einen Zeitraum von 7 Stunden (beschleunigte 1000-fach). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 3. Nach Proliferation auf der Zelloberfläche der Mechanikeral Widerstand von Mikrokolonien wurde durch eine Erhöhung der Schubspannung auf 10 Dyn / cm 2 für 5 Minuten, aber Wildtyp Mikrokolonien sind beständig beschleunigt 60-fach getestet. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a> Video 4. Mikrokolonien durch die pilV Mutanten gebildet werden von Durchfluss zu erhöhen (10 dyn / cm 2) gestört. Diese Mutante nicht die Umgestaltung der Plasmamembran unter Mikrokolonien induzieren und ist somit sehr empfindlich auf erhöhte Schubspannung (Video ist 60-fach beschleunigt) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.</a>

<ol><li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Bedeutung der Schubspannung und in der Regel von mechanischen Aspekte in der Biologie wird zunehmend anerkannt. Zum Beispiel die stark angepasst Hafteigenschaften der Selektin-Familie von Proteinen in den Prozess der Lymphozyten Haftung und rollt auf der Gefäßwand hat durch die Einführung von Schubspannung in den Prozess erkannt worden. Das oben beschriebene Verfahren wurde auf die Gram-negative Bakterien Neisseria meningitidis aufgebracht, sondern sollte auch für ein breites Spektrum von Krankheitserregern. Die Bedeutung der Schubspannung wurde auch für andere Krankheitserreger und andere Infektionen Seiten im Browser angezeigt. Bakterielle Adhäsion durch Schubspannung bedingt durch das Studium der FimH Adhäsin auf uropathogene Escherichia coli (UPEC) 9 gefunden beschrieben worden. Ähnlich wie Selektine, die Interaktion zwischen FimH und seine Host-Zell-Rezeptor wurde gezeigt, dass durch Scher-induzierte mechanische Kräfte 9 und die CFAE Adhäsin von enterotoxische E.coli gestärkt werden wurde auch die Haftung auf intestinalen Epithelzellen vermitteln über eine scherabhängige gemeldet Mechanismus 10. Wir berichteten, mit dem Laminar-Flow-Kammer-Assay-Protokoll in diesem Kapitel, dass Streptococcus agalactiae Pili essentiell für die Einhaltung dieses Erregers an Epithelzellen unter Strömungsbedingungen 11 wurden beschrieben. Solche Studien bestätigen, dass unsere Flusskammer Test ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Wirtszell-Pathogen-Interaktionen unter den Bedingungen der Schubspannung ist.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0,4 Flow Kit </td><td> Ibidi </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Spritze Plastipak 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tygon Schlauch R3603 3,2 x 4,8 mm </td><td> Fisher-Scientific </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn, 2 weibliche Luer zu männlichen Luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Spritzenpumpe </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Inverse Mikroskop Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse-T i </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD oder ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ-Software </td><td> NIH </td><td> Freeware ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing schubspannung in der studie der bakteriellen adhäsion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Während bakterielle Infektionen eine Folge von Wechselwirkungen zwischen Erreger und seinem Wirt. Bakterielle Adhäsion an der Zelloberfläche ist oft der erste und entscheidende Schritt der Pathogenese. Obwohl experimentell Haftung ist vor allem in statischen Bedingungen untersucht Haftung tatsächlich erfolgt in Anwesenheit von Flüssigkeit. Erste Begegnungen zwischen Bakterien und ihren Wirt oft an der Schleimhaut auf, Mund, Lunge, Darm, Auge, etc., wo Schleim fließt entlang der Oberfläche von Epithelzellen auftreten. Später in Infektion Erreger gelegentlich auf die Durchblutung verursacht lebensbedrohliche Krankheiten wie Blutvergiftung, Sepsis und Meningitis. Ein bestimmendes Merkmal dieser Infektionen ist die Fähigkeit dieser Erreger mit Endothelzellen in Anwesenheit von zirkulierenden Blut interagieren. Die Anwesenheit von strömenden Flüssigkeit, Schleim oder Blut zum Beispiel fest, Haftung, weil es eine mechanische Kraft auf den Erreger erzeugt. Zur Charakterisierung der Wirkung von strömenden Flüssigkeit man in der Regel bezieht sich auf den Begriff der Schubspannung, die Tangentialkraft pro Flächeneinheit durch eine Flüssigkeit bewegt in der Nähe einer stationären Wand, in dyn / cm 2 ausgedrückt ausgeübt wird. Die Intensitäten der Schubspannung variieren stark je nach den verschiedenen Schiffen Art, Größe, Orgel, Standort etc. (0-100 dyn / cm 2). Circulation in Kapillaren können sehr geringe Scherbeanspruchung Werte und auch nur vorübergehend während der Perioden zwischen wenigen Sekunden bis zu mehreren Minuten 1 zu stoppen. Am anderen Ende des Spektrums Schubspannung in Arteriolen können bis zu 100 dyn / cm 2 2. Die Auswirkungen der Schubspannung auf verschiedene biologische Prozesse wurde deutlich, wie zum Beispiel während der Interaktion von Leukozyten mit dem Endothel 3 gezeigt. Zur Berücksichtigung dieser mechanischen Parameter in den Prozess der bakteriellen Adhäsion nutzten wir ein experimentelles Verfahren auf die Verwendung einer Einweg-flow Kammer 4 auf. Wirtszellen werden in der Strömungskammer gewachsen und fluoreszierende Bakterien sind in der Strömung durch eine Spritzenpumpe kontrolliert eingeführt. Wir haben uns zunächst konzentrieren unsere Untersuchungen auf die bakterielle Erreger Neisseria meningitidis, ein Gram-negative Bakterium verantwortlich für Sepsis und Meningitis. Das hier beschriebene Verfahren erlaubt es uns, die Auswirkungen der Schubspannung auf die Fähigkeit der Bakterien zur Studie: haften die Zellen 1, um die Zelle Oberfläche 5 vermehren und zu lösen, um neue Standorte 6 (Abb. 1) zu besiedeln. Ergänzende technische Informationen finden Sie in Hinweis 7 zu entnehmen. Schubspannung Werte hier vorgestellten wurden auf der Grundlage unserer bisherigen Erfahrungen 1 und die Werte in der Literatur gefunden repräsentieren gewählt. Das Protokoll sollte für eine breite Palette von Erregern mit speziellen Anpassungen je nach Zielsetzung der Studie.

Während der Infektion Prozess ist ein wichtiger Schritt der Adhäsion der Erreger mit Wirtszellen. In den meisten Fällen diese Haftung Schritt erfolgt in Gegenwart von mechanischer Beanspruchung durch fließende Flüssigkeit erzeugt. Wir beschreiben eine Technik, die Schubspannung führt als ein wichtiger Parameter bei der Untersuchung der bakteriellen Adhäsion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

Bei bakteriellen Infektionen kommt es zu einer Sequenz von Interaktionen zwischen dem Pathogen und seinem Wirt. Die bakterielle Adhäsion an der Oberfläche der Wirtszelle ist häufig der ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Untersuchung der Auswirkungen von Scherkräften auf die bakterielle Adhäsion. Bei einer schweren Infektion mit einem bakteriellen Pathogen wie *Neisseria meningitidis* gelangt der Erreger in den Blutstrom, wo er unter mechanischer Belastung durch den strömenden Blutfluss an Wirtszellen bindet und diese kolonisiert. Nach der Proliferation lösen sich einige Bakterien ab, kolonisieren neue Stellen, und der Zyklus beginnt erneut. Um Faktoren zu untersuchen, die die bakterielle Adhäsion an Wirtszellen beeinflussen, werden Endothelzellen in Einweg-Flusskammern eingebracht und kultiviert, bis sie Konfluenz erreichen.Fluoreszierende Bakterien werden hinzugefügt und die Scherbelastung wird experimentell gesteuert. Mithilfe einer Spritzenpumpe wird die Adhäsion der Bakterien an Wirtszellen sowie deren Proliferation mikroskopisch verfolgt. Die entstehenden Videos werden analysiert, um den Einfluss der Scherbelastung auf den Kolonisationsprozess des Endothels zu bestimmen.Dieses Verfahren kann sehr nützlich sein, um die Pathogenese der Meningitis zu untersuchen, es kann jedoch auch für andere Bakterien verwendet werden, die während des Pathogenese-Prozesses Scherkräften ausgesetzt sind. Diese Technik kann insbesondere beim Einführen von Blasen in das System etwas schwierig sein, was ein Problem darstellen kann. Heute wird das Verfahren Mega demonstrieren, eine Doktorandin in meinem Labor.Die in diesem Video beschriebenen Experimente werden mit Zellen durchgeführt, die in einer IDI-Mikroschlittenkammer mit sechs 0,4 mm tiefen Kanälen kultiviert werden. Diese Einweg-Sterilplastikschlitten enthalten sechs Kanäle, die jeweils 17 Millimeter lang, 3,8 Millimeter breit und 0,4 Millimeter tief sind. Jeder Kanal verfügt über zwei Zugangsöffnungen mit Luer-Adaptern an beiden Enden, um UVE-Zellen einzubringen. Pipettieren Sie 30 Mikroliter einer Zellsuspension mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen in jeden der Kanäle auf dem Objektträger. Lassen Sie die Zellen anschließend drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und einer Atmosphäre mit 5 % CO₂ andocken.Nach der Inkubation weitere 120 Mikroliter Endo-SFM hinzufügen. Die Zellen sollten nach etwa 20 Stunden eine subkonfluente Monoschicht bilden, um die Vertiefungen auszufüllen. In der Zwischenzeit GFP-exprimierende Nice Sirium Meningitis auf APLs ausstreichen; der Bakterienstamm ist ein humaner Pathogen.Daher sollte jede Manipulation dieses Mikroorganismus in einer Sicherheitsstufe zwei durchgeführten Einrichtung von geschultem Personal unter Tragen eines Kittels und Handschuhe vorgenommen werden; eine Impfung des Personals gegen die verwendete Serogruppe wird empfohlen. Hier ist der Stamm 8 0 1 3, der GFP unter der Kontrolle eines IPDG-induzierbaren Promotors ausdrückt, in Streifen kultiviert.Die Bakterien auf GC-BPLs mit Kellogg-Zusätzen und fünf Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol werden 16 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert. Sobald die Säugerzellkulturen etabliert sind, werden Bakterien den Wirtszellen im Kanal zugegeben. Zur Vorbereitung des Durchflussassays werden mithilfe eines Inokulationsrings die Bakterien aus der Petrischale entnommen und in ein 50-Milliliter-Kegelrohr mit vorgewärmtem, ergänztem Endothelzellkulturmedium überführt.Medium Endo SFM. Stellen Sie die optische Dichte durch Verdünnung der Probe im gleichen Medium auf einen OD 600 von 0,05 ein, wobei ein Endvolumen von fünf Millilitern erreicht werden soll. Um die GFP-Expression zu induzieren, geben Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzu und inkubieren die Kultur 120 Minuten lang.In einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 unter sanfter Schüttelung. Stellen Sie die Mikrokammer mit zuvor kultivierten endothelialen Zellen auf die Probebühne eines umgekehrten Mikroskops, das mit einer beheizten Plattform ausgestattet ist, um die Probentemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten. Geben Sie vorgewärmtes Endo-SFM, ergänzt mit 2% FBS, in einen sterilen Glasbehälter und füllen Sie die 50-Milliliter-Spritze, indem Sie den Kolben ziehen.Das Zulaufrohr wird mit einem Dreifach-Hahn verbunden. Anschließend wird das Zulaufrohr an die Spritze angeschlossen und der Kolben gedrückt, um das Rohr mit Medium zu füllen. Das andere Ende des Zulaufrohrs wird vorsichtig unter Verwendung der beigefügten rechtwinkligen Anschlüsse mit dem Objektträger verbunden. Vermeiden Sie es, Luft in die Kammer einzubringen. Setzen Sie die Spritze auf die Pumpe und platzieren Sie eine abgeschnittene Ein-Milliliter-Spritze in dem verfügbaren Anschluss des Hähns als Reservoir. Befestigen Sie anschließend das Auslassrohr am anderen Ende des Kanals und füllen Sie den Kanal vorsichtig mit Medium, indem Sie den Spritzenkolben soweit betätigen, bis das Medium etwa einen Zentimeter vom Auslass der Kammer entfernt ist.Messen Sie den bakteriellen OD 600 und stellen Sie ihn auf 0,15 ein, wobei Sie SFM mit 2 % FBS wie zuvor verwenden und die Probe kräftig verwirbeln, um bakterielle Aggregate aufzubrechen. Übertragen Sie anschließend mithilfe einer Einweg-Plastikpipette 100 Mikroliter Endos FM, ergänzt mit Medium mit 2 % FBS, in das Reservoir. Saugen Sie dann 100 Mikroliter der Bakterienlösung von der Oberfläche der verwirbelten Lösung ab und geben Sie sie zum Reservoir hinzu.Drehen Sie den Hahn vorsichtig und injizieren Sie die Bakterien in die Kammer des Mikro-Objektträgers, um die Adhäsion unter kontrollierten Scherkräften zu ermöglichen. Führen Sie endo-SFM, das 2 % FBS enthält, mithilfe der Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von 3,5 Millilitern pro Stunde für 15 Minuten in die Kammer ein. Dieses Video ist um das 60-fache beschleunigt.Die eigentliche Dauer beträgt 10 Minuten. Nach diesem Schritt kann die Adhäsion und Detachierung von Bakterien an Wirtszellen unter verschiedenen Bedingungen bewertet werden, wie in den folgenden Abschnitten des Videos beschrieben. Um die anfängliche Adhäsion einzelner Bakterien an Wirtszellen zu quantifizieren, beginnen Sie mit der Bildaufnahme nach 15 Minuten Fluss, während die Flüssigkeit weiter zirkuliert, und nehmen Sie Bilder von 10 zufälligen Feldern auf, um die mittlere Anzahl adhärenter Bakterien pro Bildfeld zu bestimmen.Öffnen Sie zunächst die Image-Day-Software und laden Sie das zu analysierende Bild. Klicken Sie dazu auf das Bildmenü und wählen Sie „Helligkeit-Kontrast anpassen“.Optimieren Sie die Visualisierung einzelner haftender fluoreszierender Bakterien vor dem Hintergrund, indem Sie die Intensitätseinstellungen durch Verschieben des Cursors anpassen. Gehen Sie dann im Plugin zum Menü Zellzähler. Öffnen Sie das Zellzähler-Tool, initialisieren Sie das Bild, wählen Sie das Objekttyp aus und klicken Sie auf jedes einzelne Bakterium.Die Gesamtanzahl der Bakterien erscheint im Fenster. Exportieren Sie abschließend die Daten für jedes Bild in Excel und bilden Sie den Mittelwert, um die durchschnittliche Anzahl der anhaftenden Bakterien pro Feld zu quantifizieren und so den Widerstand einzelner anhaftender Bakterien gegenüber Strömung zu messen. Nach den anfänglichen 15 Minuten des Flussprogramms wird die Spritzenpumpe so eingestellt, dass sie fünf Minuten lang eine Scherspannung im Bereich von drei bis 100 Dimes pro Quadratzentimeter erzeugt.Am Ende der fünf Minuten beenden Sie den Durchfluss und erfassen und analysieren 10 zufällige Felder wie zuvor, um die mittlere Anzahl verbliebener Bakterien pro Feld zu bestimmen. Nach den anfänglichen 15 Minuten Durchfluss stellen Sie die Spritzenpumpe auf die gewählte Scherspannung ein. Lassen Sie den Durchfluss mehrere Stunden lang andauern und nehmen Sie dabei Bilder mit einer Rate von einem Bild alle fünf Minuten auf.Im Idealfall können mehrere Positionen verfolgt werden, wenn das Mikroskop mit einer motorisierten XY-Plattform ausgestattet ist. Beenden Sie nach der Video-Mikroskopie die Scherbelastung, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Nehmen Sie sofort zwei bis drei weitere Bilder auf und beenden Sie anschließend die Bildakquisitionsequenz in der Software.Ein Beispiel für bakterielles Wachstum ist hier zu sehen. Zum Abschluss verwenden Sie im Programm ImageJ das Menü „Bild anpassen – Schwellenwert“, um die Bilder in Binärbilder umzuwandeln. Wählen Sie dann im Menü „Analysieren“ unter „Messung einstellen“ die Flächenmessung aus.Verwenden Sie anschließend das Partikelanalysewerkzeug, um die Größe der Kolonien automatisch zu bestimmen. Große Mikrokolonien bilden sich fünf bis sieben Stunden nach der Inokulation auf der Zelloberfläche, unabhängig davon, ob der Durchfluss zu diesem Zeitpunkt aufrechterhalten wird. Um den Widerstand der Mikrokolonien gegenüber dem Durchfluss zu messen, nehmen Sie zunächst zwei bis drei Bilder beider Zellen mittels Phasenkontrast und der Bakterien mittels GFP-Fluoreszenz auf.Wenden Sie fünf Minuten lang hohen Scherstress an und nehmen Sie dabei alle fünf Sekunden ein Fluoreszenzbild auf. Beenden Sie den Scherstress, indem Sie die Spritzenpumpe ausschalten. Nehmen Sie zwei bis drei weitere Bilder auf und beenden Sie dann die Bildaufnahmesequenz in der Software, um anschließend das Medium für einen Plating-Assay zu sammeln.Entfernen Sie zuerst das Auslassrohr, wobei darauf geachtet werden muss, dass der Kanal nicht entleert wird. Geben Sie vorgewärmtes frisches Medium hinzu, um die Vertiefungen zu füllen. Entfernen Sie anschließend das Einlassrohr und sammeln Sie das verbleibende Medium mit einer Mikropipette, um es in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Um jegliches verbleibende Medium aus dem Kanal zu entfernen, spülen Sie den Mikro-Objektträger zweimal durch Zugabe von jeweils 120 Mikrolitern PBS in den Kanal.Zweimaliges Kippen des Objektträgers und Entsorgen des Mediums. Zum Sammeln der infizierten Zellen 50 Mikroliter Trypsin-EDTA zum Mikroobjektträger geben und fünf Minuten bei 37 Grad inkubieren, um die Zellen vom Kanal zu lösen, und die abgelöste Probe mit einer in der vorherigen Stufe gesammelten Suspension vermischen. Nach Durchführung einer seriellen Verdünnung in PBS 10-Mikroliter-Portionen auf GCB-Agarplatten übertragen und im Anschluss tripelverdünnt bei 37 Grad Celsius und 5 % CO₂ über Nacht inkubieren.Am nächsten Tag die Anzahl der koloniebildenden Einheiten bestimmen, um die Abtrennung von Bakterien von Mikrokolonien zu beurteilen. Die Zellen in der Durchflusskammer wie zuvor bei niedrigem Durchfluss von 3,5 Millilitern pro Stunde infizieren; nach 30 Minuten nicht gebundene Bakterien entfernen, indem der Durchfluss für einen Zeitraum von zwei Minuten auf fünf Milliliter pro Minute erhöht wird, anschließend zum niedrigen Durchfluss von 3,5 Millilitern pro Stunde zurückkehren und die Infektion zwei Stunden lang fortsetzen. Danach jede Stunde einen Tropfen Medium, der aus der Durchflusskammer austritt, in einem Mikrozentrifugenröhrchen über einen Zeitraum von vier Stunden sammeln.Nachdem alle Proben gesammelt wurden, bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten wie zuvor. Dies ist eine grafische Darstellung der anfänglichen Adhäsion von Bakterien an der Zelloberfläche. Jede Linie im Diagramm stellt die kumulative Anzahl der gebundenen Bakterien in einem bestimmten Feld als Funktion der Zeit dar.Werte für drei Felder werden angegeben, um einen Eindruck von der erwarteten Feld-zu-Feld-Variation nach der Proliferation auf der Zelloberfläche zu vermitteln. Der mechanische Widerstand von Mikrokolonien wurde getestet, indem die Scherspannung auf 10 Dine pro Quadratzentimeter erhöht wurde; während Typ-Mikrokolonien resistent sind, werden Mikrokolonien, die durch den Pill-V-Mutanten gebildet werden, durch die erhöhte Strömung gestört. Dieser Mutant versagt darin, die Umgestaltung der Plasmamembran unter Mikrokolonien zu induzieren, und ist daher nach seiner Entwicklung empfindlicher gegenüber erhöhter Scherspannung.Diese Technik ebnete anderen Forschern auf dem Gebiet der Infektionskrankheiten den Weg, um die Auswirkungen von Scherkräften auf die Interaktion verschiedener Krankheitserreger mit unterschiedlichen Zelltypen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit humanen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und stets entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, wie beispielsweise Sicherheitsstufe-2- oder -3-Maßnahmen, während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

introducing-shear-stress-in-the-study-of-bacterial-adhesion

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Ditkowski, B., et al. Ein in-vitro-Modell eines Parallelplatten-Perfusionssystems zur Untersuchung der bakteriellen Haftung an Transplantatgeweben. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert die Methode, eine Parallelplatten-Flusskammer zu verwenden, um fluoreszenzmarkierte Bakterien über vaskuläres Transplantatgewebe zu perfundieren, was eine kontrollierte Analyse der bakteriellen Adhäsion und der frühen Pathogenese unter Scherflussbedingungen ermöglicht.

In-vitro-Parallelplatten-Flussmodell zur Untersuchung der bakteriellen Adhäsion an einer Gewebebiopsie

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Um die Interaktion von Bakterien mit den Blutgefäßen unter Scherspannung zu untersuchen, werden eine Strömungskammer und ein in vivo mesenteriales Intravitalmikroskopie-Modell beschrieben, die es ermöglichen, die bakteriellen und Wirtsfaktoren zu entschlüsseln, die zur Gefäßadhäsion beitragen.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist ein wichtiger Schritt während der Besiedlung und Infektion des Wirts. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von polymergekoppelten rekombinanten Adhäsinen als biomimetische Materialien, die es ermöglichen, den Beitrag einzelner Adhäsine zu diesen Prozessen unabhängig von anderen bakteriellen Faktoren zu analysieren.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Hier beschreiben wir die Verwendung eines höheren Durchsatz mikrofluidischen Bioreaktors gepaart mit einem fluoreszierenden Mikroskop für die Analyse der Schubspannung Auswirkungen auf Pseudomonas Aeruginosa Biofilms grün fluoreszierende Proteine, einschließlich Instrument zum Ausdruck zu bringen eingerichtet, die Bestimmung der Biofilm Abdeckung, Wachstumsrate und morphologischen Eigenschaften.

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

Diese Methode ist nützlich, um die frühe Dynamik der zellulären Adhäsion und die Ausbreitung von verankerungsabhängigen Zellen auf das Fibronectin zu quantifizieren. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Redoxhomöostase auf die Zellausbreitung und/oder zellspezifische intrazelluläre Signalwege zu untersuchen.

Untersuchung der Dynamik der zellulären Adhäsion und Ausbreitung von Epithelzellen auf Fibronectin während oxidativen Stresses

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Erfahren Sie, wie Schubspannung die bakterielle Adhäsion an Endothelzellen beeinflusst. Diese Methode mit Flusskammern ermöglicht die Untersuchung von Infektionsmechanismen unter physiologischen Bedingungen.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

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