In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Dieses Verfahren ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung von Ran- und Glühwürmchen-Luciferase. Bei der Entwicklung von orthotopen Tumoren in vivo beginnt man mit der Konstruktion stabiler Zelllinien, die entweder Ran-Vanille- oder Glühwürmchen-Luciferase oder beide exprimieren. Anschließend wird die funktionelle Regulation des stabil exprimierten Reporterkonstrukts in vitro überprüft.

Der nächste Schritt besteht darin, Zellen auf das Brustfettgewebe zu transplantieren und sowohl Ran- als auch Feuerfliegen-Luciferase-Signale zu erfassen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie liegt darin, dass sie eine longitudinale und dynamische Sicht auf die Genregulation in vivo während der Tumorentwicklung und Metastasierung ermöglicht. Beginnen Sie damit, vier T1-Gedächtnis-Karzinomzellen mit einem Expressionsvektor, der Vanilla-Luciferase kodiert, zu transfectieren.

Transfizieren Sie unter optimierter antibiotischer Konzentration für mehrere Tage. Wählen Sie anschließend etwa 10 einzelne Kolonien, die Ran-Vanille-Luciferase exprimieren, aus, um den Expressionsgrad zu überwachen. Amplifizieren Sie weiterhin die Kolonien, die hohe Mengen an Ran-Vanille-Luciferase exprimieren, für funktionelle Analysen.

Klonieren Sie den Promotorbereich der gewünschten Region in ein PGL4-Luciferase-Reporterplasmid, das einen selektierbaren Marker trägt, der sich von dem zur Selektion der stabilen Vanille-Expression verwendeten unterscheidet; transfizieren Sie die malignen Zellen und selektieren Sie eine stabile polyklonale Population von Feuerlysen-Luciferase mittels traditioneller in-vitro-Zell-basierter Luciferase-Reportergen-Assays in 96-Well-Platten. Überprüfen Sie, ob die DBR-Zellen die Expression der Feuerlysen-Luciferase in einer Weise regulieren, die mit der in vorübergehend transfizierten Elternzellen beobachteten übereinstimmt. Bringen Sie die Zellen mit diesen Vektoren für 15 Minuten auf einen Rüttelapparat, um die Zellen zu lysieren.

Überprüfen Sie außerdem, ob die durch CMV angetriebene Expression von Vanilla durch verschiedene Zellstimulationen oder Behandlungsbedingungen reguliert wird. Vermehren Sie die DBR-metastatischen F41-Gedächtnis-Karzinomzellen mit niedriger Konfluenz am Tag vor der geplanten In-vivo-Inokulation. Für die Inokulation werden die F41-Zellen durch Trypsin abgelöst.

Gründlich in Wachstumsmedium waschen und die Zellen sofort in PBS verdünnen. Auf Eis lagern. Vier bis sechs Wochen alte weibliche Bowel-C-Mäuse mit Isofluran anästhesieren.

Mit einer Pinzette das vierte inguinale Gedächtnisfettgewebe vorsichtig greifen und anheben. Vorsichtig eine Nadel mit 27,5 Gauge (Schrägschliff nach oben) einführen und direkt unter der Brustwarze in das Fettgewebe injizieren.

Unter besonderer Vorsicht darauf achten, die Nadel nicht in die Bauchhöhle vorzuschieben. Die Drüse freigeben und langsam 50 µL der Zellsuspension in das Milchfettgewebe injizieren, während die Mäuse noch anästhesiert sind. 100 µL rotes Ejectinjektionsmittel in die seitliche Schwanzvene injizieren.

Platzieren Sie die Maus unmittelbar in das IVUS 200-Bildgebungssystem und nehmen Sie ein eine Minute dauerndes Lumin-Zent-Bild auf. Überführen Sie die Maus für etwa eine Stunde zurück in ihren Käfig, um sicherzustellen, dass jegliches verbleibende Ran-Vanilla-Lucifer-Signal abgeklungen ist. Verabreichen Sie nun D-Lucifer-Kaliumsalz mittels i.p.-Injektion nach fünf Minuten und betäuben Sie die Maus mit Isofluran.

Übertragung auf das IVUS 200 in einer vergleichbaren Position erfolgt bei der ursprünglichen RAN-Vanilla-Bilddatenaufnahme. Verwenden Sie die IVUS-Live-Bild-Software im Photonenmodus. Ermitteln Sie die Werte sowohl für die Firefly- als auch für die Standardaufnahmen.

Die hochaggressiven 41-Zellen bilden innerhalb einer Woche tastbare Tumoren. Injizieren Sie die Mäuse daher wöchentlich mit rotem Eject-Cine, um das allgemeine Tumorwachstum und die Metastasierung zu überwachen. Anschließend injizieren Sie d-Lucifer, um die wegweisspezifische Signalübertragung während verschiedener Stadien der Tumorentwicklung zu verfolgen.

Verfolgen Sie das Wachstum des Primärtumors, indem Sie die RAN-Luciferase-Messungen auf die ersten Werte zum Zeitpunkt der Tumorzellinokulation normalisieren. Noch wichtiger ist die Berechnung der RLR-Werte über die Zeit, um die zeitliche Regulation einzelner Signalwege im Verhältnis zum Tumorwachstum und -fortschritt zu bestimmen. Vergleichen Sie nun die pulmonalen RLR-Werte mit denen des Primärtumors, um die räumliche Regulation einzelner Signalwege im Verhältnis zum Tumorwachstum und zur Metastasierung zu ermitteln.

Doppelte biolumineszente Bilder werden verwendet, um Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung innerhalb des Primärtumors sichtbar zu machen und zu verfolgen. Mischen Sie zunächst vier T-eins-Zellen, die gemischte Vanille-Luciferase exprimieren, mit ihren nicht metastasierenden und isogenen Feuerfliegen-Luciferase-exprimierenden vier T-oh-sieben-Gegenstücken, und injizieren Sie anschließend unterschiedliche Verhältnisse dieser gemischten Brustkrebszellpopulationen in das Brustfettgewebe, wie zuvor gezeigt. Erstellen Sie unmittelbar danach sowohl Feuerfliegen- als auch Vanille-Luciferase-Bilder, um den anfänglichen RS-Wert zu bestimmen, der für ein gegebenes inoculiertes Zellgemisch repräsentativ ist.

Setzen Sie die Aufnahme longitudinaler, dualer biolumineszenter Bilder fort, um die zelluläre Zusammensetzung innerhalb des Primärtumors darzustellen. Bewerten Sie außerdem die räumlich-zeitliche Metastasierung jedes Brustkrebsderivats im Verhältnis zum Tumorwachstum und -fortschreiten. Da jedes Bild intern konsistent und kontrolliert ist, stellt das anhaltende Signal des Primärtumors eine wichtige Metrik zur Beurteilung des gesamten Nachfolgeversagens jeder Vanille- und Feuerfliegen-Datenaufnahme dar.

Das Linin-Substrat ist stark oxidationsanfällig, was zu Autolumineszenz führt. Hier erzeugt eine fehlgeschlagene intravenöse Injektion von Lanin ein unspezifisches Signal aus dem Darmtrakt, nicht aus dem etablierten Primärtumor. Bei dieser erfolgreichen Nierenaufnahme einer Maus mit 41 Primärtumoren und pulmonalen Metastasen können pathwayspezifische Signalisierungsmessungen aus der Bildgebung von Glühwürmchen-Luciferase abgeleitet werden.

Mithilfe dieser Daten lässt sich der RS sowohl aus dem Primärtumor als auch aus dessen pulmonalen Metastasen berechnen. Nach Abschluss dieses Experiments können weitere Techniken wie die Immunhistochemie und die In-situ-Hybridisierung verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Regulation auf mRNA- und Proteinebene in ähnlicher Weise erfolgt wie bei dem berichteten Konstrukt.