Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung biologischer Proben für das Schneiden und Abbilden am Knife-Edge-Scanning-Mikroskop (KESM) sowie die Visualisierung der resultierenden Bilddatenstapel zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst fixiert, gefärbt und eingebettet wird, um es für die Bildgebung am KESM vorzubereiten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das KESM zu konfigurieren und das Schneiden sowie die Bildaufnahme mithilfe der automatisierten Steuerungssoftware durchzuführen.

Die resultierenden Bilder werden anschließend entrauscht, registriert und zugeschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Datensätze in einem webbasierten Atlas und einer 3D-Visualisierungssoftware zu laden und zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die neuronale und vaskuläre Organisation auf Ganzhirnebene mit submikrometerlicher Auflösung zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Mesos wie der seriellen blockbasierten Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, dass sie deutlich größere Volumina abbilden kann, wenn auch mit geringerer Auflösung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Connectomik und der Neurowissenschaften im Allgemeinen zu beantworten. Sie kann Einblicke in die strukturelle Organisation des Gehirns liefern und lässt sich zudem auf andere Organsysteme wie Lunge und Niere anwenden.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird das präparierte Maushirn in ein Glasgefäß mit Golgi-Cox-Lösung gegeben. Das Glasgefäß wird für 10 bis 16 Wochen bei Raumtemperatur in eine lichtundurchlässige Box gestellt. Ein separater Fixierungsschritt ist nicht erforderlich, da die Golgi-Cox-Lösung bereits fixierend wirkt.

Nach 10 bis 16 Wochen spülen Sie das Gehirn am folgenden Tag über Nacht im Dunkeln mit entionisiertem Wasser aus, tauchen Sie das ausgespülte Gehirn anschließend 7 bis 10 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur in eine 5 %ige Ammoniumhydroxidlösung in entionisiertem Wasser ein. Nach 7 bis 10 Tagen spülen Sie das Gehirn erneut 4 Stunden bei Raumtemperatur mit entionisiertem Wasser aus. Danach dehydrieren Sie das Gehirn durch eine aufsteigende Reihe von Ethylalkohollösungen, wobei es jeweils 24 Stunden in jeder Lösung verbleibt: 50 % Ethanol und 70 % Ethanol bei vier Grad Celsius sowie 85 % Ethanol.

Drei Wechsel mit 95 % Ethanol und vier bis fünf Wechsel mit 100 % Ethanol bei Raumtemperatur. Danach das dehydrierte Gehirn in Aceton geben und drei bis vier Wechsel über jeweils einen Tag durchführen. Anschließend das Gehirn über Nacht im Kühlschrank in jeder dieser Aite-Aceton-Mischungen mit einem Aite-zu-Aceton-Verhältnis von eins zu zwei, eins zu eins und zwei zu eins lagern.

Legen Sie das Gehirn schließlich in 100 % Aite in den Kühlschrank und wechseln Sie die Lösung dreimal, jedes Mal über Nacht. Das behandelte Gehirn wird dann in 100 % Aite eingebettet und drei Tage lang auf 60 Grad Celsius erhitzt. Abschließend wird der ausgehärtete Präparatblock mit Epoxidharz auf dem metallenen Präparatring befestigt, und die Seiten des Blocks werden bei Bedarf abgeschliffen, um dieses Verfahren zu beginnen.

Überprüfen Sie, ob die Maus tief anästhesiert ist und nicht auf einen Zehenquetschreiz reagiert. Anschließend perfundieren Sie die Maus transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, gefolgt von kalter 4 % phosphatgepufferter Parafomaldehydlösung. Danach perfundieren Sie die Maus mit einer Lösung von 0,1 % Thidye in entionisiertem Wasser.

Anschließend den Körper 24 Stunden lang in einen Kühlschrank mit vier Grad Celsius stellen. Nach 24 Stunden das Gehirn aus dem Schädel entfernen und in eine frische Lösung von 0,1 % Thionin geben. Das Gehirn sieben Tage lang bei vier Grad Celsius belassen.

Nach sieben Tagen das Gehirn entnehmen und durch eine aufsteigende Reihe von Ethylalkoholen dehydrieren. Über einen Zeitraum von sechs Wochen: drei bis fünf Tage in 50%igem Ethanol, sieben bis zehn Tage in 70%igem Ethanol, jeweils etwa zwei Wochen in 85%igem und 95%igem Ethanol und den Rest der Zeit in 100%igem Ethanol. Nach drei Wechseln von Aceton bei Raumtemperatur wird das Gehirn in Erudit-Kunststoff in einem Ofen bei 60 Grad Celsius eingebettet.

Um mit dem Verfahren zur Färbung des vaskulären Netzwerks mit Tusche zu beginnen, überprüfen Sie, ob die Maus tief anästhesiert ist, indem Sie das Fehlen des Zehenreflexes feststellen. Anschließend perfundieren Sie die Maus transkordial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, gefolgt von 10 % neutralgepufferter Formalinlösung bei Raumtemperatur. Eine Ganzkörperperfusion mit Kochsalzlösung und Fixansmittel ist notwendig, um das Blut aus dem kardiovaskulären System zu entfernen und die Gewebe zu fixieren.

Anschließend wird die Maus mit 3,0 ccm unverdünnter Indiantinte perfundiert. Mit Indiantinte ist es notwendig, das Gefäßsystem des Herz-Kreislauf-Systems vollständig zu füllen. Nach der Entnahme aus der Maus wird das resultierende Gehirn durch eine Reihe von stufenweise konzentrierten Ethylalkoholen dehydriert und anschließend in Epoxidharz eingebettet.

Nachdem das zuvor gezeigte Protokoll zur Einrichtung des KESM für die Bildgebung befolgt wurde, schalten Sie die Kamera, die Beleuchtung und den Objekttisch ein und heben Sie das Messer sowie das Objektiv an. Installieren Sie anschließend den Probenträger. Senken Sie danach das Objektiv und das Messer ab.

Messen Sie die Abmessungen der Probe. Erstellen Sie anschließend eine Konfigurationsdatei für den KESM-Bühnencontroller. Zwei Anwendungen: Heben Sie das Messer und das Objektiv des KESM an, bevor Sie die Bühne initialisieren.

Schalten Sie die KESM-Stufensteuerung zwei ein und initialisieren Sie die Stufe. Senken Sie dann das Messer und das Objektiv ab und schalten Sie die Pumpe ein. Fokussieren Sie das Objektiv und die Kamera, indem Sie am Fokussierknopf des optischen Strahlengangs drehen und das Sichtfeld der Kamera relativ zur Messerkante justieren.

Klicken Sie Schritt für Schritt, um die ersten Schritte der Bildgebung und Schnittführung zu überprüfen. Klicken Sie dann auf „Go“, um die Bildgebung und Schnittführung zur Bildverarbeitung zu starten.

Führen Sie den KESM-Stack-Prozessor aus, um Beleuchtungsartefakte zu entfernen und die Hintergrundintensität in allen Bildern zu normalisieren. Wiederholen Sie dies für alle Daten-Unterordner. Um die Daten mithilfe des KESM-Gehirnatlas zu visualisieren, besuchen Sie diese Website und wählen Sie den entsprechenden Atlas aus, um eine andere Tiefe aufzurufen.

Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü aus, wie tief bei jedem Schritt gegangen werden soll, und klicken Sie dann auf Plus, um die Z-Tiefe zu erhöhen, oder auf Minus, um sie zu verringern. Weitere Optionen umfassen das Hineinzoomen oder die Navigation mithilfe des KESM-Gehirnatlas. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die Überlagerungsanzahl und das Überlagerungsintervall anzupassen, um Daten mit dem VIS-Labor zu visualisieren.

Starten Sie die Anwendung und erstellen Sie ein neues Projekt. Das Projekt sollte „Compose 3D from 2D“ enthalten, Dateien, die Weltmatrix, arithmetische Eins und die Ansicht „3D connected“. In dieser Reihenfolge sollten entsprechende Parameter wie in der Ansicht „3D“ gezeigt eingestellt werden, während die rechte Maustaste gedrückt wird.

Bewegen Sie die Maus, um die Schwellenwerte anzupassen; Bereiche können zugeschnitten werden. Die Orientierung änderte sich, die Beleuchtung änderte sich oder der Hintergrund wurde ein- bzw. ausgeschaltet. Repräsentative KESM-Ergebnisse werden durch die folgenden Videoclips veranschaulicht, die zunächst Volumendarstellungen von KESM zeigen, komplette Datensätze von India-Tinte für das Gehirn für den vaskulären Datensatz, beginnend mit einer Nahansicht der vaskulären Daten mit einer Breite von etwa 100 Mikrometern.

Dieser zweite Ausschnitt von KESM, das Ganzhirn-Datenmaterial mit Tusche, zeigt drei Standardansichten der gesamten vaskulären Struktur des Maushirns, die aus hochauflösenden Daten mit einer Breite von etwa 10 Millimetern stammen. Die sagittale Ansicht, die koronare Ansicht und die horizontale Ansicht, sowie ein Durchflug durch den koronaren Schnitt. KESM. Ganzhirn-Golgi-Daten der Maus werden in diesem Videoclip veranschaulicht, der einen Durchflug entlang der drei verschiedenen Schnittebenen zeigt, beginnend mit der Blockansicht, gefolgt von der sagittalen Ansicht, der koronaren Ansicht und der horizontalen Ansicht.

Weitere Details der KESM-Ganzhirn-Mausdaten von GoGy werden gezeigt. Dieser erste Videoclip zeigt das Kleinhirn und die Purkinje-Zellen. Dieser zweite Clip zeigt die Großhirnrinde und die parametralen Zellen.

Schließlich KESM. Die NLE-Daten des gesamten Gehirns werden in diesen beiden Videoclips veranschaulicht. Zunächst ist eine Nahaufnahme der NLE-Daten zu sehen.

Dieser zweite Ausschnitt zeigt drei Standardansichten der gesamten Maushirn-Nle-Daten, die aus hochauflösenden Daten stichprobenartig ausgewählt wurden. Außerdem wird ein Querschnitt gezeigt, um einen klaren Blick auf die inneren Strukturen nach dieser Entwicklung zu ermöglichen. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um neuronale und vaskuläre Netzwerke im Maushirn zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Probenvorbereitung, die Bildgebung und die Datenanalyse für das Knife-Edge-Scanning-Mikroskop besitzen.