Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Präparation biologischer Proben für das Schneiden und Darstellen unter dem Messerkanten-Rastermikroskop (KESM) und die Visualisierung der resultierenden Bildstapeldaten zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst fixiert, gefärbt und eingebettet wird, um es für die Bildgebung unter dem KESM vorzubereiten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das KESM zu konfigurieren und die Schnitte und Bildgebung mit der automatisierten Steuerungssoftware durchzuführen.

Die resultierenden Bilder werden dann entrauscht und beschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Datensätze in einen webbasierten Atlas und eine 3D-Visualisierungssoftware zu laden und zu untersuchen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die gesamte Gehirnebene, die neuronale und vaskuläre Organisation mit einer Auflösung von unter einem Mikrometer zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Mesos, wie z. B. der seriellen Blockbase-Rasterelektromikroskopie, besteht darin, dass sie viel größere Volumina abbilden kann, wenn auch mit einer geringeren Auflösung. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Konnektomik und der Neurowissenschaften im Allgemeinen zu beantworten. Diese Methode kann Einblicke in die strukturelle Organisation des Gehirns geben und auch auf andere Organsysteme wie Lunge und Niere angewendet werden.

Um mit diesem Verfahren zu beginnen, wird das präparierte Mäusegehirn in ein Glas gegeben, das Golgi Cox Solution enthält. Stellen Sie das Glas 10 bis 16 Wochen lang bei Raumtemperatur in eine lichtdichte Schachtel. Ein separater Fixierungsschritt ist nicht erforderlich, da die Golgi Cox-Lösung als Fixiermittel wirkt.

Spülen Sie das Gehirn nach 10 bis 16 Wochen über Nacht im Dunkeln in entionisiertem Wasser, tauchen Sie das gespülte Gehirn am nächsten Tag in 5%ige Ammoniumhydroxidlösung in entionisiertem Wasser für sieben bis 10 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur. Spülen Sie das Gehirn nach sieben bis 10 Tagen erneut vier Stunden lang in entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Dehydrieren Sie dann das Gehirn durch eine abgestufte Reihe von Ethylalkoholen, lassen Sie es 24 Stunden lang in jeder Lösung, 50 % Ethanol und 70 % Ethanol bei vier Grad Celsius und 85 % Ethanol.

Drei Wechsel von 95 % Ethanol und vier bis fünf Wechsel von 100 % Ethanol bei Raumtemperatur. Legen Sie als Nächstes das dehydrierte Gehirn in Aceton und führen Sie jeweils einen Tag lang drei bis vier Veränderungen durch. Legen Sie danach das Gehirn über Nacht in den Kühlschrank in jede dieser Acetonmischungen mit einem Aceton-Verhältnis von eins zu zwei, eins zu eins und zwei zu eins.

Zum Schluss das Gehirn in 100%aite in den Kühlschrank stellen, jedes Mal über Nacht drei Änderungen durchführen. Das behandelte Gehirn wird dann in 100%ait eingebettet und drei Tage lang auf 60 Grad Celsius erhitzt. Schließlich wird der ausgehärtete Probenblock auf den Metallprobenring montiert, wobei Epoxidharz verwendet und die Seiten des Blocks nach Bedarf abgeschnitten werden, um diesen Vorgang zu starten.

Vergewissern Sie sich, dass die Maus tief betäubt ist und nicht auf ein Einklemmen der Zehen reagiert. Dann perfundierte die Maus trans cordial mit bei Raumtemperatur phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von kaltem 4%Phosphat gepuffertem para-Formaldehyd. Als nächstes perfundieren Sie die Maus mit einer Lösung von 0,1%thi und färben Sie sie in entionisiertem Wasser.

Legen Sie den Körper danach für 24 Stunden in einen vier Grad Celsius heißen Kühlschrank. Nach 24 Stunden das Gehirn aus dem Kalb nehmen und in eine frische Lösung von 0,1 % Thionin geben. Lassen Sie das Gehirn sieben Tage lang bei vier Grad Celsius.

Nach sieben Tagen wird das Gehirn durch eine abgestufte Reihe von Ethylalkoholen festgehalten und dehydriert. Über einen Zeitraum von sechs Wochen werden drei bis fünf Tage in 50 % Ethanol, sieben bis 10 Tage in 70 % Ethanol, jeweils etwa zwei Wochen in 85 und 95 % Ethanol und die restliche Zeit in 100 % Ethanol verwendet. Nach dreimaligem Wechsel des Acetons bei Raumtemperatur wird das Gehirn in einem 60 Grad Celsius heißen Ofen in gelehrten Kunststoff eingebettet.

Um das Verfahren zum Färben des Gefäßnetzes mit Tusche zu beginnen, bestätigen Sie durch das Fehlen eines Zehenrückzugsreflexes, dass die Maus tief anästhesiert ist. Dann perfundieren Sie die Maus trans cordial mit bei Raumtemperatur phosphatgepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von bei Raumtemperatur 10% neutral gepuffertem Formin. Eine Ganzkörperperfusion mit Kochsalzlösung und Fixiermittel ist notwendig, um das Blut aus dem Herz-Kreislauf-System zu entfernen und das Gewebe zu fixieren.

Als nächstes perfuieren Sie die Maus mit 3,0 cm³ unverdünnter Tuscheperfusion. Mit Tusche ist es notwendig, das Gefäßsystem des Herz-Kreislauf-Systems vollständig zu füllen. Nach der Entnahme aus der Maus wird das resultierende Gehirn durch eine Reihe von abgestuften Ethylalkoholen dehydriert und dann in gelehrten Kunststoff eingebettet.

Befolgen Sie das zuvor gezeigte Protokoll, um das KESM für die Bildgebung einzurichten, schalten Sie die Kamera, das Beleuchtungsgerät und den Tisch ein und heben Sie das Messer und das Objektiv an. Montieren Sie anschließend den Probenring. Senken Sie dann das Objektiv und das Messer ab.

Messen Sie die Abmessungen der Probe. Erstellen Sie dann eine Konfigurationsdatei für den KESM Stage Controller. Zwei Anwendungen, heben Sie das Messer und das Ziel des KESM vor der Initialisierung der Stufe.

Starten Sie den KESM Stage Controller 2 und initialisieren Sie die Stage. Senken Sie dann das Messer und das Objektiv ab und schalten Sie die Pumpe ein. Fokussieren Sie das Objektiv und die Kamera, indem Sie den Fokussierknopf an der optischen Schiene drehen und das Sichtfeld der Kamera relativ zur Messerschneide einstellen.

Klicken Sie auf Schritt-für-Schritt, um die ersten Schritte der Bildgebung und Schnitterstellung zu überprüfen. Klicken Sie dann auf Los. Zum Initiieren der Bildgebung und Schnitterstellung für die Bildverarbeitung.

Führen Sie den KESM-Stack-Prozessor aus, um Beleuchtungsartefakte zu entfernen und die Hintergrundintensität in allen Bildern zu normalisieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Datenunterordner. Um Daten mit dem KESM-Gehirnatlas zu visualisieren, gehen Sie auf diese Website und wählen Sie den entsprechenden Atlas aus, um in eine andere Tiefe zu gelangen.

Wählen Sie aus dem Pulldown-Menü aus, wie tief Sie bei jedem Schritt gehen möchten, und klicken Sie dann entweder auf das Pluszeichen, um die Z-Tiefe zu erhöhen, oder auf das Minus, um die Z-Tiefe zu verringern. Weitere Optionen sind das Heranzoomen oder die Navigation mit dem KESM-Gehirnatlas. Verwenden Sie das Pulldown-Menü, um die Overlay-Nummer und das Overlay-Intervall anzupassen, um Daten mit VIS Lab zu visualisieren.

Starten Sie die Anwendung, und erstellen Sie ein neues Projekt. Das Projekt sollte das Komponieren von 3D aus 2D-Dateien beinhalten, das Festlegen der Weltmatrix, die Arithmetik und die Ansicht von 3D verbunden. In dieser Reihenfolge sollten die entsprechenden Parameter eingestellt werden, wie in der Ansicht 3D gezeigt, während Sie die rechte Maustaste drücken.

Bewegen Sie die Maus, um den Schwellenwert anzupassen, der beschnitten werden kann. Die Ausrichtung wurde geändert, die Beleuchtung wurde geändert oder der Hintergrund wurde ein- oder ausgeschaltet. Repräsentative KESM-Ergebnisse werden durch die folgenden Videoclips veranschaulicht, die zuerst gezeigt werden, sind Volumenvisualisierungen von KESM, Whole Brain India Ink Datenstapeln für den vaskulären Datensatz, beginnend mit einer Nahaufnahme der vaskulären Daten mit einer Breite von etwa 100 Mikrometern.

Dieser zweite Clip von KESM, whole Brain India Ink Data, zeigt drei Standardansichten des gesamten Gefäßsystems des Mausgehirns, Untertitel aus hochauflösenden Daten mit einer Breite von etwa 10 Millimetern. Die sagittale Ansicht, die koronale Ansicht und die horizontale Ansicht sowie ein Durchflug des koronalen Schnitts. KESM. Die Daten der Ganzhirnmaus Golgi werden in diesem Videoclip veranschaulicht, der einen Durchflug entlang der drei verschiedenen Schnittebenen zeigt, beginnend mit der Blockansicht, gefolgt von der sagittalen Ansicht, der koronalen Ansicht und der horizontalen Ansicht.

Als nächstes werden Details zu den GoGy-Daten der KESM-Ganzhirnmaus gezeigt. Dieser erste Videoclip zeigt die Kleinhirn- und Purkinje-Zellen. Dieser zweite Clip zeigt den Kortex und die Parametallzellen.

Schließlich hat KESM. Die Daten des gesamten Gehirns werden in diesen beiden Videoclips veranschaulicht. Zuerst ist eine Nahaufnahme der NLE-Daten zu sehen.

Dieser zweite Clip zeigt drei Standardansichten des gesamten Mausgehirns Nle-Datensubs, die aus hochauflösenden Daten entnommen wurden. Es wird auch ein Querschnitt gezeigt, um einen klaren Blick auf die internen Strukturen nach dieser Entwicklung zu erhalten. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, neuronale und vaskuläre Netzwerke im Gehirn von Mäusen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der Probenvorbereitung, der Bildgebung und der Datenanalyse für das Messerkanten-Rastermikroskop haben.