Name: Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Probenvorbereitung für die Knife-Edge-Scanning-Mikroskopie zur Untersuchung neuronaler und vaskulärer Netzwerke im Mausgehirn. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Bildgebung großer Volumina für die Konnektomik.

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Dieses Projekt wurde von NIH / NINDS finanziert (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), das Texas Advanced Technology Program (# ATP-000.512-0146-2001, # ATP-000.512-0261-2001), Texas A &amp; M Research Foundation, Department of Computer Science and Engineering an der Texas A &amp; M University, und 3Scan. Wir möchten Bernard Mesa (Micro Star Technologies) für technische Beratung und Unterstützung für KESM Instrumentierung danken. Wesentliche Teile der Gestaltung und Umsetzung der KESM wurde von Bruce H. McCormick, der 2007 starb getan.

1. Probenvorbereitung: Golgi-Cox <ol><li> Dieses Protokoll lehnt sich eng an das Protokoll von Mayerich et al. 7. </li><li> Die C57BL/6J Maus ist tief narkotisiert mit Isofluran inhalant Anästhesie und dann enthauptet. </li><li> Das Gehirn wird entfernt und in einen Golgi-Cox Fixierung Lösung (1% Kaliumchromat, 1% Kaliumdichromat und 1% Quecksilberchlorid in VE-Wasser) gelegt. </li><li> Das Gehirn ist in der Golgi-Cox-Lösung im Dunkeln gelassen, bei Raumtemperatur für 10 bis 16 Wochen. </li><li> Die Gehirne werden in deionisiertem Wasser über Nacht im Dunkeln gespült. </li><li> Die gespült Gehirn ist in 5% Ammoniumhydroxidlösung in VE-Wasser für 7 bis 10 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur eingetaucht. Dieser langwierige Vorbereitungszeit war die Infiltration des gesamten Gehirns zu gewährleisten, so dass der schwarze Niederschlag eine Chance, vollständig in das Gewebe zu bilden hatte. </li><li> Das Gehirn ist wieder in deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur gespült 4 Stunden und tHenne dehydriert durch eine abgestufte Reihe von Ethylalkohole: 50% und 70% in den Kühlschrank (4 ° C) und 85%, 95% (3 Änderungen), und 100% (4 bis 5 Änderungen) bei Raumtemperatur. Das Gehirn ist in jeder Lösung für 24 Stunden belassen. </li><li> Die entwässerten Gehirn ist dann in Aceton gelegt (3 bis 4 Änderungen, die jeweils für einen Tag), gefolgt von einem Araldit-Aceton-Gemisch mit Araldit-to-Aceton-Verhältnis von 1:2, 1:1, 2:1, und schließlich in 100% Araldit (3 ändert sich mit jedem über Nacht) im Kühlschrank (4 ° C). </li><li> Schließlich wird das behandelte Gehirn in 100% Araldit eingebettet und auf 60 ° C für 3 Tage (vgl. Einbettung Protokoll in Abbott und Sotelo 2). Wenn die Proben in LR White eingebettet sind dann die Proben aus den letzten 100% Ethanol-Lösung durch drei Änderungen des LR White-Lösung, die jeder im Kühlschrank über Nacht aufbewahrt, die eine Standard-Prozedur vor der Polymerisation übertragen wird. Drei Änderungen werden durchgeführt, um vollständige Infiltration gewährleisten. Die Probe wird tHenne auf frisches LR White, die in einem geschlossenen Behälter bei 60 polymerisiert ° C für 24 Stunden, die die erforderliche Menge von Zeit und Temperatur für die ordnungsgemäße Polymerisation wird. </li><li> Abb.. 1 zeigt ein Golgi-Cox gefärbten Gehirns in Araldite eingebettet. </li><li> Die ausgehärteten Probe Block wird dann auf dem Metall Probe Ring mit Epoxy angebracht, und die Seiten des Blocks abgeschnitten als notwendig (siehe Abb. 2).. </li></ol> 2. Probenvorbereitung: Nissl <ol><li> Die Maus ist tief narkotisierten mit Ketamin und Xylazin (1,7 mg Ketamin / 0,26 mg Xylazin pro 20 Gramm Körpergewicht) intraperitoneal und dann perfundierten transkardial mit 50 ml Raumtemperatur Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), um 250 mL Platz, gefolgt Temperatur 10% neutral gepuffertem Formalin (pH 7,4). und schließlich mit 3,0 ccm unverdünnt Tusche. </li><li> Die Ganzkörper-Perfusion mit Kochsalzlösung und Fixativ ist notwendig, um das Blut aus dem Herz-Kreislauf-System klar und auf den ti fix RAGEN. Perfusion mit Tusche ist notwendig, um vollständig zu füllen das Gefäßsystem des Herz-Kreislaufsystems. </li><li> Die daraus resultierende Gehirn wird dann durch eine Reihe von abgestuften Ethylalkohole (25% -100%) dehydriert und dann in Araldit Kunststoff nach dem Protokoll in 1,8-1,9 oben eingebettet. Wenn LR weiß ist das Einbettmedium dann das Protokoll in 1.10 oben folgt. </li></ol> 4. Probenvorbereitung: Generic Arten, generische Organe <ol><li> Für den allgemeinen Fall, kann Fixierung mit entweder 10% neutral gepuffertem Formalin oder 4% Paraformaldehyd durchgeführt werden. </li><li> Für kleine Gewebe Volumen, ist die Diffusion statt Perfusion für die Fixierung und Färbung empfohlen. Im Fall von kleinen Organismen oder Organe können Verfärbungen auch während der Entwässerung Prozess gemacht werden. </li><li> Die Einbettung Protokoll ist das gleiche wie oben, obwohl die Zeiten für die Lösung Infiltration von Organen oder Organismen, die viel kleiner sind als ganze Gehirn der Maus reduziert werden kann. </li></ol>jove_title "&gt; 5. KESM Setup-und Imaging- <ol><li> Pumpe ausschalten, auf der Bühne drehen, drehen vor der Kamera, drehen Sie am Illuminator. </li><li> Raise Messer und objektiv. </li><li> Installieren Probe Ring. </li><li> Measure Probe Dimension und eine Konfigurationsdatei für die KESM Bühne Controller2 Anwendung. </li><li> Starten KESM Bühne Controller2 und initialisieren Bühne. </li><li> Untermesser / Ziel, an der Pumpe ab. </li><li> Fokus Ziel und Kamera durch Drehen der Fokussierknopfes auf der optischen Bahn und Einstellen der Kamera das Sichtfeld des in Bezug auf die Messerschneide. </li><li> Drücken Sie auf [Start], um Imaging zu initiieren. </li><li> Siehe Abb.. 3-8. Siehe 9, 7 für technische Details. </li></ol> 6. Bildverarbeitung und-aufbereitung <ol><li> Kopieren Sie die KESM Stack-Prozessor ausführbare Datei in den Ordner Data unter der Konfigurationsdatei Ordner (00000, 00001, etc.). </li><li> Führen Sie das KESM Stack-Prozessor für die Beleuchtung Artefakt zu entfernen und normalisieren die Hintergrund-Intensität in allenBilder. Wiederholen Sie dies für alle Daten Unterordnern. </li><li> Bereiten Multiskalen Fliesen aus dem Datensatz und Upload und Einrichten der Dateien in der KESM Brain Atlas Web-Server. </li><li> Siehe Abb.. 9. </li></ol> 7. Datenvisualisierung und-analyse <ol><li> Visualisierung mit dem KESM Brain Atlas. Zum <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> und wählen Sie den entsprechenden Atlas. <ol><li> Navigieren Sie in Google maps. </li><li> Zoom in und aus, wie in Google Maps. </li><li> Um zu einer anderen Tiefe, wählen Sie, wie tief bei jedem Schritt aus dem Pull-Down-Menü gehen, und dann klicken Sie entweder auf [+] oder [-] zu erhöhen oder verringern z Tiefe. </li><li> Passt die Overlay-Nummer über das Pulldown-Menü. </li><li> Passt die Overlay-Intervall mit dem Pull-Down-Menü. </li><li> Siehe Abb.. 11. </li></ol></li><li> Visualisierung mit MeVisLab. <ol><li> Starten Sie MeVisLab. </li><li> Erstellen Sie ein neues Projekt. </li><li> Im Folgenden können neue Module, die von ty werden die Schaffungping in den Modul-Namen in der Befehlszeile ein. </li><li> Neues Modul [Compose3Dfrom2DFiles], und gehen Sie auf den gewünschten Ordner. Geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie in string [GetFileList]. Achten Sie darauf, die ausgewählten Bilder können in den Speicher passen. Klicken Sie auf [Create3D] zu erstellen Volumen. </li><li> Neues Modul [SetWorldMatrix], und stellen Sie die "Scale" unter "Elementare Transformationen" x, y, z die entsprechenden Voxelgröße (0,6, 0,7, 1,0 für eine 10X 0.45NA Ziel). Link [Compose3Dfrom2DFiles] bis [SetWorldMatrix]. </li><li> Set Matrix und Transformationen unter "Matrix Composition" auf "Ignorieren", "Ignorieren", "Forward". </li><li> Neues Modul [Arithmetic1] und stellen Sie die "Function" auf "Invert (Max-Img)". Link [SetWorldMatrix] bis [Arithmetic1]. </li><li> Neues Modul [View3D] und connect [Arithmetic1]. </li><li> In View3D, während die rechte Maustaste gedrückt wird, bewegen Sie die Maus, um die Schwelle einstellen. Sie können Bilder zuschneiden Regionen, die Ausrichtung ändern (bewegen Sie die Maus, während linke Maustaste gedrückt ist), ändern Beleuchtung (Volumen-zeichnungeng oder MIP), on / off Hintergrund drehen, etc. </li><li> Siehe Abb.. 10. </li></ol></li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Hier präsentieren wir Whole-Brain-Daten und Details. Feigen. 12-15 zeigen, Whole-Brain Tusche, Golgi und Nissl Datensätze 1, 4, 3. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Fixiert, gefärbt und eingebettete Gehirn der Maus <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Embedded Maushirn Probe montiert auf die Probe Ring. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Der Knife Edge Scanning Mikroskop (KESM). Ein Foto des KESM ist mit seinen wesentlichen Komponenten markiert dargestellt: (1) High-Speed-Zeilenkamera, (2) Mikroskop-Objektiv, (3) Diamantmesser Montage-und Licht-Kollimator, (4) speCimen Tank (für Wasserlagerung imaging), (5) Drei-Achsen-Präzisions-Luftlagerung Bühne, (6) weiß-Lichtmikroskop-Hilfslicht, (7) Wasserpumpe (im Hintergrund) für die Entfernung von Gewebe geschnitten, (8) PC-Server für Bühne und Bildaufnahme, (9) Granitsockel, und (10) Granit-Brücke. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Imaging Prinzipien der KESM. Das Prinzip der Betrieb von KESM dargestellt. Das Ziel und das Messer ist an ihrem Platz gehalten, während die Probe auf die Positionierung der Bühne bewegt (Pfeil mit durchgezogener Linie) mit der Auflösung von 20 nm und Fahrgeschwindigkeit von 1-5 angebracht und wird auf der Diamant-Messer abgeschabt (5 mm breit für 10X-Objektiv) und erzeugt einen dünnen Abschnitt fließt über das Messer (Pfeil mit durchgezogener Linie). Line-Scan-Bildgebung ist in der Nähe der Spitze des Messers gemacht. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. KESM Kamera und Objektiv Fokussierung steuert. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. KESM Messeranordnung und Kontrollen. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Initial Fokussierung durch die Beobachtung Port. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. KESM Bühne Controller 2-Applikation (Screenshot). <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. KESM Stack-Prozessor-Anwendung (Screenshot). <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 10"> Abbildung 10. MeVisLab Anwendung (Screenshot). <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 11"> Abbildung 11 KESM Brain Atlas:. Web-Schnittstelle (Screenshot). <img alt="Abbildung 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 12"> Abbildung 12. KESM Whole-Brain Tusche Daten. Volume Visualisierungen KESM Daten Stacks sind für die vaskuläre Datensatz angezeigt. (A) Close-up des vaskulären Daten. Breite ~ 100 um. (Bd) Drei Standard-Ansichten des ganzen Gehirn der Maus Gefäßsystem (subsampled von Daten mit hoher Auflösung). Breite ~ 10mm. <img alt="Abbildung 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 13"> Abbildung 13. KESM Whole-Brain-Maus Golgi-Daten. <img alt="Abbildung 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 14"> Abbildung 14. KESM Golgi Daten Details. <img alt="Abbildung 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 15"> Abbildung 15. KESM Whole-Brain Nissl Daten. (A) Close-up der NISSL Daten. ~ 300 UM 3. (Bd) Drei Standard-Ansichten des ganzen Gehirn der Maus Nissl Daten (subsampled von Daten mit hoher Auflösung). Querschnitt für eine klare Sicht auf die internen Strukturen gezeigt.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Miller, D. E., Han, D., Yang, H. -F., Chung, J. R., Sung, C., Mayerich, D., Kwon, J., Micheva, K., Smith, S. J. Multiscale imaging, analysis, and integration of mouse brain networks. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 516.3, Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
<li>Choe, Y., Han, D., Huang, P. -S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Abbott, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+submicrometer+scans+of+mouse+brain+microstructure%3A+Neurons+and+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22%5BJournal%5D)">Complete submicrometer scans of mouse brain microstructure: Neurons and vasculatures.</a> Neuroscience Meeting Planner. Program No. 389.10, Society for Neuroscience Program. Chicago, IL. (2009).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Han, D., Huang, P. S., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Melek, Z., McCormick, B. H. Knife-edge scanning microscopy: High-throughput imaging and analysis of massive volumes of biological microstructures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChoe%2C+Y+%22High-Throughput+Image+Reconstruction+and+Analysis%3A+Intelligent+Microscopy+Applications%22">High-Throughput Image Reconstruction and Analysis: Intelligent Microscopy Applications</a>. Ravi Rao, A., Cecchi, G. , Artech House. Boston, MA. 11-37 (2008).</li>
<li>Choe, Y., Abbott, L. C., Ponte, G., Keyser, J., Kwon, J., Mayerich, D., Miller, D., Han, D., Grimaldi, A. M., Fiorito, F., Edelman, D. B., McKinstry, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+out+the+octopus+connectome+at+submicron+resolution+using+the+knife-edge+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Charting out the octopus connectome at submicron resolution using the knife-edge scanning microscope.</a> BMC Neuroscience. 11, Suppl 1. 136-136 (2010).</li>
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<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman ist mit 3Scan, ein kommerzielles Unternehmen, produziert und vermarktet das KESM Technology (US-Patent # 6.744.572).

Die KESM ermöglicht eine Sub-Mikrometer-Ebene Umfrage großer Mengen biologischer Proben (~ 1 cm 3). Diese Art von Volumen reicht aus, um ganze kleine tierische Organe, wie Hirn, Lunge, Herz, Nieren halten, Scanned etc. Bilder von solcher Organe können beispiellose quantitative Informationen über die strukturelle Organisation dieser Organe vorsehen und ermöglichen rechnerische Modellierung der verschiedenen Funktionsbereiche Aspekte dieser Organe, einschließlich Schaltung und Netzwerk-Dynamik, elektrische Eigenschaften, Flüssigkeit und Luft Strömungsdynamik und muskulös Dynamik. Die Probenvorbereitung Protokoll und post-Analyse-Protokolls in diesem Artikel beschrieben wird erwartet, dass außerhalb Arbeitsgruppen helfen, einen leichteren Zugang zu den KESM und die daraus resultierenden Daten zu haben. Die KESM Betrieb Protokoll wird dazu beitragen, diese externen Forschern, die Vorteile und Grenzen dieser einzigartigen Bildgebungsverfahren zu schätzen wissen.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

probenvorbereitung, imaging-und analyse-protokolle für knife-edge-scanning-mikroskopie

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Große Fortschritte in hohen Durchsatz, hohe Auflösung, 3D-Mikroskopie-Techniken haben den Erwerb großer Mengen an neuroanatomischen Daten an Sub-Mikrometer-Auflösung aktiviert. Einer der ersten dieser Instrumente produziert Whole-Brain-Scale Data ist das Knife-Edge-Scanning-Mikroskop (KESM) 7, 5, 9, entwickelt und gehostet in der Autoren-Labor. KESM hat Abschnitt und Bild ganze Gehirn von Mäusen auf Submikrometer Auflösung verwendet wurde, enthüllt die komplizierten Details der neuronalen Netzwerke (Golgi) 1, 4, 8, Gefäßnetze (Tusche) 1, 4 und Zellkörper Verteilung (Nissl) 3 . Die Verwendung von KESM ist nicht auf die Maus noch das Gehirn beschränkt. Wir haben erfolgreich die Krake Gehirn 6, Maus Lunge und Gehirn der Ratte abgebildet. Wir arbeiten derzeit an insgesamt Zebrafisch-Embryonen. Daten wie diese können viel zur connectomics Forschung 10 beitragen; die Mikrozirkulation und Hämodynamik Forschung; und Stereologie Forschung durch Rückstellungending eine exakte ground-truth. In diesem Artikel beschreiben wir die Pipeline, darunter Probenvorbereitung (Fixierung, Färbung und Einbettung), KESM Konfiguration und Einrichtung, Schneiden und Bildgebung mit der KESM, Bildbearbeitung, Datenaufbereitung und Visualisierung von Daten und Analysen. Der Schwerpunkt wird auf die Probenvorbereitung und Visualisierung / Auswertung der gewonnenen Daten KESM werden. Wir erwarten, dass die detaillierten Protokoll in diesem Artikel vorgestellt werden, um zu erweitern den Zugang zu KESM und erhöhen ihre Auslastung.

Der gesamte Prozess vom Gehirn Probenvorbereitung auf serielle Schnitte Bildgebung mit dem Knife-Edge-Scanning-Mikroskop, um Daten-Visualisierung und Analyse beschrieben. Diese Technik wird derzeit verwendet, um Maus-Hirn-Daten zu erfassen, aber es ist auf andere Organe, andere Arten.

Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

Wesentliche Fortschritte bei Hochdurchsatz- und hochauflösenden 3D-Mikroskopietechniken haben die Gewinnung großer Mengen neuroanatomischer Daten bei ... ermöglicht.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung biologischer Proben für das Schneiden und Abbilden am Knife-Edge-Scanning-Mikroskop (KESM) sowie die Visualisierung der resultierenden Bilddatenstapel zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem das Gewebe zunächst fixiert, gefärbt und eingebettet wird, um es für die Bildgebung am KESM vorzubereiten. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das KESM zu konfigurieren und das Schneiden sowie die Bildaufnahme mithilfe der automatisierten Steuerungssoftware durchzuführen.Die resultierenden Bilder werden anschließend entrauscht, registriert und zugeschnitten. Der letzte Schritt besteht darin, die Datensätze in einem webbasierten Atlas und einer 3D-Visualisierungssoftware zu laden und zu analysieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die neuronale und vaskuläre Organisation auf Ganzhirnebene mit submikrometerlicher Auflösung zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Mesos wie der seriellen blockbasierten Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, dass sie deutlich größere Volumina abbilden kann, wenn auch mit geringerer Auflösung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Connectomik und der Neurowissenschaften im Allgemeinen zu beantworten. Sie kann Einblicke in die strukturelle Organisation des Gehirns liefern und lässt sich zudem auf andere Organsysteme wie Lunge und Niere anwenden.Um dieses Verfahren zu beginnen, wird das präparierte Maushirn in ein Glasgefäß mit Golgi-Cox-Lösung gegeben. Das Glasgefäß wird für 10 bis 16 Wochen bei Raumtemperatur in eine lichtundurchlässige Box gestellt. Ein separater Fixierungsschritt ist nicht erforderlich, da die Golgi-Cox-Lösung bereits fixierend wirkt.Nach 10 bis 16 Wochen spülen Sie das Gehirn am folgenden Tag über Nacht im Dunkeln mit entionisiertem Wasser aus, tauchen Sie das ausgespülte Gehirn anschließend 7 bis 10 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur in eine 5 %ige Ammoniumhydroxidlösung in entionisiertem Wasser ein. Nach 7 bis 10 Tagen spülen Sie das Gehirn erneut 4 Stunden bei Raumtemperatur mit entionisiertem Wasser aus. Danach dehydrieren Sie das Gehirn durch eine aufsteigende Reihe von Ethylalkohollösungen, wobei es jeweils 24 Stunden in jeder Lösung verbleibt: 50 % Ethanol und 70 % Ethanol bei vier Grad Celsius sowie 85 % Ethanol.Drei Wechsel mit 95 % Ethanol und vier bis fünf Wechsel mit 100 % Ethanol bei Raumtemperatur. Danach das dehydrierte Gehirn in Aceton geben und drei bis vier Wechsel über jeweils einen Tag durchführen. Anschließend das Gehirn über Nacht im Kühlschrank in jeder dieser Aite-Aceton-Mischungen mit einem Aite-zu-Aceton-Verhältnis von eins zu zwei, eins zu eins und zwei zu eins lagern.Legen Sie das Gehirn schließlich in 100 % Aite in den Kühlschrank und wechseln Sie die Lösung dreimal, jedes Mal über Nacht. Das behandelte Gehirn wird dann in 100 % Aite eingebettet und drei Tage lang auf 60 Grad Celsius erhitzt. Abschließend wird der ausgehärtete Präparatblock mit Epoxidharz auf dem metallenen Präparatring befestigt, und die Seiten des Blocks werden bei Bedarf abgeschliffen, um dieses Verfahren zu beginnen.Überprüfen Sie, ob die Maus tief anästhesiert ist und nicht auf einen Zehenquetschreiz reagiert. Anschließend perfundieren Sie die Maus transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, gefolgt von kalter 4 % phosphatgepufferter Parafomaldehydlösung. Danach perfundieren Sie die Maus mit einer Lösung von 0,1 % Thidye in entionisiertem Wasser.Anschließend den Körper 24 Stunden lang in einen Kühlschrank mit vier Grad Celsius stellen. Nach 24 Stunden das Gehirn aus dem Schädel entfernen und in eine frische Lösung von 0,1 % Thionin geben. Das Gehirn sieben Tage lang bei vier Grad Celsius belassen.Nach sieben Tagen das Gehirn entnehmen und durch eine aufsteigende Reihe von Ethylalkoholen dehydrieren. Über einen Zeitraum von sechs Wochen: drei bis fünf Tage in 50%igem Ethanol, sieben bis zehn Tage in 70%igem Ethanol, jeweils etwa zwei Wochen in 85%igem und 95%igem Ethanol und den Rest der Zeit in 100%igem Ethanol. Nach drei Wechseln von Aceton bei Raumtemperatur wird das Gehirn in Erudit-Kunststoff in einem Ofen bei 60 Grad Celsius eingebettet.Um mit dem Verfahren zur Färbung des vaskulären Netzwerks mit Tusche zu beginnen, überprüfen Sie, ob die Maus tief anästhesiert ist, indem Sie das Fehlen des Zehenreflexes feststellen. Anschließend perfundieren Sie die Maus transkordial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, gefolgt von 10 % neutralgepufferter Formalinlösung bei Raumtemperatur. Eine Ganzkörperperfusion mit Kochsalzlösung und Fixansmittel ist notwendig, um das Blut aus dem kardiovaskulären System zu entfernen und die Gewebe zu fixieren.Anschließend wird die Maus mit 3,0 ccm unverdünnter Indiantinte perfundiert. Mit Indiantinte ist es notwendig, das Gefäßsystem des Herz-Kreislauf-Systems vollständig zu füllen. Nach der Entnahme aus der Maus wird das resultierende Gehirn durch eine Reihe von stufenweise konzentrierten Ethylalkoholen dehydriert und anschließend in Epoxidharz eingebettet.Nachdem das zuvor gezeigte Protokoll zur Einrichtung des KESM für die Bildgebung befolgt wurde, schalten Sie die Kamera, die Beleuchtung und den Objekttisch ein und heben Sie das Messer sowie das Objektiv an. Installieren Sie anschließend den Probenträger. Senken Sie danach das Objektiv und das Messer ab.Messen Sie die Abmessungen der Probe. Erstellen Sie anschließend eine Konfigurationsdatei für den KESM-Bühnencontroller. Zwei Anwendungen: Heben Sie das Messer und das Objektiv des KESM an, bevor Sie die Bühne initialisieren.Schalten Sie die KESM-Stufensteuerung zwei ein und initialisieren Sie die Stufe. Senken Sie dann das Messer und das Objektiv ab und schalten Sie die Pumpe ein. Fokussieren Sie das Objektiv und die Kamera, indem Sie am Fokussierknopf des optischen Strahlengangs drehen und das Sichtfeld der Kamera relativ zur Messerkante justieren.Klicken Sie Schritt für Schritt, um die ersten Schritte der Bildgebung und Schnittführung zu überprüfen. Klicken Sie dann auf „Go“, um die Bildgebung und Schnittführung zur Bildverarbeitung zu starten.Führen Sie den KESM-Stack-Prozessor aus, um Beleuchtungsartefakte zu entfernen und die Hintergrundintensität in allen Bildern zu normalisieren. Wiederholen Sie dies für alle Daten-Unterordner. Um die Daten mithilfe des KESM-Gehirnatlas zu visualisieren, besuchen Sie diese Website und wählen Sie den entsprechenden Atlas aus, um eine andere Tiefe aufzurufen.Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü aus, wie tief bei jedem Schritt gegangen werden soll, und klicken Sie dann auf Plus, um die Z-Tiefe zu erhöhen, oder auf Minus, um sie zu verringern. Weitere Optionen umfassen das Hineinzoomen oder die Navigation mithilfe des KESM-Gehirnatlas. Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um die Überlagerungsanzahl und das Überlagerungsintervall anzupassen, um Daten mit dem VIS-Labor zu visualisieren.Starten Sie die Anwendung und erstellen Sie ein neues Projekt. Das Projekt sollte „Compose 3D from 2D“ enthalten, Dateien, die Weltmatrix, arithmetische Eins und die Ansicht „3D connected“. In dieser Reihenfolge sollten entsprechende Parameter wie in der Ansicht „3D“ gezeigt eingestellt werden, während die rechte Maustaste gedrückt wird.Bewegen Sie die Maus, um die Schwellenwerte anzupassen; Bereiche können zugeschnitten werden. Die Orientierung änderte sich, die Beleuchtung änderte sich oder der Hintergrund wurde ein- bzw. ausgeschaltet. Repräsentative KESM-Ergebnisse werden durch die folgenden Videoclips veranschaulicht, die zunächst Volumendarstellungen von KESM zeigen, komplette Datensätze von India-Tinte für das Gehirn für den vaskulären Datensatz, beginnend mit einer Nahansicht der vaskulären Daten mit einer Breite von etwa 100 Mikrometern.Dieser zweite Ausschnitt von KESM, das Ganzhirn-Datenmaterial mit Tusche, zeigt drei Standardansichten der gesamten vaskulären Struktur des Maushirns, die aus hochauflösenden Daten mit einer Breite von etwa 10 Millimetern stammen. Die sagittale Ansicht, die koronare Ansicht und die horizontale Ansicht, sowie ein Durchflug durch den koronaren Schnitt. KESM. Ganzhirn-Golgi-Daten der Maus werden in diesem Videoclip veranschaulicht, der einen Durchflug entlang der drei verschiedenen Schnittebenen zeigt, beginnend mit der Blockansicht, gefolgt von der sagittalen Ansicht, der koronaren Ansicht und der horizontalen Ansicht.Weitere Details der KESM-Ganzhirn-Mausdaten von GoGy werden gezeigt. Dieser erste Videoclip zeigt das Kleinhirn und die Purkinje-Zellen. Dieser zweite Clip zeigt die Großhirnrinde und die parametralen Zellen.Schließlich KESM. Die NLE-Daten des gesamten Gehirns werden in diesen beiden Videoclips veranschaulicht. Zunächst ist eine Nahaufnahme der NLE-Daten zu sehen.Dieser zweite Ausschnitt zeigt drei Standardansichten der gesamten Maushirn-Nle-Daten, die aus hochauflösenden Daten stichprobenartig ausgewählt wurden. Außerdem wird ein Querschnitt gezeigt, um einen klaren Blick auf die inneren Strukturen nach dieser Entwicklung zu ermöglichen. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften den Weg, um neuronale und vaskuläre Netzwerke im Maushirn zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Probenvorbereitung, die Bildgebung und die Datenanalyse für das Knife-Edge-Scanning-Mikroskop besitzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Mukherjee, K., et. al. Analyse von Hirnmitochondrien mittels serieller Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie. J. Vis. exp. (2016)Dieses Video zeigt die Vorbereitung,  Bildgebung und Analyse von Hirngewebe von Mäusen mit einem seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskop (SBFSEM) zur Visualisierung der mitochondrialen Ultrastruktur, die eine präzise Kartierung ihrer Morphologie und räumlichen Verteilung in axonalen und dendritischen neuronalen Kompartimenten ermöglicht.

 Bildgebung neuronaler Mitochondrien mit einem seriellen Block-Face-Rasterelektronenmikroskop

Hier ist eine Methode zur Visualisierung der extrazellulären Matrix-Ultrastruktur in dezellularisiertem Herzgewebe dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

Dieser Bericht beschreibt ein Probenvorbereitungsprotokoll und spezifische Bildgebungsbedingungen für die Durchführung der Rastertransmissionselektronentomographie von dicken biologischen Proben.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll für die Kombination von zwei Probe-Verarbeitungstechniken, Hochdruck, Einfrieren und Mikrowellen-gestützte Probenverarbeitung, gefolgt von minimal Harz für die Datenerfassung mit fokussierten Ion Beam Rasterelektronenmikroskop (FIB-SEM) einbetten. Dies wird gezeigt, mit einer Maus tibiale Nerven Probe und Caenorhabditis Elegans.

Biologische Probenvorbereitung durch Hochdruck gefrieren, Mikrowellen-gestützte Kontrastverstärkung und minimale Harz einbetten für Volume Imaging

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.

Verarbeitung von Embryo-, Eierschalen- und Pilzkultur für die Rasterelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt eine Routinemethode für die Verwendung der seriellen Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM), einer leistungsstarken 3D-Bildgebungstechnik. Die erfolgreiche Anwendung von SBF-SEM hängt von der richtigen Fixierung und Gewebefärbung sowie der sorgfältigen Berücksichtigung der Bildgebungseinstellungen ab. Dieses Protokoll enthält praktische Überlegungen für den gesamten Prozess.

Serielle Block-Face-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) biologischer Gewebeproben

Wir führten eine neuartige Bildgebungstechnik namens Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT) ein, die eine unvoreingenommene Bildgebung aller Zellen in Hirnproben auf Mesoskala ermöglicht und nahtlos in den Bildablauf der bandbasierten seriellen Rasterelektronenmikroskopie an derselben Probe integriert werden kann.

Eine optische Bildgebungsmethode mit Rasterelektronenmikroskopie zur mesoskopischen Allzell-Gehirnkartierung

Erfahren Sie die Probenvorbereitung für die Knife-Edge-Scanning-Mikroskopie zur Untersuchung neuronaler und vaskulärer Netzwerke im Mausgehirn. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Bildgebung großer Volumina für die Konnektomik.

Probenvorbereitung, Imaging-und Analyse-Protokolle für Knife-edge-Scanning-Mikroskopie

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