Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Wir beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Wir beschreiben Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der aktiven Kraft auf elektrische Stimulation und die Lebensfähigkeit der Zellen und immunhistologische Färbung erzeugt.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neonatale Ratten-Kardiomyozyten in ein FI-Hydrogel für das kardiale Tissue Engineering einzukapseln. Dies wird erreicht, indem zunächst die Herzen von zwei bis drei Tage alten neugeborenen Rattenbabys isoliert werden. Als nächstes werden die Herzen in Kollagenase verdaut.

Um die Herzzellen von der extrazellulären Matrix zu trennen, werden die Herzzellen anschließend in ein Fibrin-Hydrogel eingekapselt. Schließlich werden die Konstrukte zwei Wochen lang kultiviert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Konstrukte in der Lage sind, als Reaktion auf elektrische Stimulation eine Zuckenkraft von etwa 1,3 Millinewton zu erzeugen.

Darüber hinaus kann die ausgerichtete Struktur des Konstrukts durch histologische Färbung von Myozytenproteinen beobachtet werden. Künstlich hergestellte Myokardkonstrukte können als potenzielle Therapie für Myokardinfarkt dienen, indem sie die Reparatur oder den Ersatz von vernarbtem Gewebe durch künstliches Gewebe ermöglichen und dadurch die Herzfunktion nach Verletzungen oder Krankheiten verbessern. Diese Konstrukte können als wertvolles in vitro Modellsystem dienen, um die Auswirkungen verschiedener Reize auf kontraktile Kräfte und die normale und pathophysiologische Herzentwicklung zu untersuchen.

jede Person mittlere und sterilisierende chirurgische Instrumente vorbereitet haben, legen Sie eine saugfähige Unterlage auf die Haube und die Arbeitsfläche und decken Sie sie mit einem sterilen Tuch ab. Legen Sie die sterilen chirurgischen Instrumente und ein vier mal vier Mal großes Mullkissen auf das sterile Tuch. Öffnen Sie eine sterile Skalpellklinge mit der Nummer 20, ohne die Instrumente zu berühren, und legen Sie sie auf das Tuch.

Nachdem Sie einen Welpen geköpft haben, tupfen Sie die Brust mit Betadin-getränkter Gaze ab. Sichern Sie den Welpen, indem Sie die Schulterblätter zusammendrücken. Führen Sie eine partielle Thorakotomie durch, um das Herz freizulegen, erhöhen Sie den Druck auf die Schulterblätter, wodurch das Herz an den Rippen vorbei gedrückt wird.

Führen Sie zum Sezieren des Schulterblatts die Skalpellklinge hinter das Herz, um die großen Gefäße zu durchtrennen und das Organ zu entfernen. Legen Sie das Herz auf Eis in eine Petrischale, die PBS-Glukose enthält. Sobald die Herzen isoliert wurden, entfernen Sie jegliches restliche Blut und Bindegewebe, indem Sie sie mit eiskalter PBS-Glukose spülen.

Entferne das obere Drittel jedes Herzens, so dass die unteren zwei Drittel übrig bleiben. Isolieren Sie nur den Großteil des ventrikulären Gewebes und legen Sie das Gewebe in eine frische Petrischale mit eiskalter PBS-Glukose. Mit einer sterilen Mikroschere und Pinzette die Herzen vorsichtig in etwa einen Kubikmillimeter große Stücke zerkleinern.

Übertragen Sie das Gewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie alle bis auf 10 Milliliter des Puffers. Fügen Sie sieben Milliliter Kollagenaselösung hinzu. Schütteln Sie das Kollagenase-Gemisch bei 37 Grad Celsius sieben Minuten lang.

Pipettieren Sie vorsichtig 10 Mal, um die Gewebestücke aufzubrechen. Lassen Sie die Stücke absetzen, saugen Sie dann die Flüssigkeit ab und entsorgen Sie sie. Geben Sie sieben Milliliter Kollagenase zu den Gewebestücken und verdauen Sie sie erneut sieben Minuten lang.

Pipettieren Sie für jeden verbleibenden Schritt vorsichtig 10 Mal, um die Gewebestücke aufzubrechen. Nachdem sie sich abgesetzt haben, ziehen Sie den Überstand ab und sammeln Sie ihn In einem separaten konischen 50-Milliliter-Röhrchen geben Sie sieben Milliliter Kollagenase zu den Gewebestücken und verdauen Sie erneut sieben Minuten lang. Zu jedem Überstandsröhrchen werden nach jeder Zugabe von Überstand aus dem Aufschluss 10 Milliliter Stopplösung mit einer anderen serologischen Pipette gegeben.

Zur Vorbereitung auf das Gießen von Fibringelkonstrukten verweisen wir auf den schriftlichen Teil des Protokolls. Platzieren Sie die zuvor konstruierten Dorne in den Sechs-cm³-Spritzengehäusen Verwenden Sie die Drei-cm³-Spritze als Kolben, um eine dichte Abdichtung zwischen den O-Ringen und den Teflonscheiben zu erzielen. Um einen Milliliter Fibringel herzustellen, stellen Sie die F-Lösung in einem konischen Röhrchen her, indem Sie 112 Mikroliter des Fibrinogenstocks zu 558 Mikrolitern von 20 Millimolaren Haufen hinzufügen.

Puffer in 0,9%iger Kochsalzlösung in einem separaten konischen Röhrchen. Stellen Sie eine T-Lösung her, indem Sie 17 Mikroliter des Thrombinstocks und 1,3 Mikroliter der zweiten normalen Calciumlösung zu 135 Mikrolitern DMEM hinzufügen. In einem dritten konischen Röhrchen schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren sie auf eine Konzentration von 29,4 Millionen Zellen pro Milliliter oder das Sechsfache der Konzentration der gewünschten Endkonzentration der Zellen im Konstrukt.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten mit dem Schritt der Konstruktherstellung haben. Nach dem Mischen der Fibrinogen- und Thrombinlösungen erfolgt die Polymerisation von Fibrin schnell. Daher sollten Einzelpersonen schnell arbeiten, um eine homogene Lösung zu gewährleisten und gleichzeitig den Einbau von Luftblasen in das Hydrogel beim Einspritzen in den Formguss zu verhindern.

Wenn Sie bereit sind, das Fibringel-Konstrukt zu gießen, bereiten Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel von eineinhalb Zoll vor. Halten Sie auch eine 21-Gauge-1-Zoll-Nadel bereit. Um einen Milliliter Fibringellösung herzustellen, geben Sie 667 Mikroliter F-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von 167 Mikrolitern Zelllösung.

Und schließlich 167 Mikroliter T-Lösung. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig, um keine Luftblasen zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt hat die Reaktion begonnen und die Injektion des Konstrukts sollte sofort erfolgen.

Verwenden Sie die Spritze und die 18-Gauge-Nadel und ziehen Sie die Fibrinlösung auf. Achten Sie darauf, die Spritze nicht umzudrehen, um zu verhindern, dass Blasen in die Nadel gelangen. Ersetzen Sie die 18-Gauge-Nadel durch eine 21-Gauge-Nadel.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um Luftblasen herauszudrücken. Führen Sie anschließend die Spritze in die Form zwischen dem Stopfengehäuse ein, indem Sie der Nut im Teflon-O-Ring folgen, und injizieren Sie die Lösung in die Form. Kippen Sie die Form, um eine vollständige Füllung zu gewährleisten.

Dann füllst du die restlichen Förmchen. Wickeln Sie die Formen in Dreiergruppen in Para-Folie ein und stellen Sie sie bei 37 Grad Celsius in den Inkubator oder Ofen. Inkubieren Sie die Gele 20 Minuten lang, damit das Fibrin genügend Zeit hat, vollständig zu polymerisieren.

Füllen Sie jedes Kulturglas mit 21 Millilitern Myokardkonstruktmedium pro Konstrukt. Verwenden Sie das sterile Gehäuse der Drei-cm³-Spritze als Kolben, um den Dorn mit dem Konstrukt in eine große Petrischale mit DMEM zu drücken. Legen Sie dann das Konstrukt in das Probenglas.

Inkubieren Sie die Gläser zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius. Um mit der Analyse einer Fibrin-Konstruktklemme zu beginnen, klemmt das Krokodil an der Elektrode fest, die vom Stimulator zu den Drähten an den Elektroden im Bad kommt. Schalten Sie die Datenerfassungsplatine, den Impulsgeber und den Kraftaufnehmer ein.

Stellen Sie den Kraftaufnehmer auf die 5G-Einstellung und stellen Sie ihn auf Null. Öffnen Sie ein benutzerdefiniertes Laboransichtsprogramm, in dem die Daten des Kraftaufnehmers angezeigt und gespeichert werden. Erstellen Sie für jede Probe mit einer Pinzette eine neue leere Textdatei im Datenordner, entfernen Sie das Konstrukt von der Mandlstütze, indem Sie den Konstruktring vorsichtig von der Teflonstütze schieben und über den festen Metallpfosten im Kraftmesssystem legen.

Mittleres Bad. Schiebe und hebe das Konstrukt mit der Pinzette um den Kraftaufnehmerpfosten herum. Platzieren Sie das andere Ende des Konstrukts über dem Schallkopfarm und ziehen Sie es fest, bis der Schallkopf anzeigt.

1,0 G Kraft auf den Herzstimulator. Stellen Sie die Impulsspannung auf 20 Volt, die Dauer auf sechs Millisekunden und die Frequenz auf ein Hertz ein. Starten Sie die elektrische Stimulation, indem Sie die Aus-Aus-Taste drücken.

Starten Sie die Aufnahme, bis die Wellenform regelmäßig wird. Analysieren Sie die Wellenform in MATLAB, um die Kraftrate der Kontraktion und die Relaxationsrate zu bestimmen. Das Kardiomyozyten-Fibrin-Konstrukt bedeckt zunächst die gesamte Breite des Werkzeugs.

Nach zwei Wochen Kultur zieht sie sich auf etwa ein Fünftel der ursprünglichen Breite zusammen. Die elektrische Stimulation des Konstrukts erzeugt Twitch-Kraftdaten, wie hier gezeigt. Es werden Twitch-Kräfte von etwa 1,3 Millinewton erwartet.

Die Zellviabilität des Konstrukts hängt davon ab, wie weit die Zellen von der Oberfläche des Konstrukts entfernt sind, das aufgrund der Diffusionsgrenzen von Sauerstoff in das Konstrukt mit dem Kulturmedium in Kontakt kommt. Auf der Oberfläche des Konstrukts wurde eine hohe Zellviabilität mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie beobachtet. Die ausgerichtete Struktur des Konstrukts wird durch Färbung auf Myosin-Schwerkette in Rot beobachtet. Konnexion 43, die für die Zellkopplung zwischen Myozyten notwendig ist, ist grün.

Sobald das gesamte Protokoll gemeistert ist, sollte es etwa fünf Stunden dauern. Der I-Isolationsteil dauert etwa drei Stunden. Während die Herstellung des Konstrukts etwa zwei Stunden dauert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Nadel immer nach unten zu zeigen, um den Einbau von Luftblasen in das Fibrinnetzwerk zu verhindern.

Darüber hinaus wird durch das Kippen der Form das Nadelloch während des Einspritzens immer auf dem höchsten Punkt gehalten, wodurch sichergestellt wird, dass der Formguss vollständig mit der Fibrinlösung gefüllt ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kardiomyozyten in ringförmige Fibrin-Hydrogele einkapselt, indem man zuerst die Kardiomyozyten von neugeborenen Ratten isoliert und dann die Fibrinlösung in die leicht zusammensetzbaren zylindrischen Formen spritzgießt.