Name: Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Verkapselung von neonatalen Rattenkardiomyozyten in Fibrin-Hydrogel für das Cardiac Tissue Engineering. Diese Methode ermöglicht die Analyse kontraktiler Kräfte und Zellviabilität in vitro.

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National Heart, Lung and Blood Institute (Award # R00HL093358 zu LDB) - Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health unterstützt.

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
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<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
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<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
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<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Verkapselung von neugeborenen Ratten Kardiomyozyten in Fibringele Ergebnisse in einer konsistenten und tragfähigen dreidimensionalen in vitro Modell des myokardialen Systems. Fibrin ist ein bevorzugter Biomaterial, weil, wenn die Zellen eingeschlossen sind, sie metabolisch aktiv und in der Lage Verdichten, Umbau und Neuerstellung einer extrazellulären Matrix, die mit einheimischen Herzgewebe 12 ist sind. Weil wir die Herzmuskelzellen, sich in diesem Umfeld ausrichten zu können, ist ihre Funktion charakteristischer des Herzmuskels, was zu größeren Kontraktion Kraft zu isotropen Gewebe 6 verglichen. Für potenzielle therapeutische Anwendungen ist es notwendig, Zellen in einem Material, das sowohl die Lebensfähigkeit und Funktionalität fördert kapseln. Die Protokolle hier vorgestellten zeigen eine effiziente und genaue Mittel zur Schaffung eines Fibrin-Netzwerk, um Herzzellen Verhalten in einer dreidimensionalen Mikroumgebung kontrollieren. Ein paar mögliche Probleme können bei der Erstellung und Kultur dieser Konstrukte entstehen. Ein mögliches Problem ist die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen vor der Verkapselung, welche erhebliche Auswirkungen auf die Funktionalität des Konstrukts. Anstrengungen sollten unternommen werden, um den Zelltod nach der Trennung durch eine Verringerung der Zeit zwischen der Isolierung und der Kapselung der Zellen innerhalb des Fibringel zu begrenzen. Konstrukte sollten die Medien zur Verfügung gestellt werden jeden zweiten Tag auf einem strengen Zeitplan. Darüber hinaus ist es wichtig, um die Homogenität in allen verwendeten Lösungen zu gewährleisten. Wenn die Mischung von Fibrinogen, Thrombin und Zellen erzeugt eine heterogene Umgebung, die Fähigkeit der Zellen an die ECM-Umgestaltung, ist mechanisch zu koppeln und Vertrag möglicherweise behindert. Es ist auch wichtig, um die Bildung von Luftblasen bei der Injektion der Konstrukte zu vermeiden, um Störungen in der Kontinuität der gezüchteten Gewebe zu verhindern. Ein Weg, um dieses Problem zu lindern ziehen mehr Gel als notwendig, um das Konstrukt in die Spritze zu machen und injizieren langsam. Schließlich, nachdem die Fibrinmatrix gesetzt hat und hat in Kulturmedium für 24 Stunden, ist es wichtig, das Konstrukt von den Seiten der Ringform zu lösen, um die Zell-basierte Verdichtung des Fibringel fördern. Keeping das Konstrukt in der Mitte der Form erleichtert Gas-und Stoffaustausch. Die Einhaltung der Seiten der Ringform kann auch stören die gewünschte zelluläre Ausrichtung. Es ist wichtig zu beachten, dass bewusste Enthauptung als Methode der euthanization in diesem Protokoll, das eine akzeptable Methode nach den Richtlinien sowohl von der National Institutes of Health und der American Veterinary Medical Association ist, verwendet wird. Allerdings empfehlen einige Institutionen Betäubung Nutzung durch Enthauptung neugeborenen Ratten folgten. Wir haben bewusst Enthauptung gewählt, weil es die minimale Menge an Zeit, sorgt unter hypoxischen Bedingungen für die ausgeschnittenen Herzen Gewebe / Zellen. Relativ kleine Mengen von Hypoxie kann zu Ischämie und potenziell Myozyten Tod, der erheblich beeinflussen könnten die Ergebnisse dieses Protokoll Myozyten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Natriumdihydrogenphosphat </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Kaliumphosphat einbasischen </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> hemostat </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91308-12 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> feinen Pinzette </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11251-20 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> große Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91401-14 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Mikro-Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 91501-09 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Skalpellgriff </td><td> Feine Science Tools </td><td> 10008-13 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Skalpell </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 bis 918-5A </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Absorbent Bank underpad </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterilen Tuch </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Autoklavierbeutel </td><td> Fischer </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Gaze </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> betadine </td><td> Purdue Produkte </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterile Handschuhe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> sterile Transferpipette </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Kollagenase </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolation </td></tr><tr><td> Teflonstab 1 / 4 Zoll Durchmesser </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Teflonschlauch 1 / 4 Zoll-ID, 1 / 2 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Silikon O-Ring 1 / 4 Zoll-ID, 1 / 2 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Teflonschlauch 1 / 4 Zoll-ID, 5 / 16 Zoll OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Kendall Monoject Spritzen 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> BD Spritze 3cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Das Formteil </td></tr><tr><td> Bovine Fibrinogen </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Bovine Thrombin </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Kalziumchlorid </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 0,2 Mikron-Filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 40 Mikron Zelle Siebe </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 0,45-Mikron-Bottle Top-Filters </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Glas-Vorfilter </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 Zoll lange Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 bis 826-5D </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> 21G 1 inch Nadel </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> konstruieren Gläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Konstruieren </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Aminocapronsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Medien </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, 16% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Optimale Schnittqualität Temperatur (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> 2-Methylbutan </td><td> Fischer </td><td> 03551-4 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Maus MYH1/2/4/6 Primärantikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-32732 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Kaninchen Connexin 43 Primärantikörper </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 3512 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> DyLight 549-konjugierten Esel-anti-Maus-sekundären Antikörper </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 715-505-151 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> DyLight 488-konjugierten Donke Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories </td><td> 711-485-152 </td><td> Histologie </td></tr><tr><td> Live / Dead Assay </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analyse </td></tr></tbody></table>

verkapselung von kardiomyozyten in einer fibrin-hydrogel für cardiac tissue engineering

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Kultivieren von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung Hydrogel ist eine wichtige Technik für die Entwicklung Konstrukte für das Tissue Engineering sowie dem Studium zellulärer Reaktionen unter verschiedenen Kulturbedingungen in vitro. Die dreidimensionalen Umgebung genauer imitiert, was die Zellen in vivo beobachten, durch die Anwendung von mechanischen und chemischen Reizen in allen Dimensionen 1. Dreidimensionale Hydrogele können entweder aus synthetischen Polymeren wie PEG-DA 2 und PLGA 3 oder eine Reihe von natürlich vorkommenden Proteinen wie Kollagen 4, Hyaluronsäure 5 oder Fibrin 6,7 vorgenommen werden. Hydrogele aus Fibrin, einem natürlich vorkommenden Blutgerinnungsproteins, erstellt wurden, können polymerisieren zu einem Netz, das Teil des körpereigenen natürlichen Wundheilung 8 ist zu bilden. Fibrin ist Zell-abbaubar und potenziell autologen 9, ist damit ein idealer temporäre Gerüst für das Tissue Engineering. Hier haben wir im Detail beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten aus drei Tage alten neugeborenen Ratten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Neonatal Myozyten sind eine häufige Quelle für Zellen in vitro-Studien im Herzgewebe Bildung und Technik 4 verwendet. Fibrin-Gel wird durch Mischen von Fibrinogen mit dem Enzym Thrombin erstellt. Thrombin spaltet Fibrinopeptide FpA und FpB aus Fibrinogen und enthüllt Bindungsstellen, die mit anderen Monomeren 10 zusammenwirken. Diese Wechselwirkungen führen die Monomere in Fasern, die das Hydrogel Mesh Form selbst zusammen. Da der Zeitpunkt für diese enzymatische Reaktion, indem das Verhältnis von Thrombin, Fibrinogen oder das Verhältnis von Calcium zu Thrombin eingestellt werden kann, kann man Spritzgießwerkzeug Konstrukte mit einer Reihe von unterschiedlichen Geometrien 11,12. Weiterhin können wir die Ausrichtung der resultierenden Gewebe, wie wir beschränken das Gel während der Kultur 13 erzeugen. Nach Kultivierung der technisch Herzgewebe Konstrukte für zwei Wochen unter statischen Bedingungen, die Herzzellen begonnen, das Konstrukt umgestalten und kann eine Kontraktion Kraft unter elektrischer Stimulation Bedingungen 6 zu erzeugen. Als Teil dieses Protokoll, beschreiben wir auch Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der funktionalen Analyse der aktiven Kraft des Herzmuskels erzeugt bauen auf elektrische Stimulation, sowie Methoden zur Bestimmung der endgültigen Lebensfähigkeit der Zellen (Live-Dead assay) und immunhistologische Färbung, um den Ausdruck und die Morphologie der typischen Proteine ​​wichtig für die Kontraktion (Myosin Heavy Chain oder MHC) und zellulären Kopplung (Connexin 43 oder Cx43) zwischen Myozyten zu untersuchen.

Wir beschreiben die Isolierung von neonatalen Kardiomyozyten und die Vorbereitung der Zellen für die Verkapselung in Fibrin-Hydrogel-Konstrukte für das Tissue Engineering. Wir beschreiben Methoden zur Analyse der Gewebezüchtung Myokard nach der Kultur Zeitraum einschließlich der aktiven Kraft auf elektrische Stimulation und die Lebensfähigkeit der Zellen und immunhistologische Färbung erzeugt.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

Die Kultivierung von Zellen in einer dreidimensionalen Hydrogelumgebung ist eine wichtige Technik für die Entwicklung von Konstrukten für das Tissue Engineering sowie für die Untersuchung von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neonatale Rattenkardiomyozyten in einem FI-Hydrogel für das kardiale Gewebeengineering einzuschließen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Herzen von zwei- bis dreitägigen neonatalen Rattenwürfen isoliert werden. Anschließend werden die Herzen mit Kollagenase verdaut.Um die Herzzellen von der extrazellulären Matrix zu trennen, werden die Herzzellen anschließend in ein Fibrin-Hydrogel eingekapselt. Schließlich werden die Konstrukte zwei Wochen lang kultiviert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass die Konstrukte in der Lage sind, als Reaktion auf elektrische Stimulation eine Zuckungskraft von etwa 1,3 Millinewton zu erzeugen.Außerdem kann die ausgerichtete Struktur des Konstrukts durch histologische Färbung von Myozytenproteinen beobachtet werden. Technisch hergestellte myokardiale Konstrukte können als potenzielle Therapie bei Myokardinfarkt dienen, indem sie die Reparatur oder den Ersatz von vernarbtem Gewebe durch technisch hergestelltes Gewebe ermöglichen und so nach einer Verletzung oder Erkrankung die Herzfunktion verbessern. Diese Konstrukte können als wertvolles in-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Reize auf kontraktile Kräfte sowie auf die normale und pathophysiologische Herzentwicklung dienen.Nachdem das Medium vorbereitet und die chirurgischen Instrumente für jede Person sterilisiert wurden, legen Sie eine saugfähige Unterlage auf die Haube und die Arbeitsfläche und bedecken Sie sie mit einem sterilen Tuch. Legen Sie die sterilen chirurgischen Instrumente und einen 10 cm × 10 cm großen Gazekompressen auf das sterile Tuch. Öffnen Sie, ohne die Instrumente zu berühren, eine sterile Skalpellklinge der Größe 20 und legen Sie sie auf das Tuch.Nachdem ein Jungtier enthauptet wurde, den Brustkorb mit mit Betadine getränkter Gaze abwischen. Das Jungtier festhalten, indem man die Schulterblätter zusammenklemmt. Führen Sie eine partielle Thorakotomie durch, um das Herz freizulegen, und erhöhen Sie den Druck auf die Schulterblätter, wodurch das Herz über die Rippen hinausgedrückt wird.Bei der Schulterblatt-Dissektion führen Sie die Skalpellklinge hinter dem Herzen entlang, um die großen Gefäße zu durchtrennen, und entfernen das Organ. Legen Sie das Herz in eine Petrischale mit PBS-Glukose auf Eis. Nachdem die Herzen isoliert wurden, entfernen Sie restliches Blut und Bindegewebe, indem Sie sie mit eiskalter PBS-Glukose spülen.Entfernen Sie das obere Drittel jedes Herzens, sodass die unteren zwei Drittel verbleiben. Um den Großteil des ventrikulären Gewebes allein zu isolieren, geben Sie das Gewebe in eine frische Petrischale mit eiskalter PBS-Glucose-Lösung. Mit sterilen Mikroscheren und einer Pinzette zerkleinern Sie die Herzen vorsichtig in Stücke von etwa einem Kubikmillimeter.Überführen Sie das Gewebe in ein 50-Milliliter-Konischglas und entfernen Sie alles bis auf 10 Milliliter des Puffers. Geben Sie sieben Milliliter Kollagenase-Lösung hinzu. Schütteln Sie die Kollagenase-Gewebe-Mischung sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Pipettieren Sie vorsichtig 10-mal, um die Gewebestücke zu zerkleinern. Lassen Sie die Stücke absetzen und saugen Sie anschließend die Flüssigkeit ab, die verworfen wird. Geben Sie 7 ml Kollagenase zu den Gewebestücken hinzu und verdauen Sie erneut für sieben Minuten.Für jeden verbleibenden Schritt pipettieren Sie sanft zehnmal, um die Gewebestücke aufzulösen. Nachdem sie sich abgesetzt haben, ziehen Sie das Überstandsvolumen ab und sammeln es in einem separaten 50-Milliliter-Konischkolben. Geben Sie sieben Milliliter Kollagenase zu den Gewebestücken hinzu und verdauen erneut für sieben Minuten. Geben Sie zu jedem Überstandsröhrchen nach jeder Zugabe von Überstand aus der Verdauung zehn Milliliter Stopplösung mit einer anderen serologischen Pipette hinzu.Um die Herstellung von Fibrin-Gel-Konstrukten vorzubereiten, ziehen Sie bitte den schriftlichen Teil des Protokolls zu Rate. Setzen Sie die zuvor hergestellten Dorne in die 6-cc-Spritzenhülsen ein, wobei Sie die 3-cc-Spritze als Kolben verwenden, um eine dichte Abdichtung zwischen den O-Ringen und den Teflon-Scheiben zu erzielen. Um ein Milliliter Fibrin-Gel herzustellen, stellen Sie die F-Lösung in einem kegelförmigen Reagenzglas her, indem Sie 112 Mikroliter der Fibrinogen-Stammlösung zu 558 Mikrolitern 20 Millimolar HEPES hinzufügen.Puffer in 0,9 %iger Kochsalzlösung in einem separaten kegelförmigen Reagenzglas. Stellen Sie eine T-Lösung her, indem Sie 17 Mikroliter der Thrombin-Standardlösung und 1,3 Mikroliter zweifach konzentrierter Kalziumlösung zu 135 Mikrolitern DMEM hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem dritten kegelförmigen Reagenzglas und resuspendieren Sie sie in einer Konzentration von 29,4 Millionen Zellen pro Milliliter, also dem Sechsfachen der gewünschten Endkonzentration der Zellen im Konstrukt.Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten mit dem Schritt der Konstrukt-Herstellung. Nach dem Mischen der Fibrinogen- und Thrombin-Lösungen erfolgt die Polymerisation von Fibrin schnell. Daher sollten die Personen zügig arbeiten, um eine homogene Lösung sicherzustellen und gleichzeitig die Einbringung von Luftblasen in das Hydrogel während der Injektion in die Gussform zu verhindern.Wenn der Fibrin-Gel-Construct gegossen werden soll, bereiten Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 18-Gauge-1,5-Zoll-Nadel vor. Halten Sie außerdem eine 21-Gauge-1-Zoll-Nadel bereit. Um eine Milliliter Fibrin-Gel-Lösung herzustellen, geben Sie 667 µL F-Lösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, gefolgt von 167 µL Zelllösung.Und schließlich 167 Mikroliter T-Lösung. Pipettieren Sie das Gemisch vorsichtig, um keine Luftblasen einzuschließen. Zu diesem Zeitpunkt hat die Reaktion begonnen, und die Injektion des Konstrukts sollte unverzüglich erfolgen.Verwenden Sie die Spritze und eine 18-Gauge-Nadel, um die Fibrinlösung aufzuziehen. Achten Sie darauf, die Spritze nicht zu invertieren, um zu verhindern, dass Luftblasen in die Nadel gelangen. Ersetzen Sie die 18-Gauge-Nadel durch eine 21-Gauge-Nadel.Tippen Sie leicht auf die Spritze, um eventuelle Luftblasen herauszudrücken. Stecken Sie anschließend die Spritze in die Form zwischen dem den Stopfen umgebenden Teil entlang der Nut im Teflon-O-Ring und injizieren Sie die Lösung in die Form. Kippen Sie die Form, um eine vollständige Füllung sicherzustellen.Füllen Sie dann die restlichen Formen. Wickeln Sie die Formen zu je dreien in Parafilm ein und stellen Sie sie in den Inkubator oder Ofen bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Gele 20 Minuten lang, um dem Fibrin ausreichend Zeit für eine vollständige Polymerisation zu geben.Füllen Sie jedes Kulturfläschchen mit 21 Milliliter myokardialem Konstruktmedium pro Konstrukt. Verwenden Sie die sterile 3-cc-Spritzenhülle als Kolben, um den Bolzen mit dem Konstrukt in eine große Petrischale mit DMEM zu drücken. Anschließend wird das Konstrukt in das Probengefäß gegeben.Inkubieren Sie die Gefäße zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius. Um mit der Analyse eines Fibrin-Konstrukts beginnen zu können, klemmen Sie die Krokodilklemmen des Leiters, der vom Stimulator zu den Drähten der Elektroden im Bad führt. Schalten Sie die Datenerfassungskarte, den Impulsgenerator und den Kraftaufnehmer ein.Stellen Sie den Kraftaufnehmer auf die 5G-Einstellung ein und tariern Sie ihn. Öffnen Sie ein benutzerdefiniertes LabVIEW-Programm, das die Daten des Kraftaufnehmers anzeigt und speichert. Erstellen Sie für jede Probe eine neue leere Textdatei im Datenordner. Entfernen Sie die Konstruktion mit einer Pinzette vorsichtig vom Teflonträger, indem Sie den Konstruktionsring vom Mandrel-Träger abschieben und über die feste Metallspitze im Kraftmesssystem legen.Mittleres Bad. Benutzen Sie die Pinzette, um das Konstrukt um den Kraftmessdorn herum zu schieben und anzuheben. Legen Sie das andere Ende des Konstrukts über den Transducerarm und ziehen Sie fest, bis der Transducer einen Wert anzeigt.1,0 G-Kraft auf den Herzstimulator. Stellen Sie die Impulsspannung auf 20 Volt, die Dauer auf sechs Millisekunden und die Frequenz auf ein Hertz ein. Starten Sie die elektrische Stimulation, indem Sie die Ausgabe-Ein-Aus-Taste drücken.Beginnen Sie mit der Aufnahme, bis die Wellenform regelmäßig wird. Analysieren Sie die Wellenform in MATLAB, um die Kontraktionskraft und die Relaxationsrate zu bestimmen. Der Kardiomyozyten-Fibrin-Construct bedeckt anfangs die gesamte Breite der Form.Nach zweiw&ouml;chiger Kultivierung zieht es sich auf etwa ein F&uuml;nftel der anf&auml;nglichen Breite zusammen. Die elektrische Stimulation des Konstrukts erzeugt Kontraktionskraftdaten wie hier gezeigt. Kontraktionskr&auml;fte von etwa 1,3&nbsp;Millinewton werden erwartet.Die Zellviabilität des Konstrukts hängt davon ab, wie weit die Zellen von der Oberfläche des Konstrukts entfernt sind, die mit dem Kulturmedium in Kontakt steht, aufgrund der Diffusionsbegrenzungen von Sauerstoff in das Konstrukt. Auf der Oberfläche des Konstrukts wurde mittels konfokaler Mikroskopie eine hohe Zellviabilität beobachtet. Die ausgerichtete Struktur des Konstrukts wird durch Färbung für Myosin-Schwerketten in Rot sichtbar gemacht; Connexin 43, das für die Zellkopplung zwischen Myozyten notwendig ist, erscheint in Grün.Wenn die Methode beherrscht ist, sollte das gesamte Protokoll ungefähr fünf Stunden dauern. Der Isolationsabschnitt benötigt ungefähr drei Stunden, während der Konstruktionsabschnitt ungefähr zwei Stunden in Anspruch nimmt. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Nadel stets nach unten gerichtet zu halten, um die Bildung von Luftblasen im Fibrinnetzwerk zu vermeiden.Außerdem bleibt durch das Neigen der Form während der Injektion stets das Nadelloch am höchsten Punkt, wodurch sichergestellt wird, dass die Formvollguss mit der Fibrinlösung vollständig gefüllt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kardiomyozyten in ringförmige Fibrin-Hydrogels einkapselt, indem man zunächst die Kardiomyozyten aus neugeborenen Ratten isoliert und anschließend die Fibrinlösung in leicht zusammenbaubare zylindrische Formen spritzgussartig einbringt.

encapsulation-cardiomyocytes-fibrin-hydrogel-for-cardiac-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir präsentieren Protokolle für die 3-dimensionale (3D) Verkapselung von Zellen innerhalb synthetischen Hydrogelen. Die Kapselung Verfahren ist für zwei häufig verwendete Methoden der Vernetzung (Michael-Addition und Licht-initiierte radikalische Mechanismen), sowie eine Reihe von Techniken für die Beurteilung der eingekapselten Zellen Verhalten skizziert.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

Verfahren zur Herstellung eines injizierbaren Matrix-Gel aus dezellularisierte Gewebe und Injektion in...

Herstellung von biologisch abgeleiteten Injizierbare Materialien für Myocardial Tissue Engineering

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Nutzung der inhärenten Fähigkeit von Stammzellen zu Stichwort von der sie umgebenden extrazellulären Matrix induziert nehmen und in mehrere Phänotypen zu unterscheiden. Dieses Verfahren erweitert unser Manuskript Beschreibung und Charakterisierung eines Modells unter Verwendung einer zweischichtigen Hydrogel, von PEG-Fibrin und Kollagen zusammen, um gleichzeitig Co-differenzieren Fettgewebe gewonnene...

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

Implantation eines biograft Myokardinfarkt durch LAD-Ligation in einem Nagetiermodell induzierte Behandlung wurde üblicherweise erforderlichen zwei Operationen am offenen Herzen. Um die Sterblichkeit zu reduzieren und optimale Bedingungen für die Fixierung von festen und gallertartige Biomatrices mit Zellen verbunden sind, haben minimal-invasive Verfahren entwickelt worden.

Zell-basierte Therapie bei Herzinsuffizienz in Rat: Doppel Thorakotomie für Herzinfarkt und Epikardiale Implantation von Zellen und Biomatrix

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Einschränkung der schlechten Zelltransplantation für die Stammzellbehandlung von Myokardinfarkten durch die Verwendung eines Hydrogelsystems und eines Fibrin-basierten Klebstoffs zu mildern. Mit diesem Ansatz kann der Zell-zu-Gewebe-Kontakt nach dem Infarkt aufrechterhalten werden, wodurch das therapeutische Potenzial von nützlichen Wirkstoffen an der Verletzungsstelle erhöht wird.

Ein Hydrogel Konstruieren und Fibrin-basierte Kleber Umgangs Therapeutics in einem murinen Myokardinfarkt Modell liefern.

Dieses Protokoll beschreibt die komplette Decellularization des menschlichen Myokard unter Beibehaltung seiner Komponenten der extrazellulären Matrix. Weiterverarbeitung der extrazellulären Matrix Ergebnisse bei der Herstellung von Mikropartikeln und einer zellschützenden selbstorganisierende Hydrogel.

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von benutzerdefinierten Polydimethylsiloxan-Formen, die für die Herstellung von Hydrogel-basierte Technische Gewebe mit komplexen Geometrien verwendet werden können. Wir beschreiben außerdem Ergebnisse aus mechanischen und histologischen Bewertungen auf veränderter kardialen Gewebe hergestellt, mit dieser Technik durchgeführt.

Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

Die Stammzelltherapie hat sich als effiziente Strategie zur Reparatur von verletztem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt herauskristallisiert. Wir bieten eine optimale In-vivo-Anwendung für die Stammzelltransplantation mit gelatinenhydrogelen, die enzymatisch vernetzt werden können.

Intramyokardiale Transplantation von MSC-Loading injizierbaren Hydrogelen nach Myokardinfarkt in einem Murine-Modell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie die Verkapselung von neonatalen Rattenkardiomyozyten in Fibrin-Hydrogel für das Cardiac Tissue Engineering. Diese Methode ermöglicht die Analyse kontraktiler Kräfte und Zellviabilität in vitro.

Verkapselung von Kardiomyozyten in einer Fibrin-Hydrogel für Cardiac Tissue Engineering

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