Video-rate konfokalen Mikroskopie und Mikroendoskopiesysteme

Dieses Video zeigt, wie Sie ein konfokales Video-Rate-Rastermikroskop mit Standardkomponenten konstruieren. Ein konfokales Rastermikroskop beruht auf der koordinierten Bewegung von zwei Rasterspiegeln, um den Strahl über die Rasterebene zu übertragen. Das Licht des ersten Spiegels wird horizontal über den ersten Satz von Relaislinsen abgetastet, wodurch es wieder auf einen stationären Punkt auf dem zweiten Rasterspiegel fokussiert wird. Die gleiche Abtastbewegung wird dann durch die Scan- und Tubuslinsen übersetzt, wobei der nun erweiterte Lichtstrahl auf die hintere Blende der Objektivlinse platziert wird.

Der zweite Spiegel, dessen Bewegung im Vergleich zum ersten Spiegel langsam ist, tastet gleichzeitig die Y-Achse ab, was eine Abtastaktion über und unter der dargestellten Ebene ermöglicht und ein rechteckiges Raster auf der Probenoberfläche erzeugt. Der Hauptvorteil dieses Protokolls gegenüber dem Kauf eines kommerziell erhältlichen Mikroskops sind die niedrigen Kosten und die Möglichkeit, das Instrument an die spezifischen Anforderungen eines Bildgebungsprojekts anzupassen. Bei der Arbeit mit einem Laser ist es wichtig, geeignete Sicherheitsmaßnahmen zu ergreifen, um Verletzungen des Auges zu vermeiden.

Achten Sie darauf, wann immer möglich, die entsprechende Laserschutzbrille zu tragen. Zuschauer und/oder Forscher, die nicht aktiv mit dem Strahl ausrichten oder mit ihm arbeiten, sollten immer eine Brille tragen. Entfernen Sie alle glänzenden und reflektierenden Uhren oder Schmuckstücke.

Am wichtigsten ist, dass Sie dem Strahl jederzeit folgen und ihn kontrollieren, indem Sie seinen Weg mit einem Strahlblock oder einer montierten Visitenkarte beenden. Dies ist besonders wichtig bei der Auskleidung von Spiegeln, da der Weg des Strahls schwer vorherzusagen sein kann. Richten Sie Ihre Augen auch niemals auf eine Höhe mit dem Strahlengang aus.

Schalten Sie den Laser aus, wenn Sie die Ebene des Strahls durchqueren müssen, bevor Sie das Mikroskop zusammenbauen. Stellen Sie sicher, dass alle für die Konstruktion erforderlichen Geräte verfügbar sind, einschließlich des optischen Steckbretts und der 90-Grad-Halterungen, aller Spiegel, Linsen und dichroitischen Spiegel, zusammen mit den entsprechenden Klemmen und Befestigungsmaterial, sowohl den Scan-Spiegeln als auch dem Fotodetektor. Es ist auch nützlich, einen Funktionsgenerator zur Hand zu haben, um die Abtastaktion zu testen und die Spiegel während der Ausrichtung zu manipulieren.

Es wird auch dringend empfohlen, das Steckbrett aus Gründen der Stabilität festzuschrauben. Beginnen Sie mit dem Bau des Mikroskops, indem Sie den Pigtail-Faserator in die optische Halterung einsetzen und diese Baugruppe in der Mitte des optischen Steckbretts platzieren. Dies entspricht dem Ursprung des blauen Strahls, wie hier gezeigt.

Schalten Sie die Lichtquelle ein. Stellen Sie den Balken mit den Einstellschrauben grob so ein, dass er sich sowohl horizontal als auch vertikal in einer geraden Linie bewegt. Platzieren Sie eine Iris vor dem Fasersammler.

Passen Sie als Nächstes die Höhe der Iris so an, dass der Strahl durch die Mitte verläuft. Bewegen Sie dann die Iris entlang des Strahlengangs vom Ator weg. Überprüfen Sie die Ausrichtung des Trägers.

Verwenden Sie die beiden Einstellschrauben, um den Strahl bei Bedarf auf der Iris neu zu positionieren. Platzieren Sie den montierten diic-Spiegel im Strahlengang, wobei der Laserstrahl in der Mitte des Spiegels positioniert ist. Drehen Sie den Spiegelhalter so, dass er den Strahl um ca. 90 Grad reflektiert, und stellen Sie sicher, dass sich die Höhe des Strahls nicht ändert.

Klemmen Sie den Spiegel an den Tisch, indem Sie die Schrauben an der Halterung festziehen. Platzieren Sie anschließend den montierten resonanten galvanischen metrischen Spiegel in den Laserstrahlengang. Es wird darauf geachtet, dass der Laserstrahl genau in der horizontalen Mitte der Spiegeloberfläche positioniert ist.

Drehen Sie die Spiegelhalterung, um den Laserstrahl in einem 90-Grad-Winkel zu reflektieren. Passen Sie dann die Reflexion vom Spiegel grob an, um die gleiche vertikale Höhe des Laserstrahls beizubehalten. Nehmen Sie als Nächstes zwei Iris und platzieren Sie sie direkt vor dem Resonanzmädchen.

Verwenden Sie dann den Laserstrahl, der vom Resonanzspiegel reflektiert wird, als Referenz, und stellen Sie ihre vertikale Höhe wie zuvor ein. Nehmt nun die Schraubenlöcher auf dem optischen Steckbrett als Führung für die Öse und klemmt die beiden Iris in einer geraden Linie nach unten. Passen Sie den ersten Spiegel im Pfad an, bei dem es sich um den dichroitischen Spiegel handelt, um den Strahl auf die erste Iris zu zentrieren.

Passen Sie dann den zweiten Spiegel im Pfad an. Das Resonanzgal zur Zentrierung des Strahls auf der zweiten Iris. Justieren Sie diese beiden Spiegel iterativ, bis der Strahl durch beide Blenden ausgerichtet ist.

Dadurch wird sichergestellt, dass der vom Resonanzspiegel reflektierte Laserstrahl immer noch von der ungefähren Spiegelmitte reflektiert wird. Wenn der Strahl abweicht, stellen Sie die Halterung des Fasercollators ein und wiederholen Sie die Einstellungen, wobei der Strahl auf beiden offenen Iris zentriert ist. Der nächste Schritt besteht darin, die beiden Relaisobjektive, die die erste stationäre telezentrische Ebene abbilden, auf die zweite stationäre telezentrische Ebene zu platzieren.

Für dieses spezielle Mikroskop haben die ausgewählten Linsen im ersten Relais die gleiche Brennweite F, so dass der Abstand zwischen den beiden Spiegeln hier einfach vier F beträgt.Für diesen Aufbau ist F gleich 90 Millimeter, so dass die Position der vier F 360 Millimeter vom Abtastspiegel entfernt ist. Um sicherzustellen, dass die Linsen genau im Strahlengang zentriert sind, platzieren Sie die erste Linse im Strahlengang und schauen Sie auf den Laserstrahlpunkt auf der nächsten Iris im Strahlengang. Stellen Sie nach dem Objektiv die Linsenhöhe so ein, dass sich die vertikale Mitte des Strahls in der Blendenmitte befindet.

Passen Sie als Nächstes die horizontale Strahlposition an, um den Strahl auf der Iris zu zentrieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit der zweiten Linse. Als nächstes wird der Scanspiegel aufgestellt und das Mikroskop gedreht, um eine einfache Platzierung und Ausrichtung von Teilen zu ermöglichen, die sonst vertikal verstellt werden müssten.

Um die genaue Position der zweiten telezentrischen Ebene zu ermitteln, schließen Sie das Resonanzgal O an seine Abtasteinheit an und schalten Sie es ein. Verwenden Sie eine Visitenkarte, um den Weg des Scanstrahls durch die beiden Linsen zu verfolgen. Die zweite telezentrische Ebene befindet sich etwa vier F von der residenten Gal O entfernt und kann als die Stelle identifiziert werden, an der der Abtaststrahl stationär erscheint.

Markieren Sie das Steckbrett unterhalb dieser Stelle mit einem Bleistift. Sobald die telezentrische Ebene identifiziert wurde, stellen Sie den Eingang des Abtastspiegels auf null Volt ein und schalten Sie die Spiegelsteuerungshardware so ein, dass sich der Spiegel in seiner neutralen Position einpendelt. Positionieren Sie dann den Standard-Gamil-Spiegel genau an der Stelle, an der sich die Teleebene befindet.

Stellen Sie die Spiegelposition so ein, dass der Strahl an der Teleebene genau auf die Mitte des Abtastspiegels trifft, und ziehen Sie die Spiegelhalterung fest. Lösen Sie nun die Feststellschraube, mit der der Spiegel befestigt ist, und drehen Sie sie, stellen Sie sicher, dass sich der Strahl vertikal ausbreitet. Schalten Sie nun den Laser und die Scan-Elektronik aus.

Trennen Sie die Faser und trennen Sie die Scanspiegel. Dann mit 90-Grad-Breadboard-Montagehalterungen. Befestigen Sie das zweite Steckbrett am ersten.

Drehen Sie abschließend das gesamte Mikroskop vorsichtig, so dass das neue Steckbrett flach aufliegt, und verwenden Sie die Klemme, um das Mikroskop in Position zu halten. Schließen Sie das Gal O und den Laser hier wieder an und denken Sie daran, das Gal O wieder auf null Volt zu bringen. Der Rest des ehemals vertikalen Aufbaus lässt sich problemlos auf dem flachen Steckbrett durchführen.

Als Nächstes richten wir den zweiten Satz von Relaisobjektiven ein, die offiziell als Scanobjektiv und Tubusobjektiv bezeichnet werden. Bitte beachten Sie das beigefügte schriftliche Protokoll für sehr wichtige Informationen zur Auswahl der richtigen Kombination von Linsen. Beginnen Sie mit dem Einrichten der Objektive.

Legen Sie zunächst die Spiegel aus, die erforderlich sind, um den Strahl auf die Objektivlinse zu lenken. Platzieren Sie den ersten großen 2-Zoll-Spiegel nahe der Kante des Steckbretts und drehen Sie die Spiegelhalterung, um den Laserstrahl etwa um etwa 90 Grad zu reflektieren. Passen Sie die Reflexion vom Spiegel an, um die gleiche vertikale Strahlhöhe beizubehalten.

Platzieren Sie dann den anderen zwei Zoll großen Spiegel an der gegenüberliegenden Kante des Steckbretts, um den Strahl in einem 90-Grad-Winkel zu lenken, und verwenden Sie die Einstellschrauben, um ihn zu fixieren. Stellen Sie als Nächstes zwei Blenden auf und stellen Sie die beiden Spiegel wie zuvor ein, um den Strahl zu zentrieren. Platzieren Sie dann die Scan-Linse in ihrer Brennweite vom Gallon entfernt im Strahlengang und stellen Sie ihre horizontale und vertikale Position ein.

Um den Laserspot auf die erste Iris zwischen den beiden Spiegeln zu zentrieren. Platzieren Sie die große zwei Zoll große Tubuslinse vorsichtig im richtigen Abstand zur Scanlinse und passen Sie ihre horizontale und vertikale Position an, um den Strahl auf die erste Iris zu zentrieren. Bei diesem Aufbau wird die Tubuslinse in einem Abstand von 75 Millimetern plus 300 Millimetern platziert, wobei alle Komponenten an Ort und Stelle sind.

Schließen Sie das Gal O an den Ausgang eines standardmäßigen elektrischen Funktionsgenerators oder Steuerkreises an und stellen Sie die Spitzen- bis Spitzenspannungen auf ein bis drei Volt ein. Beginnen Sie dann mit dem Scannen der beiden Spiegel mit einer Visitenkarte. Platzieren Sie den Laserstrahl in der stationären Ebene, 300 Millimeter nach der Tubuslinse.

Platzieren Sie die Objektivlinse im Strahlengang und achten Sie darauf, die hintere Blende der Objektivlinse so nah wie möglich an der stationären Ebene zu positionieren. Richten Sie den Probentisch ein und stellen Sie sicher, dass die verschiebbare Z-Achsen-Fassung nicht auf die Objektivfassung trifft, da sie über den gesamten Bereich verschoben wird. Um das Konfokal, die Lochblende und den Detektor einzurichten, trennen Sie zunächst alle Netzteile und Glasfasern.

Drehen Sie die Mikroskopbaugruppe so, dass sie wieder auf dem Steckbrett aufliegt und den Resonanzspiegel hält. Nachdem Sie die Faser wieder mit dem Kollimator und dem Standard-Scanning-Spiegel, den Strom-, Versorgungs- und Steuerkabeln verbunden haben, legen Sie null Volt auf die Steuerspannung, die das Standard-Scanning-Gal wie zuvor auf der Bühne antreibt, und platzieren Sie eine Probe eines hellen Färbesandwiches zwischen zwei Abdeckfolien. Schalten Sie dann die Laserquelle ein und bringen Sie den Farbstoff in den Fokus.

Passen Sie die Laserleistung mit einer Visitenkarte an, um die Fluoreszenz so hell wie möglich zu machen. Verfolgen Sie die Fluoreszenzemission von der Probe durch die Objektivlinse durch das Scansystem bis zum dichroitischen Spiegel, der den Laserstrahl reflektiert und die Fluoreszenzemission überträgt. Finde dieses Fluoreszenzsignal auf der anderen Seite des dichroitischen Spiegels.

Dimmen Sie nun die Raumbeleuchtung. Platzieren Sie einen Spiegel hinter dem dichroitischen Spiegel, um die Emission in einem 90-Grad-Winkel zu reflektieren. Richten Sie dann mit einer Iris und einem Spiegel den Fluoreszenzstrahl so gerade und parallel wie möglich zum Steckbrett.

Als nächstes wird die konfokale Lochblende mit der räumlichen Filterkäfighalterung von Thor Labs eingerichtet. Dieses Diagramm skizziert das Setup. Der Abtastspiegel sitzt auf stationären Ebenen, die mit einem stationären Objektiv telesynchronisiert sind.

Linsenpaare in der hinteren Blendenebene zwischen den stationären Ebenen leiten die gescannten Strahlen weiter. Das erste Linsenpaar hat eine gleiche Brennweite, die ein Eins-zu-Eins-Teleskop bildet. Das zweite Linsenpaar, das offiziell als Scan-Linse und Tubus-Linse bekannt ist, muss nicht gleich groß sein und dient oft als Strahlaufweitungsteleskop, um sicherzustellen, dass die hintere Öffnung des Objektivs überfüllt ist.

Das von der Probe emittierte Licht wandert zurück durch das Scansystem und wird durch den dichroitischen Spiegel geleitet. Eine Kurzfokuslinse oder eine Objektivlinse fokussiert das Emissionslicht durch die konfokale Lochblende, das dann von einer Linse zusammengetragen wird. Eine abschließende Linse fokussiert die konfokal gefilterte Emission auf eine Photomultiplier-Röhre.

Platzieren Sie die räumliche Filtereinheit in einer Linie mit dem Emissionsstrahlengang und achten Sie darauf, dass die erste Fokussierlinsenfassung auf dem Emissionsstrahl zentriert ist. In diesem Fall wurde eine räumliche Filtereinheit mit einer Lochblendengröße von 100 Mikrometern ausgewählt. Montieren Sie als Nächstes ein Objektiv mit kurzer Brennweite in das Gerät und schieben Sie die Z-Translationshalterung, bis ein klarer Fokus auf der Lochblende zu sehen ist.

Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gerät entlang der vom Leuchtstoffstrahl vorgegebenen geraden Linie ausgerichtet ist. Klemmen Sie das Gerät an das Steckbrett. Stellen Sie nun mit den Einstellknöpfen am Translationstisch die beiden Achsen ein, um eine 2D-Suche über die Lochblendenoberfläche durchzuführen und den Punkt zu finden, an dem das Fluoreszenzsignal durch die Lochblende maximiert ist.

Platzieren Sie als Nächstes die Beschichtungslinse auf der Käfighalterung. Suchen Sie nach der Lochblende mit einer Visitenkarte das Fluoreszenzion, das durch die konfokale Einheit geht, und schieben Sie die Beschichtungslinse entlang der Stifte, bis die emittierte Fluoreszenz so gut wie möglich zusammengetragen ist. Richten Sie die Fotomultiplikator-Röhrenbaugruppe ein. Platzieren Sie eine Linse mit einer Brennweite von 50 Millimetern im Fluoreszenz-Emissionsstrahlengang und suchen Sie ihren Brennpunkt.

Markieren Sie diese Position auf dem Steckbrett. Schalten Sie nun den Laser komplett aus und positionieren Sie den Photomultiplier-Tubus so, dass sich sein Fenster so nah wie möglich am markierten Brennpunkt befindet. Verbinden Sie dann die Baugruppe mit verstellbaren Objektivtuben mit der Fokussierlinse.

Wickeln Sie dunkles Klebeband um alle freiliegenden Strahlengänge, die der Lochblende folgen, schalten Sie den Laser ein und halten Sie seine Leistung extrem gering. Schalten Sie die Photomultiplier-Röhre ein und lesen Sie vorsichtig ihre Spannung am Oszilloskop ab. Wenn die Laserintensität erhöht wird, erhöhen Sie die Spannung, bis eine spitzenähnliche Anzeige und/oder ein DC-Offset auf dem Oszilloskopbildschirm zu sehen ist.

Bestätigen Sie, dass dieses Signal tatsächlich von der Fluoreszenz herrührt, indem Sie die Laserleistung ausschalten oder den Strahlengang blockieren, um einen Signalverlust zu beobachten. Richten Sie abschließend die Lochblende iterativ aus, um ein maximales Signal auf dem Oszilloskop zu erzielen. Indem Sie zuerst die Z-Position der Fokussierlinse manipulieren und dann den YZ-Translationstisch einstellen, ist die Hardware des Videoratenmikroskops komplett.

Schalten Sie zuerst die Fotovervielfachungsröhre aus. Schließen Sie nun die Spiegel, die benutzerdefinierten Steuerplatinen und den Computer an, wie im beigefügten schriftlichen Protokoll dargestellt. Dieses System kann für die Durchführung der konfokalen Raster-Mikroendoskopie angepasst werden.

Wenn Sie den Tisch durch einen Faserhaltetisch ersetzen, lesen Sie bitte den Begleittext oder die Details. Das fertige aufrechte konfokale Rastermikroskop und Mikroendoskop sollte wie hier gezeigt aussehen. Die Laser- und Emissionsstrahlen wurden als Leitfaden für das Auge gezeichnet.

Während der Mikroendoskopie hält eine Faserhalterung die Bildfaser für Experimente an Ort und Stelle. Diese Faserhalterung kann für den Einsatz leicht durch einen XY-Tisch ersetzt werden. Eine aufrechte Mikroskopplattform, die hier gezeigt wird, ist ein repräsentatives Testbild, das von einem kleinen M aufgenommen wurde, das auf eine weiße Visitenkarte gedruckt wurde, wobei eine Video-Rate-Framegrabber-Karte verwendet wurde, um Bilder aus dem eingehenden Signal zu erzeugen. Gebleicht.

Weißes Papier enthält Fluor-Kräfte, die leicht durch UV- und blaues Licht angeregt werden, was zu einem hellen Hintergrund hinter dem Dunkeln führt. Der Buchstabe M und ein Emissionsfilter, der auf 515 Nanometer zentriert ist, wurden gewählt, um diese Fluoreszenzemission zu sammeln. Eine geringfügige Verzerrung des Bildes ist vor allem im Bereich der seitlichen Ränder des Bildrahmens zu beobachten.

Diese Verzerrung resultiert aus der sinusförmigen Abtastcharakteristik des Acht-Kilohertz-GVO-Spiegels und wird im Begleitdokument ausführlich erörtert. Dieser Film zeigt Beispieldaten zur Videorate, die durch das Scannen einer Visitenkarte erhalten wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein konfokales Rastermikroskop mit Videorate baut und ausrichtet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Laserlicht äußerst gefährlich sein kann und dass bei dieser Prozedur immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Entfernen aller reflektierenden Schmuckstücke sowie das Vermeiden von Arbeiten auf Augenhöhe mit der Strahllinie.