Ein PCR-basierte Genotypisierung Methode, zwischen Wildtyp-und Ziersorten Unterscheiden von Imperata cylindrica

Das Hauptziel dieses Verfahrens ist es, ein kostengünstiges und schnelles molekulares Genotypisierungsprotokoll bereitzustellen, das zwischen Sorten von Retta cylindrica, typischerweise als Gongras bezeichnet, unterscheiden kann, die nicht allein durch die Morphologie unterschieden werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst Gewebe von einer interessierenden Gongrassorte identifiziert und isoliert wird. Der nächste Schritt besteht darin, Kern- und Gips-DNA aus dem gesammelten Gewebe zu extrahieren.

Als nächstes wird eine Polymerase-Kettenreaktion an der extrahierten DNA durchgeführt, wobei sortenspezifische Primer verwendet werden, die auf Sequenzunterschiede in der LF-Region der PLAs abzielen, sowie geeignete Positiv- und Negativkontrollen. Der letzte Schritt besteht darin, bei jeder der vier PCR-Reaktionen eine Gelelektrophorese durchzuführen, um die amplifizierten PCR-Produkte zu visualisieren. Letztendlich wird die Sorte des gesammelten Gongrases durch die Analyse der daraus resultierenden sortenspezifischen PCR-Produktverbote für das Gel bestimmt. Invasive Pläne kosten die Vereinigten Staaten jährlich etwa 3,4 Milliarden und schaden sowohl den landwirtschaftlichen als auch den natürlichen Ressourcen erheblich

Der Wildtyp Imparato Electrica, auch bekannt als Cogan, Gras gehört zu den Top 10 der schlimmsten invasiven Unkräuter der Welt. Cogan-Gras bildet eine schnelle Ausbreitung in Mono-Beständen, die die einheimische Vegetation verdrängen, und im Gegenzug die Tiere, die von dieser einheimischen Vegetation abhängen. GaN-Gras befällt derzeit 490 Millionen Hektar weltweit und etwa 500.000 Hektar in den Vereinigten Staaten, und die Ziersorte von Ti von Tus Centrica wird unter dem Namen Tus Centrica weit verbreitet. Arbra, rote Baren und japanisches Blut, wie wir es JBG nennen werden. Diese Sorte ist angeblich steril und nicht-invasiv und wird wegen ihrer rot gefärbten Blätter als wünschenswert angesehen.

Unter bestimmten Bedingungen kann japanisches Blutgras lebensfähige Samen produzieren und in eine rein grüne Form zurückkehren, die von Wildtyp-Cogan-Gras nicht zu unterscheiden ist. Wie Sie sehen können, besitzen beide grüne Blätter und sind größer als herkömmliche Ziersorten mit größeren Blättern. Darüber hinaus haben die Revert- und Wildtyp-Pflanzen größere Rhizome und die Ziersorte erhöht ihr asexuelles Fortpflanzungspotenzial.

Die Umkehrung erfolgt zur Identifizierung allein durch die Morphologie. Eine schwierige Aufgabe. Molekulare Methoden bieten die Möglichkeit, invasive Pflanzen und Pflanzenmaterialien, die mit normalen visuellen Mitteln nicht identifiziert werden können, genau zu unterscheiden.

Molekulare Methoden sind entscheidend, um die Ausbreitung und Einschleppung invasiver Pflanzen zu verhindern. Die Anwendung dieses molekularen Protokolls bietet die Möglichkeit, japanisches Blutgras genau von Kogan-Gras zu unterscheiden. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, das gleichzeitige Auftreten mit Kogan-Gras und die mögliche Bildung lebensfähiger Hybriden zu verhindern.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie dem amplifizierten Fragmentlängenpolymorphismus oder der A-FLP-Analyse und Dingen wie DNA-Sequenzierung besteht darin, dass sie eine sehr kostengünstige und schnelle molekulare Genotypisierungstechnik bietet, die den Unterschied zwischen Wildtyp-Kogan-Gras und Sorten von japanischem Blutgras leicht unterscheiden kann. Die Technik wird von Joseph Hery, einem Studenten unseres Labors, vorgeführt. Identifizieren Sie zunächst ein Exemplar von einem Standort, an dem Gongras oder japanisches Blutgras wächst und voneinander unterschieden werden muss.

Das Japanische Blutgras ist durch seine leuchtend roten Blätter leicht vom Wildtyp-Gongras zu unterscheiden. Das Japanische Blutgras Revert ist jedoch fast nicht von Kogan-Gras zu unterscheiden, da beide längere grüne Blätter, mehr Blattfläche und größere Rhizome haben als das Zier-Japanische Blutgras. Diese Methode kann auf frisches, gefrorenes und kürzlich getrocknetes Blattgewebe angewendet werden.

Wenn Gewebe für die DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt gelagert werden, ist die beste Methode, das Gewebe sofort einzufrieren und bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Wenn eine trockene Lagerung erforderlich ist, legen Sie das Taschentuch in einen Papierumschlag und lagern Sie den Umschlag in getrocknetem Kieselgel oder anderen aktiven Trockenmitteln bei Raumtemperatur. Wenn frisches Gewebe verwendet werden soll, stellen Sie sicher, dass die DNA innerhalb von drei Stunden nach der Entnahme extrahiert wird, um einen Abbau zu verhindern.

Bei diesem Verfahren wird das DNEZ plants mini kit von Kyogen gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einer geringfügigen Modifikation verwendet. Hier. Das Verfahren wurde so angepasst, dass mehr als 100 Milligramm frisches oder gefrorenes Gewebe oder mehr als 20 Milligramm getrocknetes Gewebe verwendet wird. Mahlen Sie zuerst mehr als 100 Milligramm frisches oder gefrorenes Blattgewebe oder mehr als 20 Milligramm trockenes Blattgewebe mit drei Runden flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver, indem Sie es in einem gekühlten Mörser und Stößel mahlen.

Wiegen Sie das gefrorene Pulver aus frischem oder gefrorenem Gewebe in 100 Milligramm Aliquote. Wenn Sie trockenes Blattgewebe verwenden, wiegen Sie das Pulver in 20 Milligramm Aliquot. Fahren Sie nach diesem Schritt mit der DNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines Spektralphotometers wie dem NanoDrop-Spektralphotometer-Test fort, DNA, Qualität und Quantität gute DNA-Ausbeuten sollten zwischen 50 und 150 Nanogramm pro Mikroliter liegen, mit zwei 60 über zwei 80 und 2 32 80 Verhältnissen nahe 2,0, wie gesehen. Hier.

Führen Sie die Elektrophorese mit einem Standard-1%-AROS-Gel durch. Überprüfen Sie das Vorhandensein relativ großer Banden von mehr als 10 KB ohne oder mit geringen Schlieren durch RNA-Kontamination, wenn die DNA-Konzentration hoch ist, und verdünnen Sie die Proben für die nachfolgenden Schritte auf 70 Nanogramm pro Mikroliter. Die in diesem Protokoll verwendeten PCR-Primer, die durch die roten und grünen Pfeile gekennzeichnet sind, basieren auf Sequenzunterschieden zwischen der eingegipsten LF-Spacerregion von Cogan-Gras und japanischen Blutgras-Genotypen.

Diese Unterschiede treten in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen und Insertionen und Deletionen auf, die durch die vertikalen schwarzen Pfeile gekennzeichnet sind, die die Entwicklung sortenspezifischer Primer ermöglichen. Durch die Lokalisierung der Primer an den Stellen einzigartiger Sequenzen sind die Primersequenzen im schriftlichen Teil des Protokolls für jede isolierte DNA-Probe enthalten. Richten Sie zwei 50-Mikroliter-PCR-Reaktionen in dünnwandigen 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen auf ICE ein, wobei jedes Primerset gemäß dem schriftlichen Protokoll verwendet wird. Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, kann jeder Reaktion mehr DNA hinzugefügt werden, während die Menge an nukleasefreiem doppelt destilliertem Wasser so angepasst wird, dass das Gesamtreaktionsvolumen 50 Mikroliter beträgt.

Verwenden Sie nicht mehr als fünf Mikroliter DNA oder 10 % des Gesamtvolumens pro Reaktion, da in den DNA-Proben enthaltene Verunreinigungen PCR-Reaktionen hemmen können, um sicherzustellen, dass alle PCR-Reagenzien wirken, und richten Sie die Positivkontrolle gut ein. Unter Verwendung der Positivkontrollprimer wird die Negativkontrolle mit demselben Kontrollprimersatz wie bei der Positivkontrolle eingerichtet, jedoch mit doppelt destilliertem Wasser anstelle der extrahierten DNA. Zu diesem Zeitpunkt gibt es insgesamt vier PCR-Reaktionen für jede zu testende Probe. Als nächstes führen Sie PCR-Amplifikationen in einem Thermocycler durch, der mit einem beheizten Deckel ausgestattet ist, unter Verwendung der PCR-Zyklusparameter im schriftlichen Protokoll, die Optimierung für die Prime-Knietemperatur, die Verlängerungszeiten und die Anzahl der Zyklen können in Abhängigkeit von der Qualität der DNA-Primer, der Tack-Polymerase oder der Art des verwendeten Thermocyclers erforderlich sein.

Sobald die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind, trennen Sie die PCR-Produkte auf einem 1%-Gel mit Hilfe der Standardelektrophorese. Lassen Sie die Proben bei etwa 120 Volt laufen, bis die D-Front drei Viertel der Gesamtlänge des Gels erreicht. Visualisieren Sie das Gel unter UV-Licht und untersuchen Sie die resultierenden Banden, um festzustellen, ob ein geeignetes DNA-Fragment amplifiziert wurde.

Dieses repräsentative Gel zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten, die aus Kogan-Gras, japanischem Blutgras und japanischem Blutgras-Revert-DNA-Proben gewonnen wurden, kombiniert mit Kogan-Gras und JBG-spezifischen Primern, sowie die turn-LF-Positivkontrolle und eine Negativkontrolle ohne Vorlage. Das Turn LF Positivkontroll-Primer-Set eignet sich gleichermaßen gut für Cogan-Gras, Japanisches Blutgras, Japanisches Blutgras-Revert und andere Gräser und ergibt eine Bandbreite von 890 Basenpaaren. Wenn alle PCR-Reagenzien frei von DNA-Verunreinigungen sind, führt die negative Kontrollreaktion nicht zu einem PCR-Produkt.

Wenn die DNA-Probe aus Wildtyp-Kogan-Gras gewonnen wird, führt eine PCR-Reaktion mit dem Kogan-Gras-spezifischen Primer-Set zu einer einzelnen Bande bei etwa 595 Basenpaaren, während die JBG-spezifischen Primer zu keiner Bande führen. Ebenso, wenn die DNA-Probe aus einer JBG- oder einer revertierten J-B-G-A-P-C-R-Reaktion stammt, führt die Verwendung des JBG-spezifischen Primer-Sets zu einer einzelnen Bande bei etwa 594 Basenpaaren. Während die Kogan-Gras-spezifischen Grundierungen keine Bande erzeugen.

Da JBG und revertiertes JBG eine identische Nukleinsäuresequenz haben, haben sie daher identische Bandenmuster. Die morphologischen Unterschiede zwischen JBG- und JBG-Reverts sind jedoch ziemlich offensichtlich, so dass die PCR-Ergebnisse zwar gleich sind, die JBG-Sorten jedoch auf Pflanzenebene leicht zu unterscheiden sind. Durch die DNA-Sequenzierung der PCR-Produkte können mögliche Veränderungen in den DNA-Sequenzen für verschiedene Cogan-Gras-Ökotypen identifiziert werden.

Die Entwicklung dieser Technik stellt die erste vereinfachte molekulare Methode dar, die genau zwischen Wildtyp K und Gras und der umgekehrten Form seiner Zierart, dem japanischen Blutgras, unterscheiden kann. Wir ermutigen die Benutzer dieses Protokolls, sich mit uns in Verbindung zu setzen, um die Ergebnisse zu melden, die sich aus der Verwendung dieses Protokolls ergeben. Solche geteilten Informationen werden dazu beitragen, Informationen über die Verbreitung des Japanischen Blutgrases zu erhalten.

Dies wird auch den Regulierungsbehörden des USDA helfen, fundierte Entscheidungen über Maßnahmen zu treffen, die erforderlich sein könnten, um die Ausbreitung und potenzielle Hybridisierung der hochinvasiven Cogan-Grassorten zu umgehen.