RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fremde DNA erfolgreich in Priyanka pacificus-Nematoden einzuschleusen und die Genfunktion herunterzuregulieren. Für die Transgenese beginnen Sie damit, die geeignete genomische DNA mit kompatiblen klebrigen Enden vorzubereiten.

Für die RNA-Interferenz synthetisieren Sie das Gen der Interesse mittels eines Transkriptionskits für doppelsträngige RNA. Anschließend mikroinjizieren Sie die PRIs DIANCA pacificus mit der DNA oder doppelsträngigen RNA. Untersuchen Sie die F1-Population auf das ausgewählte Markerphänotyp bei der Transgenese und selektieren Sie für das Knockdown-Phänotyp bei der RNA-Interferenz für die Transgenese.

Überwachen Sie weiterhin die Ergebnisse von F2-transgenen Würmern, um Ergebnisse zu erhalten, die spezifische Genexpressionen mittels GFP-Reporter durch Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Ray Hong von der California State University of Northridge, und diese Demonstration wird die Schritte zur genetischen Manipulation in pristi-spezifischen Nematoden erläutern. Bei neu entstehenden Modellorganismen können RNAi und Truss-Genese Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie und im Verhalten beantworten, indem sie Genfunktionen und -expressionen charakterisieren.

Personen, die neu in dieser Methode sind, profitieren davon, zu sehen, wie der Wurm auf das Injektionskissen platziert und in der korrekten Fokusebene injiziert wird, in der die go nats sichtbar sind. Im Gegensatz zu gans goad SCA spezifisch, da sich die goads dorsal kreuzen und schließlich migrieren, während sich der Nematode vom späten J4-Stadium zu erwachsenen Tieren entwickelt. Außerdem sollte genomische DNA, die mit kompatiblen Restriktionsenzymen verdaut wurde, Ihren Transgenen und dem Co-Injektionsmarker hinzugefügt werden, um Ihre Injektionsmischung herzustellen.

Das Labor von Jessica Single wird die Mikroinjektion im Fall von PRIs zur Transgenese demonstrieren. Für die Injektion sind 3D-NA-Konstrukte erforderlich, die als dominante Co-Injektionsmarker dienen. Der Zielreporter-Transgen und genomische D-N-A-D-N-A-Konstrukte werden mit kompatiblen Restriktionsenzymen digeriert. Die DNA-Konstrukte werden mithilfe eines Ethanolpräzipitationsprotokolls isoliert.

Die Injektionsmischung wird auf die in der Tabelle aufgeführten Konzentrationen eingestellt. Überprüfen Sie die Manometer-Einstellungen des Stickstoffbehälters. Geben Sie nun ein bis zwei Mikroliter der Injektionsmischung in die Nadel.

Platzieren Sie die Nadel im Mikroinjektionsmanipulator. Brechen Sie die Nadelspitze ab, indem Sie sie leicht an eine Kante einer dünngezogenen Kapillare berühren, die auf einem Objektträger platziert ist, und stellen Sie sie in eine Ruheposition. Gießen Sie nun Paraffinöl, um die Platte mit vier jungen adulten Würmern zu bedecken.

Wählen Sie einen einzelnen Wurm aus und überführen Sie ihn auf ein Injektionspad. Positionieren Sie unter dem Mikroskop den Gonaden des Wurms in Richtung der Nadel, wobei die Vulva von der Nadel wegzeigt. Senken Sie nun die Nadel in die Position des Mikroskopfelds.

Bringen Sie das obere Gonad und die Nadel in dieselbe Fokusebene. Stich vorsichtig den Wurm an und injizieren Sie die Injektionsmischung. Achten Sie darauf, dass sich die Eier in Richtung der distalen Spitze trennen, was auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.

Verschieben Sie die Nadel erneut, um die untere Gonade zu injizieren, und wiederholen Sie die Injektion. Da sich diese Gonade unterhalb des Darms befindet, ist die Verteilung der Eier nicht sichtbar, weshalb der Erfolg der Injektion schwerer einzuschätzen ist. Nach der Injektion sollte der Wurm jedoch intakt bleiben, ohne hervorstehende Gewebeteile.

Bringen Sie die Nadel wieder in die Ruheposition zurück. Geben Sie einen Tropfen M-neun-Puffer hinzu, um den Wurm mithilfe einiger OP-50-Bakterien auf einem Abstrichstäbchen zu retten. Berühren Sie den Wurm mit den OP-50-Bakterien, sodass er haften bleibt.

Überführen Sie nun den Wurm auf eine Platte mit 50-Mikroliter-Tropfen von OP50. Lagern Sie die injizierten Würmer bei 20 Grad Celsius für etwa vier Tage, um F1-Generationen zu erzeugen und wachsen zu lassen. Untersuchen Sie nun die Würmer auf das ausgewählte Phänotyp.

Einzelne F-Individuen mit dem beobachteten Phänotyp auf neue mit Saatgut bestreute Platten übertragen und bei 25 Grad Celsius lagern. Abschließend für transgene Linien einzelne F2-Individuen auf separate Platten überführen. Die nachfolgenden Generationen bei 20 Grad Celsius lagern.

Die gezielte Beeinflussung der Genfunktion auf der Organismusebene mittels RNAi und Transgenese ist ein zentraler Aspekt des P. pacificus-Modells für die evolutionäre Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu einem Wildtyp-Wurm auf der linken Seite führt die stabile transgene Linie F4 PPR L3 zu einem dominanten Roller-Phänotyp mit GFP-Expression in den Kopfneuronen. Umgekehrt erzeugt dieses RNAi-Experiment PRL-1-Mutanten, die einen vollständigen Knockdown der sonst bei der PRL-1-Roller-„Gain-of-Function“-Mutante TU92 beobachteten Rollbewegung zeigen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann jede Injektion innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen werden. Es ist wichtig zu beachten, dass alle F2-Nachkommen unabhängiger F1-transgener Roll-Linien einzeln isoliert werden müssen, um unabhängige F2-Promi-Linien zu etablieren.

Der Grund hierfür ist, dass wir eine stark variable GFP-Expression unter den F2-Linien festgestellt haben und die Weitergabe des Roller-Phänotyps nicht mit dem G-Expressionsniveau korreliert.