Name: RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie RNAi-vermittelten Gen-Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion bei Pristionchus pacificus. Diese Methoden ermöglichen funktionelle Genanalysen für evolutions- und entwicklungsbiologische Forschung.

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Die Autoren sind sehr dankbar, RJ Sommer und X Wang für die Unterstützung bei Mikroinjektion, sowie aufschlussreiche Kommentare von den anonymen Gutachtern. Diese Arbeit wird durch NIH SC2GM089602 unterstützt.

1. Transgenese: DNA-Präparation <ol><li> Dominant Co-Injektion Marker: pRL3 [PPA-prl-1 (tu92)] Die pRL3 Plasmid ist ein dominantes Co-Injektion Marker für visuell identifiziert erfolgreiche Transformation Veranstaltungen. Dieses Plasmid kodiert für eine dominante mutierte Allel (tu92) des PPA-prl-1-Gen eng mit der SQT-1 Kollagen-Gens in C. im Zusammenhang elegans und verwandelt den Wildtyp sinusförmige Bewegung in Uhrzeigersinn drehen Bewegungen entlang der Wurm den Körper Achse 1,5. Die transformierten Tier ist sehr ähnlich wie die beliebten dominanten Selektionsmarker rol-6 (su1006) in C eingesetzt elegans in den vergangenen 20 Jahren. </li><li> Ziel Reporter-Transgen: PPA-EGL-4P:: gfp Ein Gen von Interesse kann transkriptionell oder translatorisch zu einem GFP kodierende Sequenz 9 verbunden werden. In dieser Studie, die PPA-EGL-4promoter:: gfp (EGL-4, cGMP-abhängigen Proteinkinase) was verwendet werden, um festzustellen, ob ein 2 kb-Fragment vor dem Start der Übersetzung kann GFP-Expression in P. verleihen pacificus PS312. Dieses GFP-Vektor enthält eine GFP kodierende Region mit modifiziertem Introns und der Mehrzweck-PPA-rpl-23 3 'UTR Terminator 5 freundlicherweise von Xiaoyue Wang und Ralf J. Sommer (Max-Planck-Institut, Tübingen, Deutschland, EU) zur Verfügung gestellt. </li><li> Genomic DNA: PS312 Die Zugabe von Wildtyp P. pacificus PS312 genomische DNA ist erforderlich, um stabile Transgenexpression Erbe zu erhalten, insbesondere von transgenen F 1 Tiere, um ihre F 2 Nachkommen 5. Es ist noch nicht sicher, ob die genomische DNA bildet komplexe extrachromosomale Arrays mit den beiden Transgene (die Co-Injektion Marker PRL-3 und der PPA-EGL-4P:: gfp-Reporter), ähnlich denen in stabilen F 2 transgenen Linien beobachtet C. elegans 3. Um jedoch die Anforderung haben die genomische DNA und Transgene zu identica Aktienl Zusammenhalt Überhänge stark darauf hin, die Bildung von komplexen extra-chromosomale Arrays der Wirtszellen für die richtige DNA-Übertragung (gDNA hergestellt unter Verwendung von Sigma G1N10 Kit) erkennen kann. </li><li> DNA-Spaltung Restriktionsenzyme werden verwendet, um die PPA-EGL-4p linearisieren:: GFP-Vektor-DNA und klebrig Überhänge mit den Co-Injektion Marker pRL3 und PS312 gDNA zu produzieren. Mix durch Antippen, nicht vortexen. Inkubieren für eine Stunde bei 37 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> pRL3 </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10xbuffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> PstI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp </td><td> 4 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td> 10 pl </tr><tr><td> SalI (10 U / ul) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> 10x Puffer </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> Pst I und Sal I (10 U / ul) </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 100 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Mixture für Restriktionsenzymverdau. <ol start="5"><li> DNA-Fällung und Vorbereitung <ol><li> Add 01.10 Natriumacetat (3 M NaCOOCH 3 pH 5,2) und 2,5-fache des Volumens von 100% Ethanol zum verdaut Produkt, fügen Sie 20 ng / ul von Glykogen, um zu sehen Pellet leichter. </li><li> Zentrifuge bei14.000 rpm für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch Kippen langsam dem Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier, um sicherzustellen, dass die Pellets sicher ist in der unteren Ecke des Rohres und frei von Ethanol. </li><li> 1 ml 75% Ethanol. </li><li> Unmittelbar bei 14.000 rpm Spin 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand durch langsames Kippen der Zentrifugenröhrchen auf den Kopf und dann darauf tippen auf ein Tissue-Papier darauf achten, dass das Pellet es in der unteren Ecke des Rohres sicher und frei von Ethanol. </li><li> Dry Pellet im Vakuum Zentrifuge bei 14.000 rpm für 5 Minuten bei 25-30 ° C, bis es trocken und völlig frei von Ethanol. </li><li> Add 30 ul TE oder sterilem dH 2 O und lassen über Nacht bei 4 ° C vor dem Mischen kurz mit einem Vortex. </li><li> Tabelle 2 beschreibt, wie die Injektion Mischung aus jedem gereinigten DNA zur Injektion zu schaffen. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen die Mischung inspritzung, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten, um Schmutzpartikel, dass die Injektionsnadel verstopfen können zu befreien. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Genetisches Material </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> PPA-EGL-4P:: gfp (SalI) </td><td> &gt; 5 ng / ul (0.1-10ng/μl) </td></tr><tr><td> pRL3 (PstI) </td><td> &gt; 1 ng / ul </td></tr><tr><td> gDNA PS312 (PstI + SalI) </td><td> &gt; 60 ng / ul </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> ~ </td></tr><tr><td> Total: </td><td> 30 mu l </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. PPA-prl-1 Injektion Mischung 2. RNA-Interferenz: In vitro doppelsträngige RNA-Synthese <ol><li> Verwenden PCR das Gen von Interesse zu verstärken. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI) und RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3 '(PstI-Stelle) wurden verwendet, um eine 464 bp genomischen Fragment (Position 3-466) aus dem pRL3 Vektor, der die PPA-prl-1 (tu92) Allel zu verstärken. </li><li> Digest des PCR-Produkts mit BamHI und PstI. </li><li> Ligieren des Fragments an BamHI / PstI pL4440 RNAi Fütterung Vektor 2 verdaut. </li><li> Transformieren Sie die eingefügten Vektors in kompetente Zellen wachsen und sie auf Ampicillin LB-Medium-Platten (50 ug / ml). </li><li> Wählen Sie den erfolgreich eingeführten Vektors mittels PCR unter Verwendung der T7-Primer. </li><li> Verwenden Sie die T7 flankiert PCR-Produkt mit dem prl-1-Gen auf doppelsträngige RNA-dsRNA zu machen) mit der BLOCK-IT RNAi-Synthese-Kit (Invitrogen). </li><li> Die dsRNA-Konzentration ist am besten, wenn&gt; 200 ng / ul, bis zu 1 ug / ul zur Injektion. </li><li> Lagerung bei -20 ° C. Nach dem Auftauen der Mischung zur Injektion, Spin-down der Röhre bei 14.000 rpm für 5 Minuten auf der Schmutzpartikel, dass die injectio verstopfen kann losn Nadel. </li></ol> 3. Mikroinjektion: Protokoll für die Injektion von Transgenen und / oder dsRNA <ol><li> Injektionsnadeln <ol><li> Stellen Sie die Narishige Nadel-Abzieher (Modell #: PC-10) Temperatur: <ol><li> Schalten Sie unten Knopf auf "No.2 Heater". </li><li> Drehen Sie den "No.2 Heater Adj." Knopf bis Panel liest 55,0-60,0 ° C für konische Nadelspitze mit unterschiedlichen Längen. </li></ol></li><li> Drehen Sie den unteren Knopf zurück zu "Schritt 1" (Pulls Nadel in einem Schritt). </li><li> Laden Nadel in die Kammer und stellen Sie sicher, dass es sicher ist. </li><li> Drücken Sie die Schaltfläche "Start" (rote Taste) und erlauben Nadel mit allen Gewichten (dies sollte zwei identischen Nadeln in entgegengesetzte Richtungen zu machen) gezogen werden. </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus der Kammer und speichern in einer Kunststoff-Platte Kultur anstelle von Play-Doh gesichert, dass Staub auf den Nadeln zu verhindern. </li></ol></li><li> Montage-Pads <ol><li> In einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, machen Sie eine 2% Edle Agar solution durch Zugabe von 0,02 g Noble-Agar zu 1 ml H 2 O. Der Agar kann bei 4 ° C gelagert werden bis zu einem Jahr. </li><li> Nach gründlichem Mischen und Schmelzen Agar in einem Heizblock auf&gt; 88 ° C. </li><li> Mit einer 1 ml Mikropipette einen Tropfen Flüssigkeit 2% Edle Agar in die Mitte der Glasplatte (Fisher, 12 bis 544-F). </li><li> Flatten, indem eine andere Glasplatte auf der Oberseite des Tropfens. </li><li> Wiederholen Sie die "Drop Step", bis es eine Schicht von fünf Objektträger aus Glas. </li><li> Nehmen Sie jede Glasplatte, indem Sie den Glasträger sich gegenseitig. </li><li> Dry abflachen Agar-Pad auf Glasträger in einem Vakuumofen bei 70 ° C für 4 Stunden bis über Nacht (oder über Nacht bei Raumtemperatur). </li><li> Machen Sie mehrere Injection Pads und speichern für zukünftige Verwendung. </li></ol></li><li> Mikroinjektion in zwittrigen Gonaden </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Eine schematische Zeichnung des P. pacificus anatschaft. Die klare kernhaltigen Zellen sind weibliche Keimzellen (Eizellen) und die grau unterlegten Teil ist der Darm. Nur eine distale vordere Gonaden wird angezeigt, aber bemerken die beiden distalen Gonaden einander kreuzen dorsal nahe Mitte Körper. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Bilder der Mikroinjektion. (A) Die Injektion Nadelspitze im Fokus mit der rechten Linie der Kapillare gezogen Stück. Durch leichtes Berühren der Spitze der Nadel, um die Kante, sollte die Nadelspitze zu brechen unter Beibehaltung einer scharfen Spitze. (B) Die Nadel-Einsätze in den oberen Gonade knapp über den Darm Krümmung für die erste Injektion. (C) Die Nadel-Einsätze in den unteren Gonaden knapp unterhalb der gut Krümmung für die zweite Injektion. <ol start="3"><li><ol><li> Achten Sie darauf, den Kontrast und die DIC Scheren Einstellung ist ideal für das Betrachten des Hermaphroditen Keimdrüsen. </li><li> Laden 1,0-2,0 ul der Injektion Mischung in die gezogenKapillarnadel. </li><li> Stecken Sie die Nadel in die Mikroinjektion Manipulator, Manometer der Stickstoff-Tank sollte, um ideale Bedingungen (10-20 psi für 0,5-1 sec) eingestellt werden. </li><li> Break the Nadelspitze durch Berühren leicht auf Rand einer dünn gezogen Kapillare auf einer Folie (Abbildung 2A) platziert. <ol><li> Needle Leistungsschalter slide: der dünnste Teil einer Kapillare gezogen platziert auf einem Glasträger in einem Tropfen Öl </li></ol></li><li> Sobald die Nadel gebrochen ist, kann vorhanden sein, um eine Ruhelage, während Sie Ihre Wurm holen, um das Pad (P. pacificus eine 5 Minuten-Fenster für die Injektion, bevor sie trocken-out und sterben). </li><li> Mit einem Teller voller J4-jungen erwachsenen Würmer, pour genug Paraffinöl (schwer), nur alle die Würmer in OP50 Bakterienrasen. </li><li> Wählen Sie ein Wurm und legen Sie es auf die Injektion Pad. </li><li> Legen Sie die Objektträger aus Glas mit dem Wurm unter dem Mikroskop; Position des Wurms Gonade in Richtung der Nadel und der Vulva weg von der Notwendigkeitle (Abb. 2B, 2C). </li><li> Senken Sie die Nadel in die Position des Mikroskops zu sehen. </li><li> Position der Spitze Gonade und die Nadel in die gleiche Bildebene (Abbildung 2B). </li><li> Poke der Wurm sanft und Pumpe in der Injektion Mischung; ooctyes Trennung in Richtung der distalen Spitze deuten auf eine erfolgreiche Injektion (Um Transgen oder dsRNA Lieferung zu optimieren, sollten Sie bei der Injektion sehen eine Welle der Expansion in den Keimdrüsen, die bis nahe an das distale ist weiterhin tip). </li><li> Positionieren Sie die Nadel auf die untere Gonade und wiederholen Injektion injizieren, aber da diese Gonade unter dem Bauch der Verbreitung der Eizellen nicht sieht, und ist somit schwieriger zu erreichen (Abbildung 2C). </li><li> Normal aussehenden Wurm deutet auf eine erfolgreiche Injektion nach der Injektion; sollte es keine beschädigten Gonaden werden (ragt aus der Vulva oder tauchte in der Körperhöhle). </li><li> Stecken Sie die Nadel wieder in Ruhestellung. </li><li> Bereiten Sie den Wurm zu retten. </li><li> Fügen Sie einTropfen (0,5 ul) M9-Puffer auf das Pad, wo das injizierte Wurm platziert wird. </li><li> Mit einigen OP50 Bakterien auf Ihre Wahl, berühren Sie den Wurm mit dem OP50, und es sollte halten. Wir verwenden keine Mund pipettieren. </li><li> Setzen Sie den Wurm auf die Platte mit 50 ul Flecken OP50 ausgesät, können 2-4 Würmer auf solchen Platten gerettet werden. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für Transgenese <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage, um Eier zu legen und aufwachsen F 1. </li><li> Screen-Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für Transgenese Suche nach rollende Tiere Ausdruck der PPA-prl-1 dominante Marker). </li><li> Wählen Sie einzelne unabhängige F 1 's Tiere mit dem beobachteten Phänotyp zu neuen ausgesät Platte und lagern bei 25 ° C; dieser Temperatur fördert die Bildung von stabilen Linien von F 1' s. </li><li> Einzel-F 2 aus unabhängigen F 1-Linien. Individuelle F 2 2 Zeilen pro verwandelt F 1 Tier. </li><li> Shop nachfolgenden Generationen bei 25 ° C. </li><li> Die Übertragungsrate der Rollen bleibt in der Regel nach dem F 4-Generation konstant, so ist es zu dieser Zeit notwendig, um die Expression des Ziel-Transgen (PPA-EGL-4P:: gfp) ermitteln für jede einzelne Linie. GFP-Expression kann nicht mit dem Ausmaß der Penetranz der dominanten Rolle Phänotyp korrelieren. </li></ol></li><li> Post-Injektion Storage &amp; Screening für RNAi-Phänotypen <ol><li> Shop injiziert Würmer (P 0) bei 20 ° C für ca. 4 Tage zu verlegen und zu wachsen F 1. </li><li> Screen-F 1 Würmer am vierten Tag für ausgewählte Phänotyp (Um-Bildschirm für RNAi-Knockdown Phänotyp, suchen Sie nach penetrant Phänotypen, die mit dem Verlust der Ziel-Gen-Aktivität in Verbindung gebracht werden, kann in unserem Fall den Verlust des PPA-prl-1 Phänotyp). </li><li> Nach unserer Erfahrung ist die nicht-roller Knockdown Phänotyp in&gt; 97% der F 2 verloren. </li></ol></li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Ergebnis der Transgenese <table border="1"><tbody><tr><td> Session </td><td> Injected P 0 </td><td> F 1 Rollers </td><td> % Transgenen F 2 </td><td> Durchschnittliche% Transmission nach F 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 2 </td><td> (Linie 1) 0% (Linie 2) 13% </td><td> NA 13% ± 10 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 40 </td><td> 1 * </td><td> (Linie 3) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 40 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 4) 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 20 </td><td> 0 </td><td> 0% </td><td> NA </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 40 </td><td> 1 </td><td> (Linie 5) 26% </td><td> 22% ± 10 </td></tr></tbody></table> * Eine männliche Rolle, nicht überschreiten; NA: Nicht anwendbar . Tabelle 3 Ergebnisse der injizierten PS312 mit PPA-EGL-4P:: gfp (Sal I verdaut), pRL3 (Rolle) (Pst I verdaut) und gDNA PS312 (PstI und SalI verdaut). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 (A) Wildtyp (B, C) ​​eine stabile F 4 pRL3; PPA-EGL-4p.:: Gfp transgene Linie zeigt den Kopf Neuron GFP-Expression. 2. Ergebnis der RNA-Interferenz <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3270/3270fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. RNA injiziert prl-1-Mutantenzeigen komplette Knockdown von "rollenden" Fortbewegung. (A) prl-1 Rolle gain-of-function-Mutante tu92. (B) prl-1-Mutanten weisen eine normale Wildtyp-Haltung und Bewegung "abgerissen". (C) injiziert prl-1 (unten) hat auch mehr Körper als prl-1-Mutante (oben). (D) Die mehr Körper injiziert prl-1 (unten) ist auch mehr als der Wildtyp PS312 (oben). Je länger Körper Phänotyp wurde auch in den rol-5 (SQT-1) RNAi Knockdown von C beobachtet elegans N2 (Daten nicht gezeigt). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> rollen </td><td> Nicht-roll </td></tr><tr><td> Ein prl-1 dsRNA (200 ng / ul) </td><td> 13 </td><td> 21 </td></tr><tr><td> B prl-1 dsRNA (1000 ng / ul) </td><td> 9 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Steuerung </td><td> 20 </td><td> 2 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. PPA-prl-1 dsRNA Injektionen. (A) [dsRNA] = 200 ng / ul; (B) [dsRNA] = 1000 ng / ul. P = 0,0019 und 0,041 von Exact-Test nach Fisher, zweiseitig, für 200 und 1000 ng / ul Injektionen, jeweils.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

P. pacificus Populationen sind in enger Zusammenarbeit mit verschiedenen Skarabäus Arten weltweit gefunden und ist ein Modell, Nematoden der Mitte zwischen frei lebenden und Nematoden. Die Stärke des P. pacificus als ein Modell Organismus lag in der Integration seiner genetischen und physikalischen Karten, die positionelle Zuordnung von Mutanten aus unvoreingenommene freuen genetischen Screens isoliert zu fördern (dh nicht nur für Kandidatengene zuvor in C. elegans charakterisiert) <s...

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt: </th><th> Catalog #: </th><th> Lieferant: </th></tr><tr><td> DMI3000 Injection Mikroskop </td><td> DMI3000 </td><td> Leica </td></tr><tr><td> Mikroinjektor Manipulator (Direct Drive) </td><td> Narashige BC-3 Kugelgelenk </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Needle Puller </td><td> Narashige PC-10 </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> Mikroinjektor ™ All-Digital Multi-Druck-System </td><td> Narashige Minj-D </td><td> Tritech Forschung </td></tr><tr><td> GeneElute ™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit </td><td> G1N70 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> pJet Cloning Jet-Set </td><td> K1231 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> GeneJET Plasmid Miniprep Kit </td><td> K0502 </td><td> Fermentas </td></tr><tr><td> DNA Clean &amp; Concentrator ™ </td><td> D4005 </td><td> Zymo Forschung </td></tr><tr><td> BLOCK-IT ™ RNAi TOPO ® Transcription Kit </td><td> K3500-01 &amp; K3650-01 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Difco ™ Agar Edle </td><td> DF0142-15-2 </td><td> Fisher Wissenschaftlich </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas (1,5 bis 0,16 bis 0,19 mm dick, Größe: 50 x 45mm) </td><td> 12 bis 554-F </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Glaskapillaren (Filament) </td><td> 615000 </td><td> AM-Systeme </td></tr><tr><td> Paraffinöl (Heavy) </td><td> O122-1 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> P386-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> AC20651-5000 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BP3581 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> M80-500 </td><td> Fisher Scientific </td></tr></tbody></table>

rnai-vermittelte gene knockdown und transgenese durch mikroinjektion in die necromenic nematode pristionchus pacificus</em

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Zwar ist es immer günstiger für neue Modell-Organismen vollständig sequenzierten Genomen zu erhalten, weitere eingehende Genfunktion und Expressionsanalysen durch RNA-Interferenz und stabile Transgenese beschränkt bleiben in vielen Arten aufgrund der besonderen Anatomie und molekulare Zellbiologie des Organismus. Zum Beispiel haben außerhalb der Krone Gruppe Caenorhabditis dass Caenorhabditis elegans 3, stabil übertragen transgenen Linien in nicht-Caenorhabditis Arten gehören nicht in dieses scheinbare Stamm (Nematoda) berichtet worden, mit Ausnahme der Zwergfadenwurm 4 und Pristionchus pacificus 5. Zur Erleichterung der wachsenden Rolle von P. pacificus in das Studium der Entwicklung, Evolution und Verhalten 6-7, beschreiben wir hier die aktuellen Methoden zur Mikroinjektion zur Herstellung transgener Tiere und Gen-knock down von RNAi nutzen. Wie die Keimdrüsen <em&gt; C. elegans und die meisten anderen Nematoden, die Keimdrüsen von P. pacificus ist syncitial und in der Lage Einbeziehung DNA und RNA in die Oozyten, wenn sie durch direkte Mikroinjektion geliefert. Im Gegensatz zu C. elegans jedoch stabil transgene Erbschafts-und somatische Expression in P. pacificus erfordert die Zugabe von selbst genomischer DNA mit Restriktionsendonukleasen komplementär zu den Enden der Ziel-Transgenen und Koinjektions Marker 5 verdaut. Die Zugabe von Carrier genomische DNA ist vergleichbar mit der Forderung nach Transgenexpression in Zwergfadenwurm 4 und in den Keimzellen von C. elegans. Es ist jedoch nicht klar, ob die spezifischen Anforderungen für die Tiere eigene genomische DNA ist, weil P. pacificus soma ist sehr effizient zum Schweigen zu nicht-komplexe multi-copy-Gene oder extrachromosomale Arrays in P. pacificus benötigen genomischen Sequenzen für die ordnungsgemäße Montage Kinetochor während der Mitose. Die ventralen Migration des zweiarmigen (didelphic) Gonaden in Hermaphroditen erschwert die Fähigkeit, sowohl Gonaden in einzelnen Würmer 8 zu injizieren. Wir zeigen auch die Verwendung von Mikroinjektion den Zuschlag eine dominante Mutante (roller, tu92) durch die Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in den Keimdrüsen zu Non-Rolling F 1 Nachkommen zu erhalten. Im Gegensatz zu C. elegans, aber wie die meisten anderen Nematoden, P. pacificus PS312 ist nicht empfänglich für systemische RNAi über Fütterung und Tränkung und daher dsRNA müssen durch Mikroinjektion in die syncitial Gonaden angewendet werden. In dieser aktuellen Studie hoffen wir, die Mikroinjektion Prozess benötigt wird, um ein PPA-EGL-4 Promotor verwandeln beschreiben:: GFP-Reporter und Knockdown eine dominierende Rolle prl-1 (tu92)-Mutante in einer visuell informative Protokoll.

In Modell-Organismen, kann Transgenese manipulieren Genfunktionen während RNAi kann Knockdown spezifische mRNA-Transkripte 1-2. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Techniken benötigt, um stabil zu übertragen DNA und vorübergehend doppelsträngige RNA in die necromenic Nematoden Einführung illustrieren<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt; Für ein Studium in der Evolution, Entwicklungs-und Verhaltensbiologie.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Obwohl es für aufstrebende Modellorganismen zunehmend erschwinglich wird, vollständig sequenzierte Genome zu erhalten, bedarf es weiterer eingehender Untersuchungen zur Genfunktion und -expression ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fremde DNA erfolgreich in Priyanka pacificus-Nematoden einzuschleusen und die Genfunktion herunterzuregulieren. Für die Transgenese beginnen Sie damit, die geeignete genomische DNA mit kompatiblen klebrigen Enden vorzubereiten.Für die RNA-Interferenz synthetisieren Sie das Gen der Interesse mittels eines Transkriptionskits für doppelsträngige RNA. Anschließend mikroinjizieren Sie die PRIs DIANCA pacificus mit der DNA oder doppelsträngigen RNA. Untersuchen Sie die F1-Population auf das ausgewählte Markerphänotyp bei der Transgenese und selektieren Sie für das Knockdown-Phänotyp bei der RNA-Interferenz für die Transgenese.Überwachen Sie weiterhin die Ergebnisse von F2-transgenen Würmern, um Ergebnisse zu erhalten, die spezifische Genexpressionen mittels GFP-Reporter durch Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Hallo, ich bin Ray Hong von der California State University of Northridge, und diese Demonstration wird die Schritte zur genetischen Manipulation in pristi-spezifischen Nematoden erläutern. Bei neu entstehenden Modellorganismen können RNAi und Truss-Genese Schlüsselfragen in der Entwicklungsbiologie und im Verhalten beantworten, indem sie Genfunktionen und -expressionen charakterisieren.Personen, die neu in dieser Methode sind, profitieren davon, zu sehen, wie der Wurm auf das Injektionskissen platziert und in der korrekten Fokusebene injiziert wird, in der die go nats sichtbar sind. Im Gegensatz zu gans goad SCA spezifisch, da sich die goads dorsal kreuzen und schließlich migrieren, während sich der Nematode vom späten J4-Stadium zu erwachsenen Tieren entwickelt. Außerdem sollte genomische DNA, die mit kompatiblen Restriktionsenzymen verdaut wurde, Ihren Transgenen und dem Co-Injektionsmarker hinzugefügt werden, um Ihre Injektionsmischung herzustellen.Das Labor von Jessica Single wird die Mikroinjektion im Fall von PRIs zur Transgenese demonstrieren. Für die Injektion sind 3D-NA-Konstrukte erforderlich, die als dominante Co-Injektionsmarker dienen. Der Zielreporter-Transgen und genomische D-N-A-D-N-A-Konstrukte werden mit kompatiblen Restriktionsenzymen digeriert. Die DNA-Konstrukte werden mithilfe eines Ethanolpräzipitationsprotokolls isoliert.Die Injektionsmischung wird auf die in der Tabelle aufgeführten Konzentrationen eingestellt. Überprüfen Sie die Manometer-Einstellungen des Stickstoffbehälters. Geben Sie nun ein bis zwei Mikroliter der Injektionsmischung in die Nadel.Platzieren Sie die Nadel im Mikroinjektionsmanipulator. Brechen Sie die Nadelspitze ab, indem Sie sie leicht an eine Kante einer dünngezogenen Kapillare berühren, die auf einem Objektträger platziert ist, und stellen Sie sie in eine Ruheposition. Gießen Sie nun Paraffinöl, um die Platte mit vier jungen adulten Würmern zu bedecken.Wählen Sie einen einzelnen Wurm aus und überführen Sie ihn auf ein Injektionspad. Positionieren Sie unter dem Mikroskop den Gonaden des Wurms in Richtung der Nadel, wobei die Vulva von der Nadel wegzeigt. Senken Sie nun die Nadel in die Position des Mikroskopfelds. Bringen Sie das obere Gonad und die Nadel in dieselbe Fokusebene. Stich vorsichtig den Wurm an und injizieren Sie die Injektionsmischung. Achten Sie darauf, dass sich die Eier in Richtung der distalen Spitze trennen, was auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.Verschieben Sie die Nadel erneut, um die untere Gonade zu injizieren, und wiederholen Sie die Injektion. Da sich diese Gonade unterhalb des Darms befindet, ist die Verteilung der Eier nicht sichtbar, weshalb der Erfolg der Injektion schwerer einzuschätzen ist. Nach der Injektion sollte der Wurm jedoch intakt bleiben, ohne hervorstehende Gewebeteile.Bringen Sie die Nadel wieder in die Ruheposition zurück. Geben Sie einen Tropfen M-neun-Puffer hinzu, um den Wurm mithilfe einiger OP-50-Bakterien auf einem Abstrichstäbchen zu retten. Berühren Sie den Wurm mit den OP-50-Bakterien, sodass er haften bleibt.Überführen Sie nun den Wurm auf eine Platte mit 50-Mikroliter-Tropfen von OP50. Lagern Sie die injizierten Würmer bei 20 Grad Celsius für etwa vier Tage, um F1-Generationen zu erzeugen und wachsen zu lassen. Untersuchen Sie nun die Würmer auf das ausgewählte Phänotyp. Einzelne F-Individuen mit dem beobachteten Phänotyp auf neue mit Saatgut bestreute Platten übertragen und bei 25 Grad Celsius lagern. Abschließend für transgene Linien einzelne F2-Individuen auf separate Platten überführen. Die nachfolgenden Generationen bei 20 Grad Celsius lagern.Die gezielte Beeinflussung der Genfunktion auf der Organismusebene mittels RNAi und Transgenese ist ein zentraler Aspekt des P. pacificus-Modells für die evolutionäre Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu einem Wildtyp-Wurm auf der linken Seite führt die stabile transgene Linie F4 PPR L3 zu einem dominanten Roller-Phänotyp mit GFP-Expression in den Kopfneuronen. Umgekehrt erzeugt dieses RNAi-Experiment PRL-1-Mutanten, die einen vollständigen Knockdown der sonst bei der PRL-1-Roller-„Gain-of-Function“-Mutante TU92 beobachteten Rollbewegung zeigen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann jede Injektion innerhalb von fünf Minuten abgeschlossen werden. Es ist wichtig zu beachten, dass alle F2-Nachkommen unabhängiger F1-transgener Roll-Linien einzeln isoliert werden müssen, um unabhängige F2-Promi-Linien zu etablieren.Der Grund hierfür ist, dass wir eine stark variable GFP-Expression unter den F2-Linien festgestellt haben und die Weitergabe des Roller-Phänotyps nicht mit dem G-Expressionsniveau korreliert.

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Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Herstellung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie die Mikroinjektion verwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Genbearbeitung auf CRISPR-Basen einzuführen.

Gonaden-Mikroinjektion: Eine Methode zur direkten Verabreichung von Verbindungen in die Keimbahn von C. elegans

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

RNA-Interferenz ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in bestimmten Entwicklungsstadien. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Umsetzung dieser Technik im Wassertauchkäfer Thermonectus marmoratus, vom Erwerb von Gensequenzen bis zum Knockdown von Genen, die Struktur oder Verhalten beeinflussen.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

Hier beschreiben wir Methoden für effiziente Puppen- und Erwachseneninjektionen in Nasonia vitripennis als zugängliche Alternativen zur Embryo-Mikroinjektion, die eine funktionelle Analyse von Genen von Interesse entweder mit RNA-Silencing über RNA-Interferenz (RNAi) oder Gen-Knockout durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing ermöglichen.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

Entomopathogene Nematoden leben in Symbiose mit Bakterien und zusammen infizieren sie erfolgreich Insekten, indem sie ihr angeborenes Immunsystem untergraben. Um die Erforschung der genetischen Grundlagen der Nematodeninfektion zu fördern, werden Methoden zur Erhaltung und genetischen Manipulation entomopathogener Nematoden beschrieben.

Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.

CRISPR-Cas9-basierte Mutagenese im entomopathogenen Nematoden Steinernema hermaphroditum und die Erhaltung mutanter Linien

Erfahren Sie RNAi-vermittelten Gen-Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion bei Pristionchus pacificus. Diese Methoden ermöglichen funktionelle Genanalysen für evolutions- und entwicklungsbiologische Forschung.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown und Transgenese durch Mikroinjektion in die Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

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