Name: A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus Anopheles Spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle DNA-Extraktion aus Anopheles-Mücken mittels Chelex-Harz für Malariaforschung. Diese Methode ermöglicht PCR-basierte Artidentifikation und Parasitengenotypisierung in unter 40 Minuten.

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Die Autoren danken den Chefs, Häuptlinge und Gemeinden Macha für ihre unwaveing ​​Zusammenarbeit während mosquito Feldprobe Sammlungen. Dr. Doug Norris und Rebekka Kent angeboten unschätzbares Fachwissen auf dem Aussalzen Protokoll. Diese Arbeit wurde von der Johns Hopkins Malaria Research Institute Pilot-Grant-System finanziert. Mosquito und Parasiten DNA-Labor Standards wurden freundlicherweise von MR4, American Type Culture Collection &amp; gespendet.

Ein. Vorbereitende Präparation Mosquito Proben <ol><li> Ort Mücke auf einem kleinen Schneiden von Parafilm und Halterung am Binokular. </li><li> Cover in Tropfen entionisiertes Wasser, um Gewebe zu erweichen. </li><li> Einzuschneiden die Mücke Karkasse genau an der Verbindungsstelle zwischen dem Thorax und Abdomen, damit Nicking den Kopf und Thorax von der abdominalen Abschnitt. </li><li> Übertragen Sie jede seziert mosquito Abschnitt in einem sauberen autoklaviert 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Moskito-ID-Nummer Details und entsprechend gekennzeichnet, um Körper Abschnitt (zB &quot;m&quot; für Mitte-gut Abschnitt; &quot;ht&quot; für Kopf und Thorax-Bereich) bezeichnen prelabeled. </li><li> Entsorgen Parafilm und wischen Mikroskoptisch mit 70% Alkohol angefeuchtet Kimwipe vor der Verarbeitung der nächsten Mücke. </li></ol> 2. DNA Extraktion aus Mosquito Proben <ol><li> Je 20 ul entionisiertem Wasser in Probenröhrchen und Pipettenspitze, die untergetaucht mosquito Abschnitt in eine un schleifeniform Suspension. </li><li> Fügen Sie 100 ul autoklaviertem 1X PBS / 1% Saponin Lösung Probenhomogenat und durch vorsichtiges momentanen Vortexen. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. </li><li> Pellet in 100 ul 1X PBS. </li><li> Zentrifugieren bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. </li><li> Durch leichtes Vortexen (5 sec), Pellet in 75 ul sterilem entionisiertem Wasser und 25 ul 20% w / v Chelex-100 Harzsuspension in deionisiertem Wasser. </li><li> Pierce Loch im Deckel der Probenröhrchen mit sterilen 23G Injektionsnadel in Bunsenbrenner geflammt. </li><li> Boil Probensuspension im Wasserbad auf schwimmenden Zahnstange (oder im Heizblock) für 10 min. </li><li> Zentrifugieren bei 20.000 × g für 1 Min. und Übertragung anschließenden DNA-Lösung in prelabeled Lagervials zur Verwendung als Matrize in PCR-Anwendungen. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum Genotypisierung und Anophelesspp. Molecular Identification <ol><li> Fügen Sie 2,5 ul des Chelex DNA-Extrakt in 25 ul PCR Reaktionen auf DNA-Qualität 11 kontrollieren, zu identifizieren Anopheles Arten 10 und dem Genotyp P. falciparum 12 Mitte Darm und Speicheldrüsen Infektionen. </li><li> Um Amplikon Ertrag, vor allem für P. zu maximieren falciparum Detektion umfassen 1.5X Rinderserumalbumin (BSA) in dem PCR-Assay. Die folgende Reaktion Zusammensetzung wird empfohlen: (2,5 ul Vorlage, 0,25 pM Primer, 1,5 uM Magnesiumchlorid, 200 uM dNTPs, 1X PCR-Puffer, 1,5 X BSA und 1.0U Taq DNA-Polymerase, in 25 ul Volumen). </li><li> Um DNA-Qualität im Extrakt zu überprüfen, zu verstärken Region der Arthropoden mitochondrialen Nicotinamidadenindinucleotid Dehydrogenase (NADH)-Untereinheit 4 (ND4) Gen (Primer ND4FW [5&#39;-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] und ND4RV [5&#39; -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; erwarten Produkt 400bp) 11,13. </li><li> Um Anopheles gambia differenzierene sl. Geschwisterart (An. gambiae ss und An. arabiensis only), verstärken flankierenden SNPs in der intergenen Spacer (IGS) Region (Primer UN [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; erwarten Produkt 390bp Ein gambiae ss, 315bp Ein arabiensis) 10,11. </li><li> Für die Typisierung P. falciparum Antifolat Arzneimittelresistenz Polymorphismen, führen verschachtelten PCR zur ​​Region flankieren Aminosäurecodons 108, 51, 59, 16 und 164 in der Parasit Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen amplifizieren: Primäre Runde Primer: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] und M5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] Sekundäre Runde Primer: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] mit F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] Oder F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] mit M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). Auch verstärken enthaltenden Bereich Aminosäurecodons 436, 437, 540, 581 And 613 in der P. falciparum Dihydropteroat Synthetase (DHPS)-Gen: Primäre Runde Primer R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] mit R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; Sekundäre Runde Primer J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] mit K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] Oder K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] mit K /, Oder L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] mit L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li> Gegenstand 4 ul Amplikon zu allelspezifischen Restriktionsenzym Aufschlüsse in 30 ul Reaktionen nach den Anweisungen des Herstellers zum Aufspüren Antifolat Medikamentenresistenz-assoziierten Polymorphismen 12. </li><li> Betreff 5 ul PCR Amplikon (oder 15 ul Restriktionsverdau) pro Spur von Ethidiumbromid-gefärbten 2% Agarosegel-Elektrophorese (100 - 120V) und visualisieren Banden unter UV Durchleuchtung. </li></ol>

<ol><li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea%3A+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N%27Zerekore%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54(2007).</li>
<li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulphadoxine%2Fpyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon%3A+a+randomized+trial+to+guide+national+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31(2008).</li>
<li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li>
<li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province%2C+Solomon+Islands%3A+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.+%22%5BJournal%5D)">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254(2010).</li>
<li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410(2009).</li>
<li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV%2C+TB%2C+and+malaria+programs%3A+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems%2C+clinical+research%2C+and+service+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li>
<li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania%3A+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li>
<li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+agenda+for+malaria+eradication%3A+vector+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401(2011).</li>
<li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li>
<li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li>
<li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li>
<li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die vereinfachte Chelex hier vorgestellte Methode ermöglicht die Extraktion der Qualität Anopheles spp und P. falciparum DNA aus Moskito-Proben zugänglich diverse PCR-Anwendungen. Diese Technik kann für die molekulare Identifizierung von Malariavektorkontrollschulung Mücken und Überwachung der Arzneimittel-resistente P. eingesetzt werden falciparum Allele in Mücken National Malaria Control Programs. Die Vorteile des vereinfachten Chelex Technik gehören Einfachheit, weniger Reagenzien und damit Kosten, Sicherheit und kürzere Bearbeitungszeiten (37 min) als Standard-Protokolle wie das Aussalzen Verfahren 10 (2 hr 47 min und einer Nacht Schritt, Tabelle 1). Die oben genannten Vorteile und minimale Reagenz Anforderungen (3 Reagenzien) auf den aktuellen Standard-Protokoll (10 Reagenzien, Tabelle 1) 11,15 gegenüber, machen die vereinfachte Chelex Protokoll besonders freundlich zu endemischen Land Laboratorien, in denen eine konstante ReagenzSupply Chain ist es oft schwierig zu pflegen. Eine Beschränkung des Verfahrens ist, dass wie die Standard-Protokoll, auch war Gegenstand PCR-Inhibitoren bekannt, in der Mücke Integument 16 auftreten. Jedoch ist dies ohne weiteres durch Einschluß von BSA in den Assays erleichtert. BSA wurde auch erfolgreich als Verstärkung Enhancer gegen Inhibitoren in anderen PCR-Anwendungen 17,18 beschäftigt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 trockenen mesh </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> New England Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protokoll zur dna-extraktion aus<em&gt; anopheles</em&gt; spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemischen Ländern übernehmen zunehmend molekulare Werkzeuge für die effiziente Typisierung, Identifizierung und Überwachung gegen Malariaparasiten und Vektor Mücken, als integralen Bestandteil ihrer Bekämpfungsprogramme 1,2,3,4,5. Für eine nachhaltige Etablierung dieser genauen Ansätze in Operations Research zur Malaria-Kontrolle und Beseitigung Bemühungen, einfache und kostengünstige Methoden, mit sparsamen Reagenz und Anforderungen an die Ausrüstung zu stärken sind wesentliche 6,7,8. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Chelex-basierte Technik zur Gewinnung von Malaria-Parasiten und Vektor-DNA aus dem Feld gesammelt mosquito Proben. Wir morphologisch identifizierten 72 Anopheles gambiae sl. Von 156 Moskitos durch Pyrethrum Spray fängt in den Schlafräumen der Haushalte innerhalb eines 2.000 km 2 Nähe des Malaria Institut Macha erfasst. Nach Dissektion, die Kopf und Thorax aus dem Bauch zu trennen für alle 72 Anopheles gambiae sl. Mücken, wurden die beiden Abschnitte einzeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen platziert und untergetaucht in 20 ul entionisiertem Wasser. Verwendung einer sterilen Pipettenspitze wurde jeder Abschnitt separat Mücken zu einer gleichmäßigen Suspension in entionisiertem Wasser homogenisiert. Der anschließenden Homogenat aus jeder Mücke Abschnitt wurde 10 ul beibehalten, während die anderen 10 ul einer separaten autoklavierten 1,5 ml Röhrchen überführt wurde. Die separaten Aliquots wurden DNA-Extraktion entweder durch die vereinfachte Chelex oder die Standard Aussalzen Extraktionsprotokoll 9,10 unterzogen. Das Protokoll ist Aussalzen sogenannte und weit verbreitet, weil sie hohe Salzkonzentrationen verwendet anstelle von gefährlichen organischen Lösungsmitteln (wie Phenol und Chloroform) für das Protein Fällungsschritt während der DNA-Extraktion 9. Extrakte wurden als Matrizen für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern verwendet Targeting Arthropoden mitochondrialen Nicotinamidadenindinucleotid Dehydrogenasenase (NADH) Untereinheit 4-Gen (ND4) an DNA-Qualität 11, eine PCR zur ​​Identifizierung von Anopheles gambiae Geschwisterart 10 und eine verschachtelte PCR zur ​​Typisierung von Plasmodium falciparum-Infektion 12 zu überprüfen. Vergleich mit DNA-Qualität (ND4) PCR zeigten 93% Sensitivität und 82% Spezifität für die Chelex Ansatz gegenüber der etablierten Aussalzen Protokoll. Entsprechende Werte von Sensitivität und Spezifität waren 100% bzw. 78%, jeweils unter Verwendung Geschwisterart Identifizierung PCR und 92% und 80%, jeweils für P. falciparum Nachweis PCR. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Anteil an Proben, bei Amplikon Signals mit der oder den regulären Chelex Aussalzen Protokoll über alle drei PCR-Anwendungen. Die Chelex Ansatz erforderlich drei einfachen Reagenzien und 37 min in Anspruch, während das Aussalzen Protokoll brachte 10 verschiedene Reagenzien und 2 h und 47 min &#39;Bearbeitungszeit, einschließlich einer Übernachtung Schritt. Unsere Ergebnisse zeigen, tham Chelex Verfahren ist vergleichbar mit der vorhandenen Aussalzen Extraktion und kann als eine einfache und nachhaltige Ansatz mit beschränkten Ressourcen wo eine konstante Reagenz Lieferkette ist oft schwierig zu warten substituiert sein.

Beispiele für Ergebnisse von PCR-Assays für Moskito DNA-Extrakt Qualität (Abbildung 1), Anopheles arabiensis molekulare Identifizierung (Abbildung 2) und P. falciparum-Erkennung (Abbildung 3) zeigen, dass die vereinfachte Chelex Verfahren zu ähnlichen Ergebnissen liefert der Standard Aussalzen Protokoll 10, obwohl viel weniger Schritte (Tabelle 1). Bei vergleichbaren DNA-Qualität in den jeweiligen Extrakten ist es nicht verwunderlich, dass die Probe Positivität Preise in Bezug auf An. gambiae Geschwister Arten sowie Parasiten Infektionsraten waren statistisch nicht unterschiedlich basierend auf McNemar-Chi-Quadrat-Test (Abbildung 3). Sensitivität (%) wurde berechnet als TP / (TP + FN) * 100, wo TP bezeichnet wahren Positiven und FN bezeichnet falsche Negative. Spezifität (%) wurde als TN / bestimmt (TN + FP) * 100, wo TN bezeichnet wahre Negative und FP bezeichnet Fehlalarme. Die DNA-Qualität (ND4) PCR zeigten 93% Sensitivität und 82% Spezifität für die Chelex Ansatz im Vergleich zu den etablierten Aussalzen Protokoll als Goldstandard. Entsprechende Werte von Sensitivität und Spezifität waren 100% bzw. 78%, jeweils unter Verwendung Geschwisterart Identifizierung PCR und 92% und 80%, jeweils für P. falciparum Nachweis PCR. Der Zusatz von BSA an Reaktionsgemische ergab eine allgemeine Erhöhung der PCR Positives (3) infolge Entlastung der PCR-Inhibitoren 14, sowohl für die vereinfachte Chelex und regelmäßige Aussalzen Protokoll. Allerdings war dieser Anstieg statistisch nicht signifikant mit Ausnahme von DNA-Qualität (ND4 PCR) auf Chelex Extrakte (p = 0,039). Allel-spezifische Restriktionsenzymverdau auf P. falciparum DHFR (oder andere Target-Gen) Amplikon ermöglicht die Genotypisierung von Mitte Darm und Speicheldrüse Malariainfektionen für Arzneimittelresistenz Allele (Fig. 4; Speicheldrüse Daten nicht gezeigt). <table border='"1"&gt;'><tr><td colspan="2"> Einfache Chelex Procedure </td><td colspan="2"> Standard Aussalzen Procedure </td></tr><tr><td> Treppe </td><td> Reagenzien </td><td> Treppe </td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td><ol><li> Fügen Probe 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren in 100 ul 1X PBS / 1% Saponin-Lösung (2 min). </li><li> Hinterlegen bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Spin bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie 100 ul 1X PBS und vorsichtig mischen durch kurzes Vortexen (3 sec). </li><li> Spin bei 20.000 xg für 2 min und Überstand verwerfen. </li><li> Fügen Sie 25 ul 20% w / v Chelex in entionisiertem Wasser und 75 ul sterilem entionisiertem Wasser. </li><li> Pierce Loch im Deckel des Probenröhrchens mit heißer, steriler 23G Injektionsnadel und Tubeninhalt Sieden für 10 min. </li><li> Spin Mikrozentrifugenröhrchen bei 20000 × g für 1 min. </li><li> Überstand in sterile prelabeled Fläschchen und store DNA-Lösung bei -20 ° C bis zur Verwendung (2,5 ul in 25 ul PCR-Reaktion). </li></ol></td><td> PBS Saponin Chelex-100 Perlen </td><td><ol><li> Hinzufügen Probe zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen geben und homogenisieren in 100 ul Puffer Bender * mit 1% DEPC (2 min). </li><li> Inkubieren bei 65 ° C für 1 Stunde. </li><li> Fügen Sie 15 ul kalten 8 M Kaliumacetat. Vorsichtig mischen und auf Eis inkubieren für 45 min. </li><li> Spin Probe in Mikrozentrifugenröhrchen bei 20.000 xg für 10 min und Transfer Überstand in ein neues 1,5 ml-Tube. </li><li> Fügen Sie 250 ul 100% Ethanol und gut mischen durch Invertieren des Röhrchens. </li><li> Inkubieren Probe bei RT 5 min. </li><li> Spin Proben bei 20.000 × g für 15 min. </li><li> Ansaugen und Überstand verwerfen, so dass das Pellet vollständig trocknen im Rohr (30 min). </li><li> Pellet in 20 ul 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie 80 ul DEPC Wasser und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonat (DEPC) * Bender Buffer: 0,1 M NaCl 0,2 M Sucrose 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% SDS in DEPC Wasser 8 M Kaliumacetat Ethanol 0,1 X Saline Natriumcitrat (SSC)-Puffer RNAse (10 ug / ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> TOTAL TIME: 37 min </td><td colspan="2"> TOTAL TIME: 2 Std. 47 min, plus Nacht </td></tr></table> Tabelle 1. Schritt Vergleich der Reagenzien und Zeitbedarf für einfache Chelex Protokoll Schritt und stehenard Aussalzen Methode zur DNA-Extraktion aus Moskito-Proben. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. ND4 mitochondrialen PCR Vergleich der DNA-Qualität von vereinfachten Chelex "C" und Standard Aussalzen "M"-Extrakten auf Anopheles arabiensis Feldproben. NC, Negativkontrolle; M1 und C1, M2 und C2, C3 und M3 und M4 und C4 sind gepaart Aussalzen und Chelex Extrakte von gleichen An. arabiensis mosquito Proben. L, 100 bp DNA-Leiter. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Molecular Identifizierung PCR für Anopheles arabiensis C1 und M1, M2 und C2, C3 und M3 und M4 bedeuten C4 jeweiligen Amplikon aus Aussalzen "M" und vereinfacht Chelex "C" DNA Extrakte zur gleichen Moskito Proben;.. AR, Anopheles arabiensispositive Kontrolle; L, 100 bp DNA-Leiter. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Erkennung von Positive auf Chelex und Aussalzen DNA-Extrakte für Moskito Feldproben mit PCR-Assays für die molekulare Identifizierung von Anopheles arabiensis (AR) 10, Arthropoden NADH-Dehydrogenase-Gen 4 (ND4) DNA Qualitätstest 11 und Antifolat drug resistance P . falciparum DHFR Genotypisierung 12 (F-M4). Ergebnisse bei Versuchen mit oder ohne BSA in der Reaktionsmischung ausgeführt dargestellt. McNemar-Chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um festzustellen, ob die Unterschiede zwischen Prozent positive PCRs von DNA aus der vereinfachten Chelex extrahiert und die Standard Aussalzen Protokolle waren statistisch signifikant. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> P. falciparum-Infektionen bei Mücken (mid-gut-Daten gezeigt) für Resistenz-Allele. BSTN I Verdauung auf Amplikon flankierenden Codon 108 des P. falciparum DHFR-Gen 12 zeigt Cycloguanil-resistente Mutanten in Moskito S108T Proben (M1-M5; mittleres Darm Daten gezeigt). U, unverdaute 522 bp Amplikon; FCR3, Labor-Standard P. falciparum positive Kontrolle Klon trägt S108T; K1, P. falciparum Laborstandard Klon negative Kontrolle Durchführung Cycloguanil-sensitive S108N; L, 100 bp DNA-Leiter.

Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Qualität Malariaparasiten und Vektor-DNA aus mosquito Proben zu extrahieren beschrieben. Aufbauend auf chelatisierenden Eigenschaften der Chelex Harz, ermöglicht die einfache Methode Genotypisierung von Malaria-Parasiten in Mücken Mitte Darm und Speicheldrüsen Phasen sowie molekulare Identifizierung der<em&gt; Anopheles</em&gt; Geschwister Spezies durch PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemische Länder setzen zunehmend molekulare Werkzeuge für eine effiziente Typisierung, Identifizierung und Überwachung von Malariaparasiten und Vektoren ein ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Malaria-, Parasiten- und Moskito-DNA aus den Mitteldarm- und Speicheldrüsenabschnitten von Anopheles-Proben zu extrahieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Mückenkörper exakt an der Gelenkstelle zwischen Abdomen und Thorax durchtrennt wird, wodurch der Mitteldarm vom Speicheldrüsenabschnitt getrennt wird. Anschließend wird jeder Abschnitt getrennt in entionisiertem Wasser zerkleinert.Anschließend wird die Gewebesuspension lysiert und gewaschen, und das Zellpellet wird gewonnen. Abschließend wird das Zellpellet rekonstituiert und erhitzt, und die DNA wird extrahiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die hochwertige DNA von Mücken und Malariaerregern liefern, die als Vorlage zur Identifizierung von Anomalien, Vektorspezies und Genotypisierung von Malariainfektionen mittels PCR und allelespezifischer Restriktionsenzymverdauung geeignet ist.Der Hauptvorteil dieser äußerst einfachen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der organischen Extraktion und Sortierverfahren liegt darin, dass sie nur sehr wenige sichere und leicht verfügbare Reagenzien benötigt und zudem deutlich weniger Bearbeitungszeit erfordert. Um mit der Dissektion der Mücke zu beginnen, legen Sie sie auf ein kleines Stück Paraform und befestigen Sie sie am Stereomikroskop. Bedecken Sie sie mit einem Tropfen entionisiertem Wasser.Um das Gewebe weicher zu machen, die Mückenkadaver präzise an der Gelenkstelle zwischen Thorax und Abdomen einschneiden. Auf diese Weise Kopf und Thorax vom Abdominalabschnitt abtrennen. Jeden präparierten Mückenabschnitt in ein sauberes, autoklaviertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das zuvor mit der Mücken-ID-Nummer und der entsprechenden Körperteilbezeichnung beschriftet wurde; die Parafolienhülle entsorgen und mithilfe eines mit 70 %igem Alkohol angefeuchteten Kim-Tuchs sorgfältig die Mikroskopbühne abwischen, bevor mit der nächsten Mücke fortgefahren wird. Um zuerst die Mücken-DNA zu extrahieren, pipettieren Sie zunächst 20 Mikroliter entionisiertes Wasser in das Probenröhrchen.Und verwenden Sie die Pipettenspitze, um den untergetauchten Mückenabschnitt zu einer einheitlichen Suspension zu zerkleinern. Geben Sie 100 µL einer autoklavierten 1x PBS-Lösung mit 1 % Saponin zum Probenhomogenat und mischen Sie vorsichtig durch Vortexen. Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten bei Raumtemperatur.Zentrifugieren Sie anschließend bei 20.000 ×g für zwei Minuten und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 µL 1× PBS. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation.Geben Sie 75 Mikroliter sterilem, deionisiertem Wasser und 25 Mikroliter einer 20 %igen (Gewicht pro Volumen) Cellex 100 Harzsuspension in deionisiertem Wasser hinzu und wirbeln Sie vorsichtig um, um das Pellet mit einer sterilen 23-Gauge-Hypodermikannadel, die im Bunsenbrenner geflammt wurde, erneut in Suspension zu bringen. Stichen Sie ein Loch in den Deckel des Probenröhrchens.Erhitzen Sie die Proben-Suspension 10 Minuten lang in einem Heizblock zum Kochen. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 20.000 ×g und überführen Sie die DNA-Lösung in ein vorbeschriftetes Lagergefäß, um sie als Vorlage in PCR-Reaktionen zu verwenden, um die Qualität der extrahierten DNA zu überprüfen und einen Bereich des mitochondrialen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase-Subunit-4-Gens von Arthropoden zu amplifizieren, von dem erwartet wird, dass er ein 400 Basenpaare langes Fragment erzeugt. Als Nächstes amplifizieren Sie einen Bereich, der SNPs im intergenischen Spacer-Bereich flankiert, um zwischen den Ananais-Gambia-Arten zu differenzieren; hierbei werden Fragmentgrößen von 390 Basenpaaren für Ananais Gambia Sensu Stricto und 315 Basenpaaren für Ananais api erwartet.Anschließend das Genotypisieren von Polymorphismen der p. falciparum-Antifolat-Resistenz durchführen. Mit einer nested PCR den Bereich amplifizieren, der die Aminosäurecodons 16, 51, 59, 108 und 164 flankiert. Im Dihydrofolat-Reduktase-Gen der Parasiten eine allelespezifische Verdauung des Amplikons durchführen, um die Antifolat-Resistenz nachzuweisen.Assoziierte Polymorphismen. Überprüfen Sie die Reaktionen auf einem 2 %igen AROS-Gel. Beispiele für Ergebnisse von PCR-Analysen zur Beurteilung der DNA-Extraktqualität bei Mücken, zur molekularen Identifizierung mittels RABIS und zur Genotypisierung von p. falciparum zeigen, dass die vereinfachte Kelex-Methode im Vergleich zum Standard-Salting-out-Protokoll ähnliche Ergebnisse liefert, obwohl sie weniger Schritte erfordert und weniger als ein Viertel der Zeit in Anspruch nimmt. Bei vergleichbarer DNA-Qualität der jeweiligen Extrakte ist es nicht überraschend, dass die Positivitätsraten der Proben bezüglich Anophelis-Arten, Gambia-Geschwisterarten sowie Parasiteninfektionsraten nach dem Chi-Quadrat-Test nach McNear statistisch nicht unterschiedlich waren.Die Zugabe von BSA zu Reaktionsgemischen führt zu einer allgemeinen Zunahme der PCR-Positivität aufgrund der Entfernung von PCR-Inhibitoren sowohl bei dem vereinfachten Kelex- als auch beim herkömmlichen Salting-out-Protokoll. Dieser Anstieg war jedoch mit Ausnahme der DNA-Qualität bei Kelex-Extrakten nicht statistisch signifikant. Die allelespezifische Restriktionsenzymverdauung des p-falciparum-Amplicons ermöglicht das Genotyping von Malaria-Infektionen in Mitteldarm und Speicheldrüse hinsichtlich Resistenzallele gegen Medikamente, sobald die Methode beherrscht ist.Diese Technik sollte bei korrekter Durchführung in etwa 37 Minuten durchführbar sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Kürzlich Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologie hat stark Empfindlichkeit von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Experiment erhöht und aufgefordert ihre Anwendung unter Verwendung von gereinigten Zellen oder Gewebe präpariert. Hier haben wir beschreiben eine Methode zur Chip-Technik mit...

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Chromosomenmalerei ist eine nützliche Methode, um die Organisation des Zellkerns und die Evolution des Karyotyps zu untersuchen. Hier zeigen wir einen Ansatz zur Isolierung und Verstärkung bestimmter Interessenbereiche von einzelnen Polytenchromosomen, die anschließend  für die zwei- und dreidimensionale Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) verwendet werden.

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Wir beschreiben hier ein einfaches und schnelles papierbasierten DNA-Extraktionsverfahren von HIV provirale DNA aus Vollblut durch quantitative PCR nachgewiesen. Dieses Protokoll kann bei der Aufdeckung von anderen genetischen Markern oder alternative Amplifikationsverfahren zur Verwendung verlängert werden.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz zur Identifizierung von Pflanzenviren mit Doppel-Strang DNA Genom. Wir verwenden standard-Methoden zu extrahieren von DNA und RNA aus den infizierten Blättern und Next Generation Sequencing durchzuführen. Bioinformatische Werkzeuge montieren Sequenzen in Contigs, Contigs Vertretung Virus Genome zu identifizieren und Genome taxonomischen Gruppen zuweisen.

Kombination von Analyse von DNA in eine grobe Virion-Extraktion mit der Analyse der RNA aus den infizierten Blättern, entdecken neue Virus-Genom

Hier wird ein DNA-Extraktionsprotokoll mit magnetischen Perlen beschrieben, um qualitativ hochwertige DNA-Extraktionen aus Moskitos herzustellen. Diese Extraktionen eignen sich für einen nachgelagerten Next-Generation-Sequencing-Ansatz.

Ein magnetperlenbasiertes Moskito-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation

Dieses Protokoll bietet die Schritte von der DNA-Extraktion bis zum Versuchsaufbau für die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR), einschließlich der Analyse zur Identifizierung und Quantifizierung von nicht-homologen End-Joining-Ereignissen (NHEJ) an Zielorten nach gRNA-induzierter Cas9-Spaltung und DNA-Reparatur. Andere Anwendungen dieser Methode umfassen Anwendungen wie den Polymorphismus-Nachweis und die Verifizierung von Gen-Editing-Varianten.

Digital-Droplet PCR zum Nachweis von Indel-Mutationen in gentechnisch veränderten Anopheline-Mückenpopulationen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Dieses Protokoll beschreibt einen Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Speicheldrüsen-Sporozoiten in Mücken. Unter Verwendung leicht verfügbarer monoklonaler Antikörper ermöglicht die Methode einen kostengünstigen Hochdurchsatznachweis von Mücken, die Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax tragen. Die Methode eignet sich für die Erforschung der Malariaübertragung, einschließlich Vektoruntersuchungen.

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Erfahren Sie eine schnelle DNA-Extraktion aus Anopheles-Mücken mittels Chelex-Harz für Malariaforschung. Diese Methode ermöglicht PCR-basierte Artidentifikation und Parasitengenotypisierung in unter 40 Minuten.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus

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