A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus Anopheles Spp.
9. Januar 2013
Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Qualität Malariaparasiten und Vektor-DNA aus mosquito Proben zu extrahieren beschrieben. Aufbauend auf chelatisierenden Eigenschaften der Chelex Harz, ermöglicht die einfache Methode Genotypisierung von Malaria-Parasiten in Mücken Mitte Darm und Speicheldrüsen Phasen sowie molekulare Identifizierung der Anopheles Geschwister Spezies durch PCR.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Malaria-, Parasiten- und Mücken-DNA aus dem Mitteldarm und den Speicheldrüsenabschnitten von Anomalien und Proben zu extrahieren. Dazu wird die Mücke zunächst genau an der Stelle zwischen Bauch und Thorax geschnitten und so der Mitteldarm vom Speicheldrüsenabschnitt getrennt. Anschließend wird jeder Abschnitt separat in entionisiertem Wasser gemahlen.
Dann wird die Gewebesuspension gelegt und gewaschen und das Zellpellet zurückgewonnen. Schließlich wird das Zellpellet rekonstituiert und gekocht, und die DNA wird extrahiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine qualitativ hochwertige Mücken- und Malariaparasiten-DNA zeigen, die als Vorlage zur Identifizierung von Anomalien, Vektorspezies und Genotyp-Malariainfektionen durch PCR und Allel-spezifischen Restriktionsenzymverdau geeignet ist.
Der Hauptvorteil dieser sehr einfachen Technik gegenüber bestehenden wie organischen Extraktions- und Sortiermethoden besteht darin, dass sie nur sehr wenige sichere und leicht verfügbare Reagenzien und auch viel weniger Verarbeitungszeit benötigt. Um mit dem Präparieren der Mücke zu beginnen, legen Sie sie auf ein kleines Stück Paraform und montieren Sie es auf ein Präpariermikroskop. Bedecken Sie es mit einem Tropfen entionisiertem Wasser.
Um das Gewebe weicher zu machen, wird der Mückenkadaver genau am Gelenk zwischen Brustkorb und Bauch angelegt. Dadurch werden der Kopf und der Brustkorb vom Bauchbereich abgeschnitten. Übertragen Sie jeden präparierten Mückenabschnitt in einen sauberen Autoklaven, ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit der Mücken-ID-Nummer und dem Körperteil vorbeschriftet ist. Entsorgen Sie den Para-Film und wischen Sie mit einem mit 70 % Alkohol angefeuchteten Kim-Tuch vorsichtig den Mikroskoptisch ab, bevor Sie zur nächsten Mücke verarbeiten, um Mücken-DNA zu extrahieren. Pipettieren Sie zuerst 20 Mikroliter deionisiertes Wasser in das Probenröhrchen.
Und zerkleinern Sie mit der Pipettenspitze den untergetauchten Mückenabschnitt zu einer gleichmäßigen Suspension. Geben Sie 100 Mikroliter eines Autoklaven und eine XPBS 1%ige Saponinlösung in das Probenhomogenat und mischen Sie es vorsichtig mit einem Vortex. Die Probe wird 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend wird bei 20.000 g zwei Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern pro XPBS. Wiederholen Sie dann die Drehung.
Fügen Sie 75 Mikroliter steriles deionisiertes Wasser und 25 Mikroliter mit 20 % Gewicht pro Volumen hinzu. Cellex 100 Harzsuspension in deionisiertem Wasser und sanft vortexen, um das Pellet mit einer sterilen 23-Gauge-Injektionsnadel, die im Bunsenbrenner geflammt wird, wieder zu resuspendieren. Stechen Sie ein Loch in den Deckel des Probenröhrchens.
Kochen Sie die Probensuspension 10 Minuten lang in einem Heizblock. Zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 20.000 g und überführen Sie die DNA-Lösung in ein vormarkiertes Lagerfläschchen zur Verwendung als Vorlage in PCR-Reaktionen, um die Qualität der extrahierten DNA zu überprüfen, amplifizieren Sie eine Region des Arthropoden-mi-Mitochondrien-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase-Untereinheit vier-Gens, von dem erwartet wird, dass es ein 400-Basenpaar-Fragment produziert. Um zwischen Ananais Gambia-Arten zu unterscheiden, amplifizieren Sie als nächstes eine Region, die SNPs in der intergenen Spacer-Region flankiert, von der erwartet wird, dass sie Größen von 390 Basenpaaren für Ananais Gambia Sens Stricto und 315 Basenpaaren für Ananais api erzeugt.
Ansis dann zum Genotyp p falciparum Anti-Folat-Arzneimittelresistenz-Polymorphismen. Es wird eine verschachtelte PCR durchgeführt, um die Region zu amplifizieren, die die Aminosäurecodons 16, 51, 59, 108 und 164 flankiert. In den Parasiten dihydro-folat-reduktase-Gen führen sie die allelspezifische Verdauung des Amplikons durch, um eine Anti-Folat-Arzneimittelresistenz nachzuweisen.
Assoziierte Polymorphismen. Überprüfen Sie die Reaktionen bei einer 2%igen AROS-Gel-Untersuchung. Beispiele für Ergebnisse von PCR-Assays für die Qualität von Mücken-DNA-Extrakten, die molekulare Identifizierung von analis, RABIS und die Genotypisierung von p falciparum zeigen, dass die vereinfachte Kelex-Methode trotz weniger Schritten und weniger als einem Viertel der Zeit mit vergleichbarer DNA-Qualität in den jeweiligen Extrakten ähnliche Ergebnisse wie das Standard-Aussalzprotokoll liefert, es ist nicht überraschend, dass die Positivitätsraten der Proben in Bezug auf Anomalien, Gambia-Geschwisterarten sowie die Parasiteninfektionsraten unterschieden sich statistisch nicht auf der Grundlage des Chi-Quadrat-Tests von McNear.
Die Zugabe von BSA zu Reaktionsgemischen führt zu einem allgemeinen Anstieg der PCR-Positiven, da PCR-Inhibitoren sowohl für das vereinfachte Kelex- als auch für das reguläre Aussalzungsprotokoll entfernt werden. Dieser Anstieg war jedoch statistisch nicht signifikant, abgesehen von der DNA-Qualität der Kelex-Extrakte. Der Allel-spezifische Restriktionsenzymverdau des p falciparum Amplicons ermöglicht die Genotypisierung von Malariainfektionen im Mitteldarm und im Speichel für Arzneimittelresistenzallele Sobald sie beherrscht sind.
Diese Technik sollte bei richtiger Ausführung in etwa 37 Minuten durchgeführt werden können.
Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine schnelle und kostengünstige Methode zur Extraktion hochwertiger DNA aus Malaria-Parasiten und Mückenvektoren. Unter Verwendung von Chelex-Harz ermöglicht die Technik eine effektive Genotypisierung von Malaria-Parasiten und molekulare Identifizierung von Anopheles-Arten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Genomik
Hintergrund
- Malaria ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem, das durch Anopheles-Mücken übertragen wird.
- Traditionelle DNA-Extraktionsmethoden können zeitaufwändig sein und gefährliche Reagenzien erfordern.
- Es besteht ein Bedarf an einfacheren, sichereren und effizienteren Techniken zur DNA-Extraktion.
- Diese Studie stellt eine Methode vor, die diese Bedürfnisse unter Verwendung von Chelex-Harz erfüllt.
Zweck der Studie
- Eine schnelle und kostengünstige Methode zur Extraktion von DNA aus Malaria-Parasiten und Mückenvektoren zu entwickeln.
- Die Genotypisierung von Malaria-Parasiten und die Identifizierung von Anopheles-Arten zu ermöglichen.
- Die Effizienz und Wirksamkeit der neuen Methode mit traditionellen Protokollen zu vergleichen.
Verwendete Methoden
- Sektion von Mückenproben zur Trennung der Mitteldarm- und Speicheldrüsenabschnitte.
- Zerkleinerung des Gewebes in deionisiertem Wasser zur Herstellung einer Suspension.
- Verwendung von Chelex-Harz für die DNA-Extraktion.
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Genotypisierung und Speziesidentifizierung.
Hauptergebnisse
- Die Chelex-Methode liefert hochwertige DNA, die für PCR geeignet ist.
- Die Ergebnisse sind mit traditionellen Methoden vergleichbar bei deutlich reduzierter Verarbeitungszeit.
- Die Positivitätsraten der Proben für Speziesidentifizierung und Parasiteninfektionen waren zwischen den Methoden statistisch ähnlich.
- Die Zugabe von BSA verbesserte die PCR-Ergebnisse durch Reduzierung von Inhibitoren.
Schlussfolgerungen
- Die vereinfachte Chelex-Methode ist effektiv für die Extraktion von DNA aus Malaria-Vektoren.
- Diese Technik kann in unter 40 Minuten durchgeführt werden, was sie für den routinemäßigen Einsatz praktisch macht.
- Sie bietet eine sicherere und effizientere Alternative zu traditionellen DNA-Extraktionsmethoden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vector-parasite interactions by providing DNA templates for species confirmation and infection status assessment.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent burden, supporting higher throughput in field-collected sample processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces DNA suitable for PCR-based assays targeting vector species discrimination and parasite genotyping.
- Operational Value: Uses only three reagents (deionized water, saponin, Chelex resin), enhancing assay standardization and reducing variability in resource-constrained labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from vector collection to downstream applications like drug resistance genotyping via nested PCR and restriction digestion.
- Operational Value: Eliminates need for hazardous organic solvents, improving safety and accessibility in field laboratories.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on vector species distribution and Plasmodium falciparum infection rates in field settings.
- Screening: Delivers DNA extracts with sufficient quality and yield for multiplex PCR applications, supporting assay readiness.
- Analytics: Enables quantitative assessment via PCR amplification of ND4, species-specific SNPs, and drug resistance loci, allowing comparison across sample groups.
- Translational Research: Connects entomological surveillance to parasite genotyping, supporting risk-adjusted decisions in malaria control strategies.
- Enterprise Reuse: Protocol simplicity and minimal equipment needs (microcentrifuge, heating block) allow adoption across multiple field sites and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vector species identification and parasite detection through comparable sensitivity and specificity to benchmark methods.
- Operational Value: Achieves high reproducibility with minimal reagent dependency, reducing supply chain vulnerability in remote settings.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in surveillance programs by shortening time-to-result for molecular confirmation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by delivering timely, accurate data on vector competence and parasite prevalence.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology training for tissue dissection, homogenization, and PCR setup.
- Needs access to a microcentrifuge capable of 20,000 × g and a heating block for boiling step.
- Standardization across teams benefits from consistent vortexing and pipetting techniques during homogenization and resin resuspension.
- Adaptation to other mosquito species or sample types may require validation of lysis efficiency and inhibitor removal.
- Practical limitation: The method includes a manual grinding step that may limit ultra-high-throughput automation without modification.
