RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt
28. September 2011
Eine zuverlässige Methode für die RNA-Isolierung Pseudomonas aeruginosa Erholte sich von murinen cecums beschrieben. Die RNA zurückgewonnen wird in ausreichender Menge und Qualität für die anschließende qPCR, Transkription Profiling und RNA Seq Experimente. Diese Technik kann für die RNA-Isolierung von anderen Darmbakterien angepasst werden.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Gesamt-RNA von Pseudomonas aerogen zu isolieren, die aus murinen ECMs gewonnen wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst die luminalen Inhalte gewonnen werden. Anschließend wird die bakterielle RNA isoliert.
Dann erfolgen die D'S-Behandlung und die RNA-Reinigung. Abschließend wird die RNA quantifiziert und die Reinheit des Isolats mittels Bioanalyzer und spektralphotometrischer Analyse überprüft. Letztendlich kann bakterielle RNA in ausreichender Qualität und Menge für nachfolgende experimentelle Untersuchungen, wie beispielsweise QPCR-Analysen, Transkriptionsprofiling oder RNA-Sequenzierungsversuche, gewonnen werden.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Triol-Extraktion besteht darin, dass sie mehrere Lyse-Schritte in äußerst rigorosen sauren Phenol-Chloroform-Extraktionsschritten kombiniert, um hochwertige RNA zu gewährleisten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Lyse- und Extraktionsschritte schwer zu erlernen sind, weil schriftliche Protokolle oft kleine, aber entscheidende Details weglassen, die für den Erfolg notwendig sind. Die Durchführung der Methode zeigen Eduardo Lopez Medina, ein Postdoktorand, und Megan Neubauer, die Laborleiterin, beide aus meinem Labor. Vor Beginn der Gewinnung reinigt IMSA einen Edelstahlmörser in einem flüssigen Stickstoffbad.
Danach, nachdem eine mit Pseudomonas aerogen besiedelte sechs bis acht Wochen alte C3 HHEN-Maus euthanasiert wurde, das Tier in Rückenlage auf eine Styroporplatte legen und den Bauchbereich mit 95 %igem Ethanol benetzen. Anschließend einen medianen Längsschnitt durch die Haut vom Sternum bis zum Perineum führen. Dann die Haut und das Peritoneum zurückziehen und die Bauchhöhle freilegen.
Resektieren Sie nun das gesamte Zäkum mit einer Pinzette. Halten Sie das Zäkum über den Edelstahlmörser und schneiden Sie beide Enden des Zäkums mit einer Präzisionsschere ab. Füllen Sie eine P-1000-Pipettenspitze mit einem Milliliter Sequel Flush 8-Puffer und führen Sie die Spitze anschließend in das proximale Ende des Zäkums ein.
Spülen Sie den Sequel-Flush-Acht-Puffer und die luminalen Inhalte von Sequel in den Edelstahlmörser. Mahlen Sie nun das Sequel. Spülen Sie die Acht-Inhalte mit einem sterilen Pistill nach.
Danach Ethanol in einen Behälter mit Trockeneis gießen und ein 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäß in das Trockeneis-Ethanol-Bad stellen. Den gemahlenen, gefrorenen Inhalt des Lumens in das Konischgefäß überführen und das Gefäß bei minus 80 Grad Celsius lagern. Diese nächste Abfolge von Schritten stellt die schwierigste Phase des Verfahrens dar.
Angesichts der komplexen Beschaffenheit der aus dem MI-Caecum gewonnenen Materialien sind wiederholte kalte Filoform-Extraktionen unbedingt erforderlich, um eine akzeptable Reinheit und Integrität zu erreichen; zwischen drei und fünf Extraktionen können notwendig sein, bis die breite Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Phase verschwunden ist. Geben Sie ein Volumen sauren Phenol-Chloroform in ein 50-Milliliter-Oak-Ridge-Zentrifugenröhrchen. Verschließen Sie den Deckel mit Parafilm und erwärmen Sie das Röhrchen anschließend in einem Wasserbad bei 65 °C.
Geben Sie die halbe Menge Puffer für die Zelllyse in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäß und erhitzen Sie den Puffer fünf Minuten lang zum Kochen. Nachdem Sie den Inhalt des Sequel-Lumens aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius entnommen haben, erwärmen Sie das Gefäß kurz durch kräftiges Reiben mit den Händen und geben dann den kochenden Lysispuffer hinzu. Schütteln Sie die Mischung, um die Lösung aus Lysispuffer und Sequel-Lumen-Inhalt homogen zu verteilen.
Kochen Sie den Lysepuffer und die SQL-Luminalinhalte fünf Minuten lang. Öffnen Sie unter gelegentlichem Wirbeln die Oak-Ridge-Zentrifugenröhrchen, die die Phenol-Chloroform-Lösung enthalten, und überführen Sie die SQL-Inhalte des Lyseprobenmaterials in das Röhrchen. Verschließen Sie anschließend den Deckel erneut mit Perfil und stellen Sie das Röhrchen für 10 Minuten in ein Wasserbad bei 65 Grad Celsius, wobei Sie das Röhrchen alle zwei Minuten umrühren.
Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.500 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nun vorsichtig die wässrige Phase in ein frisches 50-Milliliter-Oak-Ridge-Zentrifugenröhrchen, wobei Sie die weiße Grenzschicht vermeiden. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen an saurem Phenol-Chloroform hinzu.
Verschließen Sie die Kappe mit Perfil und mischen Sie den Inhalt gründlich, indem Sie das Gefäß bei hoher Geschwindigkeit wirbeln. Zentrifugieren Sie die Probe weiter und überführen Sie die wässrige Phase in das Zentrifugenröhrchen. Falls das Volumen der oberen wässrigen Phase zu gering wird, kann sie in ein Röhrchen mit kleinerem Durchmesser überführt werden.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine sichtbare weiße Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Phase mehr vorhanden ist. Sobald die weiße Grenzfläche verschwunden ist, überführen Sie die wässrige Phase vorsichtig in ein frisches Zentrifugenröhrchen. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen Chloroform, Isoamylalkohol in das Röhrchen, verschließen Sie den Deckel und mischen Sie den Inhalt gründlich durch Wirbelmischen.
Als Nächstes nach erneutem Zentrifugieren der Probe die wässrige Phase in ein 15-Milliliter-Polypropylen-Konischgefäß überführen und ein gleiches Volumen Isopropanol hinzufügen. Anschließend die Lösung mindestens zwei Stunden oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation der Probe das Gefäß 45 Minuten lang zentrifugieren.
Nachdem Sie das gallertartige Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes identifiziert haben, entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie das Pellet anschließend mit einem Milliliter eiskaltem 70 %igem Ethanol, indem Sie das Reaktionsgefäß kurz verwirbeln, und zentrifugieren Sie die Probe anschließend bei 10.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie abschließend den Überstand und stellen Sie das Reaktionsgefäß auf den Kopf, um das Pellet zehn Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen zu lassen.
Suspenderen Sie das RNA-Pellet anschließend in 200 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Geben Sie zunächst 20 Mikroliter 10× Turbo-DNase-Puffer und zwei Mikroliter Turbo-DNase in die Mikrozentrifugenrobe und mischen Sie die Lösung vorsichtig. Inkubieren Sie dann das Gefäß 20 Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie danach 20 Mikroliter des resuspendierten DNA-Inaktivierungsreagenz hinzu und mischen Sie gut.
Jetzt den Kolben weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Mischen inkubieren. Anschließend das Pellet in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 × g für 1,5 Minuten abzentrifugieren und den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Eine äquivalente Menge kaltes saures Phenol-Chloroform zum Pellet hinzufügen und die Lösung anschließend gründlich durch Vortexen für eine Minute mischen.
Nachdem die Lösung zwei Minuten bei 12.500 × g zentrifugiert wurde, überführen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen und geben ein Volumen Chloroform-Isoamylalkohol hinzu. Anschließend mischen Sie die Lösung durch Vortexen, nachdem Sie die Lösung erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert haben. Überführen Sie die wässrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
Dann 0,1 Volumen dreimolares Natriumacetat und 2,5 Volumina eiskaltes, 100%iges Ethanol hinzufügen. Das Gefäß vortexen, um es zu mischen. Die Probe bei minus 80 Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren.
Anschließend nach einer Zentrifugation bei 12.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius das Überstand entfernen. Zum Schluss den Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 70 %igen Ethanol waschen. Den Überstand entfernen und den Pellet 10 Minuten lufttrocknen lassen.
Suspenderen Sie das Pellet anschließend in 100 Mikroliter RNasenfreiem Wasser. Der Agilent Bioanalyzer ist eine auf Mikrofluidik basierende Plattform zur Größenbestimmung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle von DNA, RNA, Proteinen und Zellen und verwendet eine RNA-Integritätsmetrik, die als RNA-Integritätszahl oder RIN (RNA Integrity Number) bekannt ist. Mit diesem Protokoll extrahierte Proben weisen zwei 60- bis zwei 80-Verhältnisse im Bereich von 1,7 bis 2,0 sowie RIN-Werte größer oder gleich 7,0 auf.
Hier links ist ein Beispiel eines Elektropherogramms bakterieller RNA aus einem Agilent Bioanalyzer dargestellt, und rechts sehen Sie ein gelförmiges Bild von Pseudomonas arosa, das aus murinen SQL-Inhalten gewonnen wurde. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die quantitative PCR oder die RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise eine detaillierte Genexpressionsprofilierung.
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine zuverlässige Methode zur Isolierung von RNA aus Pseudomonas aeruginosa, die aus murinen Zäkumen gewonnen wurde. Das Verfahren liefert RNA von ausreichender Qualität für die qPCR, Transkriptionsprofilerstellung und RNA-Sequenzierung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Molekularbiologie
- RNA-Isolationsmethoden
Hintergrund
- Pseudomonas aeruginosa ist ein bedeutender Pathogen bei verschiedenen Infektionen.
- Die Isolierung von hochwertiger RNA ist entscheidend für die Untersuchung der Genexpression.
- Bestehende Methoden liefern möglicherweise nicht die gewünschte RNA-Qualität.
- Diese Methode beinhaltet gründliche Lyse- und Extraktionsschritte.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur RNA-Isolierung von Pseudomonas aeruginosa.
- Sicherstellung, dass die RNA für nachgeschaltete Anwendungen geeignet ist.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode durch visuelle Demonstration.
Verwendete Methoden
- Isolierung des Luminalinhalts aus murinen Zäkum.
- Mehrfache Lyse- und Extraktionsschritte mit saurem Phenol-Chloroform.
- Quantifizierung und Reinheitsbeurteilung der RNA.
- Visuelle Demonstration des Protokolls durch Laborpersonal.
Hauptergebnisse
- Es wurde hochwertige RNA erfolgreich aus den Proben isoliert.
- Die Methode erwies sich als wirksamer als herkömmliche Techniken.
- Die RNA eignete sich für qPCR und andere Analysen.
- Visuelle Hilfsmittel verbesserten das Verständnis des komplexen Verfahrens.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist zuverlässig für die RNA-Isolierung aus Pseudomonas aeruginosa.
- Sie kann für andere Darmmikroben angepasst werden.
- Zukünftige Studien können diese Technik für verschiedene Anwendungen nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung von hochwertiger RNA aus im Magen-Darm-Trakt kolonisierenden Pathogenen ermöglicht die mechanistische Absicherung von Virulenztargets in präklinischen Modellen. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung, indem sie die Genexpression von Bakterien mit Veränderungen des Immunstatus des Wirts verknüpft. Sie liefert eine vorhersagbare Sicherheit bei der Priorisierung von antiinfektiösen Kandidaten vor der Identifizierung von Leitverbindungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem in vivo-transkriptionelle Zustände von Pseudomonas aeruginosa während der Immunmodulation des Wirts erfasst werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch reproduzierbare Gewinnung von Pathogen-RNA aus komplexen gastrointestinalen Matrizes.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem bakterielle Genexpressionsänderungen mit dem Disseminierungsrisiko in neutropenischen Modellen korreliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem RNA bereitgestellt wird, die für qPCR- und Sequenzierungsanwendungen geeignet ist.
- Operativer Wert: Trägt zur Standardisierung von Assays bei, indem strenge Lyse- und Extraktionsschritte durchgeführt werden, die die Variabilität zwischen Chargen bei komplexen Proben minimieren.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht das Potenzial zur Wiederverwendung der Plattform, da die Methode an andere intestinale Bakterien und Pilze angepasst werden kann, um eine breite Zielgruppenscreening zu ermöglichen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht den Zusammenhang zwischen Entdeckung und präklinischer Kontinuität, indem RNA aus einem krankheitsrelevanten murinen Gastrointestinalkolonisationsmodell isoliert wird.
- Operativer Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem quantifizierbare Kennwerte zur RNA-Integrität (RIN ≥7,0, 260/280 1,7–2,0) als Go/No-Go-Kriterien bereitgestellt werden.
- Translationale Biomarker-Abstimmung: Erleichtert die mechanistische Absicherung, indem die von der Wirtsbedingung abhängige bakterielle Expression mit dem invasiven Potenzial verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase bis hin zur mechanistischen Validierung in präklinischen Arbeiten ein und ermöglicht RNA-basierte Nachweise zur Zielbestätigung.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Isolierung von RNA aus Bakterien, die im murinen Zäkum unter definierten Immunbedingungen leben.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays und quantitative Ergebnisse bereit, indem die Reinheit und Ausbeute der RNA mittels Spektrophotometrie und Bioanalyzer bestätigt wird.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisse (RIN, 260/280-Verhältnisse), die es fachübergreifenden Teams ermöglichen, die Konsistenz der Isolierung über verschiedene Bedingungen hinweg zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem ein Modell zur neutropenieinduzierten Dissemination verwendet wird, das für immungeschwächte Patientengruppen relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt das Protokoll als wiederverwendbare Methode zur RNA-Isolierung aus anspruchsvollen gastrointestinalen Matrizes über mehrere Pathogen-Screening-Kampagnen hinweg bereit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der Auswahl von Virulenzfaktoren.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zwischen Laboren durch definierte Lyse-, Extraktions- und Qualitätskontroll-Schritte.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, effizientere Kapitalnutzung und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen von Antiinfektiva-Programmen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf RNA-Qualität-bestätigten Daten zur Zielinteraktion.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrobiologischer Sicherheit, RNA-Handhabung und Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren.
- Benötigt Instrumente wie flüssigen Stickstoff, Vortexmischer, Zentrifugen (4 °C und RT), Spektrophotometer und Bioanalysatoren.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus, insbesondere hinsichtlich der Lysedauer, der sorgfältigen Phasentrennung und der konsistenten DNase-Behandlung.
- Erfordert Anpassungen an unterschiedliche Bakterienkonzentrationen, fäkale Belastungen und Probenviskositäten in verschiedenen Modellsystemen.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die zeitaufwendige, mehrstufige Extraktion sowie die Abhängigkeit von einer sorgfältigen Phasentrennung zur Vermeidung von Kontaminationen.
