Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mithilfe von Hellfeldmikroskopie, intravitale Mikroskopie und Zeitraffervideografie dynamische Interaktionen zwischen Neutrophilen und Endothelzellen während der Rekrutierung von Neutrophilen als Reaktion auf einen Neutrophilen-Chemoattractans in vivo zu untersuchen. In diesem Video demonstrieren wir die Verfahren, wie man die Hellfeld-Intravital-Videomikroskopie verwendet, um das intraluminale Wandern der Neutrophilen, die transendotheliale Migration und die Chemotaxis im Musculus cremaster des Mäuses zu visualisieren und zu bestimmen. Die Rekrutierung von Leukozyten ist ein Kennzeichen der Entzündung.

Dieser Rekrutierungsprozess beginnt, wenn Leukozyten im Blutstrom anfangen, auf dem Endothel der postkapillären Venulen an der Entzündungsstelle zu rollen. Als Reaktion auf Chemokine oder andere Chemoattractanten auf der endothelialen Oberfläche halten diese rollenden Leukozyten an und binden fest am Endothel. Nach der Adhäsion wandern viele Leukozyten auf der luminalen Oberfläche und scheinen nach einer optimalen Transmigrationsstelle zu suchen.

Nachdem wandernde Leukozyten über das Endothel gezogen sind, ein Vorgang, der als transendotheliale Migration bezeichnet wird, wandern Neutrophile im extravaskulären Gewebe in Richtung der Quelle des Chemoattractans am Entzündungsherd, ein Prozess, der als Chemotaxis bezeichnet wird. Dieses Video zeigt das Experiment, wie man Hellfeld-Intravital-Videomikroskopie, zeitaufgelöste Mikroskopie und ImageJ verwendet, um das intraluminale Wandern von Neutrophilen, die transendotheliale Migration sowie die Migration mittels Chemotaxis im Muskelgewebe zu visualisieren, zu verfolgen und zu bestimmen, und um die Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Chemoattractans aufzuzeichnen.

Hallo, ich bin Lis Liu vom Department für Pharmakologie am College of Medicine der University of Saskatchewan. Heute zeigen wir Ihnen, wie man den Neutrophilen-Chemoattraktans im Agar-Gel herstellt und wie man die Maus-Rückenzwillingsmuskulatur für die intravitale Mikroskopie vorbereitet.

Wie man die Zellbewegung mittels MEGJ verfolgt. Und schließlich, wie man die Parameter der Neutrophilenrekrutierung analysiert, zeigen Ihnen zwei Doktorandinnen in unserem Labor, Ngel Naja, sh, und Chile, anhand detaillierter experimenteller Verfahren. Hallo, ich bin Naja Sh. Hallo, ich bin Chile.

Um dieses Experiment zu beginnen, bereiten Sie zuerst das neutrophile Chemoattractans in Agarosegel vor. Pipettieren Sie 10 Milliliter zweifach konzentrierte PBS in einen 50-Milliliter-Kegelrohr. Erwärmen Sie das Rohr, indem Sie es in einen Becher mit heißem Wasser stellen. Pipettieren Sie 10 Milliliter destilliertes Wasser.

Fügen Sie 0,4 Gramm Agarosepulver einem weiteren 50-Milliliter-Konischenschlauch hinzu. Erhitzen Sie die Mischung in einem Mikrowellenofen, bis sie gerade zu kochen beginnt, um 2 % Agarose in PBS herzustellen. Geben Sie das warme zweifache PBS zur Agarose-Lösung in dem Schlauch hinzu.

Rühren Sie die gemischte Lösung um und halten Sie sie in dem Becher mit heißem Wasser warm. Mischen Sie die Chemoattraktantlösung gut mit drei Mikrolitern Tusche in dem Deckel eines 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchens. Vermeiden Sie beim Mischen die Bildung einer Luftblase.

Schneiden Sie das Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze ab und pipettieren Sie 110 Mikroliter Agro-Lösung bei 42 Grad Celsius in den Deckel und mischen Sie diese sofort gründlich. Bewahren Sie dieses Gel, das den Chemoattractant enthält, mit einer anderen Pipettenspitze im Kühlschrank auf, bis es verwendet wird. Betäuben Sie eine erwachsene männliche Maus durch eine intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus Xylazin und Ketamin.

Rasieren Sie den Bereich über der rechten äußeren Halsvene und der vorderen Seite des Skrotums. Nach der Anästhesie ist es wichtig, der Maus mit einem Elektrorasierer besondere Aufmerksamkeit und Sorgfalt zu widmen. Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um eine Hypothermie der Maus zu verhindern.

Die Maus sollte frei von Schmerzreflexen sein. Führen Sie einen horizontalen Schnitt durch, lokalisieren Sie die Vena jugularis und katheterisieren Sie sie mit einem PE-10-Schlauch, der mit einer Heparinlösung mit 100 Einheiten pro Milliliter gefüllt ist. Schließen Sie die Halterung an einen Wasserzirkulator mit 37 Grad Celsius an, um den Musculus cremaster und den größten Teil des Körpers warm zu halten.

Befestigen Sie die Hinterbeine der Maus mit Nabelbändern, wobei die am stärksten nach oben liegende Fläche auf dem Kremastermuskelbrett liegt. Führen Sie einen Schnitt in die Skrotalhaut ein, um den linken Kremastermuskel freizulegen. Dissezieren Sie den Muskel vorsichtig von der zugehörigen Faszie.

Superfusionieren Sie den Cremastermuskel mit auf 37 Grad Celsius erwärmtem bikarbonathaltigem Salin. Binden Sie eine 4,0-Naht am distalen Ende des Cremastermuskels fest, um ihn auf dem durchsichtigen Glassockel der Cremastermuskelplatte zu befestigen. Kauterisieren Sie den Cremastermuskel mit einer Elektrokauter-Vier-Ohm-Naht in Längsrichtung.

Halten Sie den Muskel flach und sichern Sie ihn entlang der Ränder am Sockel. Trennen Sie den Hoden und den Nebenhoden vom darunterliegenden Muskel und bewegen Sie sie in die Bauchhöhle. Geben Sie eine dünne Schicht Vakuumfett auf gegenüberliegende Kanten eines 22 mal 22 Millimeter großen Glasdeckels.

Decken Sie danach den freigelegten Muskel mit dem Glasdeckel ab. Platzieren Sie die Hauptmuskeltafel auf dem Mikroskoptisch. Untersuchen Sie den Muskel unter dem Mikroskop und finden Sie eine geeignete postkapillare Vene.

Wählen Sie das Gefäß mit einer normalen Scherrate und einem Durchmesser zwischen 25 und 40 Mikrometern aus. Stellen Sie die Videokamera so ein, dass das Gefäß in vertikaler Position entweder am rechten oder linken Rand des TV-Monitors sichtbar ist. Nehmen Sie nach 30 Minuten die Videobilder des ausgewählten postkapillären Gefäßes als Basis-Kontrollwerte mit einem Videorekordergerät, beispielsweise einem DVD-Rekorder, auf.

Dies sind die Referenzkontroll-Videobilder des postkapillären Venuls. Bevor der das Chemoattractans enthaltende Gel auf die Oberfläche des Musculus cremasteris aufgebracht wird, stoppen Sie die Überströmung und entfernen Sie die Glasdeckenscheibe vom Muskel. Stanzen Sie mit dem Deckel einer Eppendorf-Röhre ein einen Kubikmillimeter großes, das Chemoattractans enthaltendes Gel aus. Bringen Sie mithilfe der abgeschnittenen Spitze einer 200-µL-Pipettenspitze den ausgestanzten, das Chemoattractans enthaltenden Gel in einem vorab ausgewählten Bereich 350 µm vom beobachteten postkapillären Venul auf die Oberfläche des Musculus cremasteris auf.

Geben Sie einen Deckglaser auf, um das Gel an Ort und Stelle zu halten, und überführen Sie das Muskelgewebe sehr langsam, mit einer Geschwindigkeit von weniger als oder gleich 10 Mikrolitern pro Minute, um die Bildung eines Gradienten des Chemoattraktans zu ermöglichen, der langsam aus dem Gel freigesetzt wird. Nehmen Sie das Videobild 90 Minuten lang nach Zugabe des Gels, das den Chemoattraktans enthält, auf. Während der Aufnahme passen Sie den Fokus des Mikroskops an und halten Sie ihn auf die adhärierenden, kriechenden, transmigrierenden und chemotaktischen Leukozyten innerhalb des Gefäßes und im Muskelgewebe gerichtet.

Nach dem Experiment importieren Sie die Videodatei auf einen Computer. Zur Analyse am Computer extrahieren und konvertieren Sie das Video in ein VI-Format. Verwenden Sie beispielsweise eine kostenlose Computer-Software wie Bit-Ripper, um ein DVD-Video in eine AVI-Datei umzuwandeln.

Verwenden Sie eine Videobearbeitungssoftware, beispielsweise Windows Movie Maker, um aus dem ursprünglichen Echtzeitvideo einen Zeitrafferfilm zu erstellen, und speichern Sie den Zeitrafferfilm im DV-AVI-Format. Nehmen Sie Bilder des Kalibrier-Mikrometers unter denselben Mikroskopeinstellungen auf. Importieren Sie die Bilder auf den Computer.

Öffnen Sie die Bilder mit ImageJ. Messen Sie die Größe des Bildschirms entlang der X- und Y-Achse und berechnen Sie die Anzahl der Pixel pro Mikrometer. Um den Film zu importieren, öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie erneut auf „Datei“ und dann auf „Importieren“ mit dem QuickTime-Filme-Plugin, wählen Sie den zu analysierenden Film aus und klicken Sie im Interface des QT-Film-Öffners auf „OK“. Klicken Sie dann auf „Plugins“. Verwenden Sie die manuelle Verfolgung, um Zellen zu verfolgen. Füllen Sie die relevanten Informationen in die Felder am unteren Bildschirmrand ein, bevor Sie mit der Verfolgung beginnen. Folgende Parameter sollten vor der Verfolgung festgelegt werden: Zeit.

Das Intervall in Sekunden ergibt sich aus der gesamten Zeitspanne, geteilt durch 30. Die xy-Kalibrierung ist die Mikrometer-pro-Pixel-Messung aus der Kalibrierung des Mikrometerbildes. Die Z-Kalibrierung ist auf null gesetzt. Die Größe des Suchquadrats für die Zentrierung beträgt eins. Es ist notwendig, im aufgezeichneten Video einen stabilen und klaren Punkt als Referenzpunkt auszuwählen. Dieser Referenzpunkt kann jeder klare und kleine strukturelle Punkt sein, der während des gesamten Experiments unverändert und stabil bleibt.

Klicken Sie auf „Spur hinzufügen“, um den Referenzpunkt vom ersten bis zum letzten Bild zu verfolgen. Klicken Sie anschließend nacheinander auf die kriechenden und wandernden Neutrophilen, um diese zu verfolgen. Klicken Sie auf „Spur hinzufügen“, um die Zelle von ihrem Auftreten im Gewebe bis zu ihrem Verschwinden in jedem Bild zu verfolgen.

Klicken Sie dann und verfolgen Sie die Daten, um die Ergebnisse in Microsoft Excel abzuschließen und zu speichern. Öffnen Sie die Ergebnisdatei in Microsoft Excel. Beginnen Sie mit der Analyse der Daten.

Es ist wichtig, die Bewegungen des Referenzpunkts in die Analyse einzubeziehen. Bei der Verfolgung der Neutrophilen- und luminalen Wanderung bestimmen wir die Wanderstrecke und die Wanderungsgeschwindigkeit von Neutrophilen. Bei der Analyse der transendothelialen Neutrophilenwanderung messen wir die Zeit für die transmigratorische Wanderung und die Ablösezeit.

Bei der Bestimmung der Neutrophilen-Chemotaxis im Muskelgewebe messen wir die Distanz und Geschwindigkeit der Neutrophilen-Migration und Chemotaxis im Muskel und ermitteln zudem den Chemotaxis-Index während der Neutrophilen-Chemotaxis im Muskelgewebe. Die Definitionen dieser Parameter, die auf dem Bildschirm angezeigt werden, sind detailliert in unserem schriftlichen Protokoll beschrieben. In diesem Experiment demonstrieren wir die Verfahren, wie man die hellefeldmikroskopische intravitale Mikroskopie verwendet, um das intraluminale Wandern der Neutrophilen, die endotheliale Migration und die Migration während der Chemotaxis sichtbar zu machen und zu bestimmen.

Auf einen neutrophilen Chemoattractant in vivo hin verwendeten wir entweder MIP-2 (CXCL2) oder das synthetische Peptid W-K-Y-M-V-M, um einen Agaroselgel zur Rekrutierung von Neutrophilen im CMA-Muskelgewebe der Maus herzustellen. Wie wir dieser Abbildung entnehmen können, induzierten MIP-2 bei 0,5 µM und W-K-Y-M-V-M bei 0,1 mM das intraluminale Wandern von Neutrophilen mit ähnlichen Geschwindigkeiten. Die transendotheliale Migration der Neutrophilen sowie deren Ablösung vom Venenendothel waren hinsichtlich der Dauer vergleichbar.

Diese beiden Chemoattraktanten induzierten auch die Neutrophilenmigration und Chemotaxis im Muskelgewebe nahezu mit der gleichen Geschwindigkeit und wiesen ähnliche Neutrophilen-Chemotaxis-Indizes auf. Die intravitale Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur direkten Beobachtung des Rekrutierungsprozesses von Neutrophilen und zur quantitativen Bestimmung der Funktionen von Zellen und Molekülen in jedem Rekrutierungsschritt. Mithilfe der Zeitraffer-Videografie und von ImageJ können das intraluminale Wandern, die endotheliale Migration sowie die Migration in der Chemotaxis von Leukozyten und im Gewebe im Hellfeld, mittels intravitalem Mikroskop, unter Verwendung selektiver Inhibitoren, transgener Mäuse und selektiver Chemoattraktanten gemessen werden.

Das Testsystem kann uns helfen, die Funktionen spezifischer Proteine bei der Rekrutierung von Leukozyten aufzuklären.