Name: Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Brightfield-Intravitalmikroskopie und Zeitraffer-Video die intraluminale Krabbelbewegung, die transendotheliale Migration und die Chemotaxis von Neutrophilen im Maus-Cremaster-Muskel in Echtzeit visualisieren und quantitativ analysieren können.

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Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium aus kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749) unterstützt. L. Liu ist ein Empfänger CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Vorbereitung der Lockstoff in Agarose Gel <ol><li> Je 10 ml 2 × PBS in einem 50-mL konischen Rohr, und Aufwärmen der Röhre, indem Sie es in ein Becherglas mit heißem Wasser. </li><li> Je 10 ml destilliertem Wasser und 0,4 g Agarose Pulver in einem anderen 50-mL konischen Rohr (mit seiner Mütze etwas gelockert) und erhitzt die Mischung bis kurz Kochen in der Mikrowelle (für ca. 1 min in einem 700-Watt-Mikrowelle) . </li><li> Fügen Sie die erwärmte 2 × PBS für Agarose-Lösung Schlauch, wirbeln die gemischte Lösung und halten Sie sie warm in das heiße Wasser Becher. </li><li> Micropipette chemoattractant Lösung (z. B. 10 ul 0,5 ug CXC-Chemokin MIP-2 oder 12 ul 1 mM WKYMVm) in den Deckel eines 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 3 ul Tusche und gut mischen durch Absaugen mit einer Mikropipette (zu vermeiden Luftblase). </li><li> Schneiden Sie die Spitze eines 200-ul Pipettenspitze und Mikropipette 110 ul Agarose-Lösung (42 ° C) in den Deckel und sofort gut mischen mit einem anderen Pipettenspitze (Vermeidung von Luftblasen). </li><li> Bewahren Sie die Lockstoff-Gel bei +4 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der Cremaster Muskel für Intravital Mikroskopie (Abbildung 1) <ol><li> Anesthetize ein erwachsener Mann mit der Maus durch eine ip-Injektion einer Mischung von 10 mg / kg Xylazin und 200 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid. </li><li> Shave Bereich über rechte äußere Halsschlagader und der Vorderseite des Hodensacks mit einem elektrischen Rasierer. Nach der Anästhesie, ist es wichtig, besondere Aufmerksamkeit und Sorgfalt auf die narkotisierten Maus zu geben. Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um die Maus vor Unterkühlung zu verhindern. Die Maus sollte frei sein von Schmerz-Reflex. </li><li> Machen Sie ein horizontaler Schnitt, finden und Katheterisierung der Jugularvene mit einer PE-10-Schlauch mit 100 U / mL Heparin Kochsalzlösung gefüllt. Katheterisierung der Jugularvene für die Verabreichung von zusätzlichen Anästhesie und Medikamente benötigt, wenn erforderlich. </li><li> Fix Maus Hinterbeine mit Nabelschnur-Band mit der Maus mit dem Gesicht auf einem hausgemachten M. cremaster Bord (Abbildung 1). </li><li> Verbinden Sie das Board zu einem 37 ° C Wasser Thermostaten zu halten cremaster Muskel-und Maus Körper warm. </li></ol> Hinweis: Alle Verfahren 2,6 bis 2,14 müssen sehr vorsichtig 5 durchgeführt werden. <ol start="6"><li> Machen Sie einen Schnitt in der Haut des Hodensackes auf der linken M. cremaster aussetzen. Sorgfältig sezieren den Muskel aus dem zugehörigen Faszie. </li><li> Superfuse M. cremaster mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung (NaCl 131,9, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, in mM, pH 7,4) mit einer Schlauchpumpe. </li><li> Tie einem 4:0-Naht am distalen Ende des M. cremaster zu halten auf die klare Sichtscheibe Sockel des M. cremaster Bord. </li><li> Cauterize M. cremaster in Längsrichtung. Mit 4-0 Nahtmaterial, halten Sie die Muskeln flach und befestigen Sie es an den Rändern auf dem Podest. Trennen Sie die Hoden und Nebenhoden von der darunter liegenden Muskeln und verschieben Sie sie in die Bauchhöhle. </li><li> Superfuse der Muskel bei ~ 0,6 ml / min mit dem 37 ° C vorgewärmt Perfusionspuffer und decken den freigelegten Muskel mit einer 22 × 22 mm Deckglas. </li><li> Setzen Sie den M. cremaster Bord auf dem Mikroskoptisch, untersuchen Sie die Muskeln unter dem Mikroskop, einen geeigneten postkapillären venule (Wählen Sie die venule, dass gerade und unverzweigt ist und normale Scherrate und einen Durchmesser in 25-40 um) und passen Sie die Video-Kamera damit die venule zu sein in einer vertikalen Position auf der linken oder rechten Ende der TV-Monitor visualisiert. </li><li> Nach 30 min aus dem Gleichgewicht, Aufzeichnung der Videobilder der ausgewählten postkapillären venule für 5 min als Ausgangswert Steuerdaten mit Hilfe eines Video-Recorders. </li><li> Stoppen Sie die Superfusion und entfernen Sie das Deckglas auf den Muskel. </li><li> Ein ~ 1-mm 3 große Lockstoff-Gel auf der Oberfläche des M. cremaster in einem vorgewählten Bereich von 350 um und parallel zu den beobachteten postkapillären venule, fügen Deckglas auf das Gel in Position zu halten und superfuse das Muskelgewebe in einem sehr langsam (≤ 10 ml / min), um die Einrichtung einer Steigung von Lockstoff, die langsam freigesetzt wird und gebildet aus dem Gel zu ermöglichen. </li><li> Notieren Sie sich die Video-Bild für 90 min nach der Zugabe der Lockstoff Gel. Während der Aufnahme einstellen und halten das Mikroskop Fokus auf die Einhaltung, Krabbeln, transmigrating und chemotaxing Leukozyten im venule und im Muskelgewebe. </li><li> Nach dem Experiment, importieren Sie die Video-Datei auf einen Computer zur Auswertung. </li></ol> 3. Handy-Tracking mit ImageJ <ol><li> Auf einem Computer, extrahieren und konvertieren das Video in AVI-Format (zB Nutzung freier Software bitRipper auf DVD-Video zu AVI Datei umwandeln). </li><li> Verwenden Sie Video-Editing-Software, um die zeitversetzt Film zu erzeugen. Verwenden Sie zum Beispiel Windows Movie Maker zu einem zeitversetzt Film (auf 1 / 512 oder 1 / 1024 im Zeitraffer einet 30-fps-Rate) von der ursprünglichen, Echtzeit-Video. Konvertieren und speichern Sie die unkomprimierte zeitversetzt Films an ein DV-AVI-Format. </li><li> Notieren Sie sich die Bilder der Kalibrierung Mikrometer unter den gleichen Mikroskop-Einstellung, importieren Bilder auf den Computer, öffnen Sie die Bilder mit ImageJ. In ImageJ, erscheinen die insgesamt Pixel auf dem oberen Rand des Bildschirms (z. B. 720 × 480 Pixel) links. Messen Sie die Größe des Bildschirms an beiden Achsen X und Y (z. B. 200 × 150 pm). Daraus errechnen die Anzahl der Pixel pro um (zB x = 720/200 = 3,6 Pixel / um, und y = 480/150 = 3,2 Pixel / um). </li><li> So importieren Sie den Film, offene ImageJ wieder, klicken Sie auf "Datei-Import-Mit Quicktime Movies Plug-in", wählen Sie den Film zu analysieren und klicken Sie auf "OK" an der Schnittstelle von "QT Film Opener". </li><li> Klicken Sie auf "Plugins-Manual Tracking", um Zellen zu verfolgen. Füllen Sie die relevanten Informationen in die Felder unten vor dem Start Tracking-Systems. Kurz gesagt, <ol><li> Zeitintervall (in sec) = fold-time-lapse/30 (zum Beispiel ein 1020 × Zeitraffer wäre 1020-1030 = 34 sec / frame Intervall). </li><li> x / y = Kalibrierung der um / pixel-Messung mit der Kalibrierung des Bildes des Mikrometers. </li><li> z-Kalibrierung = 0 (wie die Maus M. cremaster einer extrem dünnen Schicht aus Gewebe und Zellen kriechen und Migration sind ca. 2D unter Hellfeld-Durchlicht ist). </li><li> Suche Quadratmeter Größe zur Zentrierung = 1. </li><li> Punktgröße / Line Breite / Schriftgrad: Sie können bei Bedarf angepasst werden. </li></ol></li><li> Wählen Sie einen stabilen und klaren Punkt als Bezugspunkt. Dieser Bezugspunkt kann eine klare und kleine struktureller Hinsicht, dass unverändert und stabil in der gesamten Experiment bleibt. Klicken Sie auf "Add Track" zum Bezugspunkt von der ersten bis zur letzten Frame aus und klicken Sie "End Track". Die Daten erscheinen auf den Ergebnissen Tabelle automatisch. </li><li> Spur kriecht und die Migration von Neutrophilen eins nach dem anderen: klicken Sie auf "Add Track", um die Zelle von ihrer Erscheinung in Gewebe bis zu seinem Verschwinden in jedem Frame aus und klicken Sie "End Track" zu beenden und speichern die Ergebnisse in Microsoft Excel. </li></ol> 4. Die Analyse der Neutrophilen Recruitment Parameters <ol><li> Öffnen Sie die Ergebnisse in Microsoft Excel, und die Daten analysieren (nehmen Sie die Änderungen der Bezugspunkt in-Analyse). </li><li> Intraluminale kriechen <ol><li> Crawling Distanz: die totale Entfernung der Zelle kriecht in das Lumen von der ersten Anhänger vor Ort, um die optimale Seelenwanderung Website (um). </li><li> Crawling Geschwindigkeit: Crawling Weg / Zeit (um / min). </li></ol></li><li> Transendotheliale Migration <ol><li> Transmigration Zeit: ab dem Zeitpunkt der Zelle beginnt in Endothel, um die Zeit abwandern, wenn die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule und keine Zelle Körper kann in das Lumen (min oder sec) gesehen werden. </li><li> Detachment der Zeit: von der Zeit die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule (unmittelbar nach der Seelenwanderung), um den Zeitpunkt, wenn die Zell-Kontakt verliert mit der venule (den Schwanz eingezogen) (min oder sec). </li></ol></li><li> Chemotaxis in Gewebe <ol><li> Laufstrecke: die Summe der Abstand der Zelle bewegt sich vom Startpunkt bis zum Endpunkt der Wanderung im Gewebe (um). </li><li> Geschwindigkeit der Migration: Laufstrecke im Gewebe / Uhrzeit (um / min). </li><li> Chemotaxis Entfernung: die Summe der Abstand der Zelle wandert in x-Achse im Gewebe (um). </li><li> Velocity der Chemotaxis: Chemotaxis Weg / Zeit (um / min). </li><li> Chemotaxis Index: Das Verhältnis der Aufteilung der Chemotaxis Abstand von der Laufstrecke im Gewebe. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Obwohl bightfield Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen benutzt wird und nicht unbedingt für Neutrophile, bestätigt uns, dass durch unsere Histologie Studien, mehr als 95% der rekrutierten Zellen in neutrophilen Lockstoff behandelten cremaster Muskeln waren in der Tat Neutrophilen . In diesem Bericht, mit Neutrophilen-selektive Lockstoffe, präsentieren wir Verfahren zur Verfolgung der Rekrutierung von Neutrophilen in vivo. Insbesondere beschreiben wir ein Protokoll der Tracking neutrophilen intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in cremaster Muskelgewebe in narkotisierten Mäusen mit Zeitraffer-Intravitalmikroskopie Video-Mikroskopie und ImageJ. Der Lockstoff-haltigen Agarosegel auf dem M. cremaster langsam freisetzt chemoattractant und ermöglicht einen Lockstoff-Gradienten in Gewebe festgestellt werden. Neutrophile chemoattractant induziert Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen in cremasterica postkapillären Venolen in Mäusen. Das ganze Experiment ist unter einer aufrechten Hellfeld intravital Mikroskop mit Videobildern von einer Farb-Videokamera zu einem TV-Monitor projiziert und von einem Videorecorder visualisiert. Wir bestimmten die Neutrophilenintraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Migration und Chemotaxis in Muskelgewebe als Reaktion auf neutrophilen chemoattractant MIP-2 und WKYMVm in Agarosegel hergestellt (Abb. 2). Wir fanden, dass MIP-2 (bei 0,5 pM) und WKYMVm (bei 0,1 mM) neutrophilen intraluminale kriechen hervorgerufen zu ähnlichen Geschwindigkeit, Neutrophilen transendotheliale Migration und Ablösung von der venule für vergleichbare Länge der Zeit, die Migration von Neutrophilen-Chemotaxis und im Muskelgewebe mit nahezu gleichen Geschwindigkeit und mit ähnlichen Neutrophilen-Chemotaxis Indizes (P&gt; 0,05, Student t-Test). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Die schematische Darstellung einer intravitalen Mikroskop-System. Die Maus M. cremaster ist auf der klare Sicht Sockel M. cremaster Bord auf Mikroskoptisch exteriorisiert und superfundiert mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung. Die aufrechten Mikroskop ist mit einem CCD-Farb-Videokamera für Hellfeld Intravitalmikroskopie verbunden. Eine monochrome tief gekühlte CCD-Kamera ist auch für Mikroskop-Port für die Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie verbunden, die Bilder aus, die direkt von einem Computer verarbeitet. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Neutrophil Rekrutierung Parameter Hellfeld Intravitalmikroskopie. Neutrophile Rekrutierung wurde durch die allmähliche Freisetzung von neutrophilen chemoattractant MIP-2 oder WKYMVm im Agarosegel Vorbereitung platziert 350 um neben der postkapillären venule induziert. Zeitversetzt Videodaten wurden von ImageJ nach der Verarbeitung der Echtzeit-Video-Aufzeichnung des Experiments analysiert werden. Neutrophile intraluminale kriechen (A), Seelenwanderung Zeit und Distanz der Zeit (B), Wanderungsgeschwindigkeit und Chemotaxis Geschwindigkeit im Gewebe (C), und Chemotaxis Index in M. cremaster (D) wurden nach der Verabreichung von MIP-2 oder WKYMVm Agarosegel festgestellt M. cremaster in C57BL / 6 Mäuse (n = 3, # der verfolgten Zellen = 22 (in A und B) und 27 (in C und D) bzw. für MIP-2 und = 26 (in A und B) und 44 ( in C und D) bzw. für WKYMVm).

<ol><li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment%3A+organ-specific+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li>
<li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+leukocyte+recruitment%3A+an+in+vivo+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li>
<li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites%3A+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li>
<li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li>
<li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research%3A+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li>
<li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li>
<li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entering+the+Portal%3A+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Imaging+Cellular+and+Molecular+Biological+Functions%22%5BJournal%5D)">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li>
<li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li>
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<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li>
<li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+accelerates%2C+but+is+not+required+for%2C+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Intravitalmikroskopie ist das wesentliche Werkzeug für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung. Quantitative Visualisierung für die Bestimmung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen in Mikrovaskulatur von transluzenten Gewebe wie M. cremaster und Mesenterium bleibt der Goldstandard für die Anwendung der Technik 1,5. Die konventionellen Hellfeld Intravitalmikroskopie hat viele einzigartige technische Ausstattung und die Rekrutierung M...

Tabelle: Materialien, Reagenzien und Geräte <table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polyethylen-Schlauch, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 mm × 0,61 mm OD </td></tr><tr><td> Tusche </td><td> Speedball Art </td><td> Super Black </td><td> 100% Rußpigment-keine Farbstoffe </td></tr><tr><td> Kauter </td><td> Aaron Medical </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin-Hydrochlorid </td><td> Bioniche Tiergesundheit Kanada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murine rekombinanten MIP-2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Olymp </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD Farb-Videokamera </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD-Videorecorder </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> TV-Monitor </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser Thermostaten </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Gilson, Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster Muskel Bord </td><td> University of Saskatchewan </td><td></td><td> Hausgemachte </td></tr></table>

tracking-neutrophil intraluminale crawling, transendotheliale migration und chemotaxis in tissue durch intravital video-mikroskopie

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Die Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten aus Blut, um das entzündete Gewebe ist ein wesentlicher und komplexer Prozess der Entzündung 1,2. In den postkapillären Venolen des entzündeten Gewebes, Leukozyten zunächst Leine und rollen auf der luminalen Oberfläche von venulären Wand. Rollende Leukozyten Festnahme am Endothel und unterziehen feste Verklebung als Reaktion auf Chemokin oder andere Lockstoffe auf die venulären Oberfläche. Viele adhärenten Leukozyten von der ersten Seite der Haftung auf dem junctional Extravasationsbezirks in Endothel zu verlagern, bezeichnet ein Verfahren, intraluminale kriechen 3. Nach kriechen, Leukozyten in Endothel (Seelenwanderung) bewegen und wandern in extravaskulären Gewebe in Richtung der Quelle der Lockstoff (Chemotaxis) 4. Intravitalmikroskopie ist ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung von Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in vivo und aufschlussreich zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten 2,5. In diesem Bericht stellen wir eine umfassende Beschreibung der Verwendung von Hellfeld Intravitalmikroskopie zu visualisieren und zu bestimmen, die genauen Abläufe des neutrophilen Rekrutierung in Maus M. cremaster in Reaktion auf den Verlauf eines Neutrophilen Lockstoff. Um neutrophilen Rekrutierung, ein kleines Stück Agarosegel (~ 1-mm Größe 3) mit neutrophilen chemoattractant MIP-2 (CXCL2, ein CXC-Chemokin) oder WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, ein synthetisches Analogon zu induzieren von bakteriellen Peptid) wird auf das Muskelgewebe neben den beobachteten postkapillären venule platziert. Mit Zeitraffer-Video Fotografie und Computer-Software ImageJ, Neutrophilen intraluminale Kriechen auf Endothel, Neutrophilen transendotheliale Migration und der Migration und Chemotaxis in Gewebe sichtbar gemacht und verfolgt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige und quantitative Analyse von vielen Neutrophilen Rekrutierung Parameter wie intraluminale krabbeln Geschwindigkeit, Seelenwanderung Zeit, Distanz Zeit, Wanderungsgeschwindigkeit, Chemotaxis Geschwindigkeit und Chemotaxis Index im Gewebe. Wir zeigen, dass dieses Protokoll verwenden, diese neutrophilen Rekrutierung Parameter stabil bestimmt werden können und die einzelne Zelle Fortbewegung bequem in vivo verfolgt.

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

Die Rekrutierung zirkulierender Leukozyten aus dem Blutstrom in das entzündete Gewebe ist ein entscheidender und komplexer Prozess der Entzündung1,2. In der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, mithilfe von Hellfeldmikroskopie, intravitale Mikroskopie und Zeitraffervideografie dynamische Interaktionen zwischen Neutrophilen und Endothelzellen während der Rekrutierung von Neutrophilen als Reaktion auf einen Neutrophilen-Chemoattractans in vivo zu untersuchen. In diesem Video demonstrieren wir die Verfahren, wie man die Hellfeld-Intravital-Videomikroskopie verwendet, um das intraluminale Wandern der Neutrophilen, die transendotheliale Migration und die Chemotaxis im Musculus cremaster des Mäuses zu visualisieren und zu bestimmen. Die Rekrutierung von Leukozyten ist ein Kennzeichen der Entzündung.Dieser Rekrutierungsprozess beginnt, wenn Leukozyten im Blutstrom anfangen, auf dem Endothel der postkapillären Venulen an der Entzündungsstelle zu rollen. Als Reaktion auf Chemokine oder andere Chemoattractanten auf der endothelialen Oberfläche halten diese rollenden Leukozyten an und binden fest am Endothel. Nach der Adhäsion wandern viele Leukozyten auf der luminalen Oberfläche und scheinen nach einer optimalen Transmigrationsstelle zu suchen.Nachdem wandernde Leukozyten über das Endothel gezogen sind, ein Vorgang, der als tr

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir eine nicht-invasive Zwei-Photonen (2P)-Mikroskopie Ansatz zur Untersuchung Leukozyten homing in der Maus Fußballen. Wir besprechen die technischen Aspekte unserer Tissue Imaging Vorbereitung und gehen den Leser durch ein typisches Experiment von der ersten bis zur Ausführung und Datensammlung eingestellt.

Nicht-invasive Bildgebung von Leukozyten Homing und Migration In vivo</em

Dieser Artikel beschreibt zunächst ein Verfahren zur Isolierung von humanen Endothelzellen aus Nabelschnur-Venen und zeigt dann, wie man diese Zellen verwenden, um Transmigration neutrophiler unter Strömungsbedingungen zu untersuchen. Durch die Verwendung eines geringen Mengen Strömungskammer aus einem Polymer mit den optischen Eigenschaften des Glases hergestellt ist, ist in lebenden Zellen Fluoreszenz-Bildgebung von seltenen Zellpopulationen möglich.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

Wir beschreiben ein Protokoll zur Überwachung des Verhaltens von Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen unter stationären und entzündlichen Bedingungen mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie an anästhesierten Mäusen.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Dieses aktuelle Protokoll verwendet Fluoreszenzreporter, In-vivo-Markierung und intravitale Bildgebungstechniken, um die Überwachung des dynamischen Prozesses des Neutrophilen-Primings bei lebenden Tieren zu ermöglichen.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Hier zeigen wir, wie man eine intravitale Mikroskopie auf postkapillaren Venulen des Maus-Cremaster-Muskels durchführt. Häufig angewendet auf verschiedene Modelle von Entzündungen und Sepsis, insbesondere solche, die durch Chemokine und Zytokine induziert werden, heben wir ihre Relevanz in der Untersuchung von Muskopathien mit übertriebener Muskel-Leukozyten-Infiltration hervor.

Leukozyten-Infiltration von Cremaster-Muskeln bei Mäusen bewertet durch Intravital-Mikroskopie

Hier beschreiben wir Methoden mit Zeitraffer-Phasen-Kontrast-Mikroskopie, um peritoneale Makrophagen in einem chemotaktischen Komplement C5a-Gradienten zu beleben. Die Protokolle können auf andere Immunzellen ausgedehnt werden.

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Die Migration von Neutrophilen beruht auf dem schnellen und kontinuierlichen Umbau der Plasmamembran als Reaktion auf den Chemolockstoff und seine Wechselwirkungen mit der extrazellulären Mikroumgebung. Hierin wird ein Verfahren beschrieben, das auf der Intravitalen Subzellulären Mikroskopie basiert, um die Dynamik des Membranumbaus bei Neutrophilen zu untersuchen, die in das Ohr von anästhesierten Mäusen injiziert werden.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur primären Isolierung von murinen T-Zellen und eine Zeitraffermikroskopie der T-Zellmigration unter spezifischen Umweltbedingungen mit quantitativer Analyse.

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

Die In-vivo-Bildgebung der Gelenke ist eine wertvolle Technik, um das Migrationsverhalten der Leukozyten und die molekulare Dynamik in den entzündeten Gelenken aufzudecken. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die in vivo Bildgebende der Gelenke mit einem Mausmodell der Typ-II-Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) vor.

Im lebenden Organismus Die Bildgebung deckt das Wanderverhalten der Leukozyten in den Gelenken auf

Erfahren Sie, wie Sie mit Brightfield-Intravitalmikroskopie und Zeitraffer-Video die intraluminale Krabbelbewegung, die transendotheliale Migration und die Chemotaxis von Neutrophilen im Maus-Cremaster-Muskel in Echtzeit visualisieren und quantitativ analysieren können.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

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