Name: Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger erwachsener Maus-Kardiomyozyten und Einzelzell-Genexpressionsanalysen mittels qPCR und Microarray. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in die zelluläre Variabilität der Herzzellen.

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Die Autoren bedanken sich bei der technischen Unterstützung von C. Zambataro während der Dreharbeiten zu diesem Protokoll zu bestätigen. Wir danken für die Unterstützung des Glenn Foundation for Medical Research (SM), Die Hillblom Fundament, und die National Institutes of Health für eine Nathan Shock Center Award (P30AG025708) und PO1AG025901. JMF wurde von T32AG000266 verliehen, die Buck Institute for Research on Aging unterstützt.

<ol><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).</li>
<li>Shioya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+isolating+healthy+heart+cells+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models.</a> J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).</li>
<li>Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+cell+fate+decisions+revealed+by+single-cell+gene+expression+analysis+from+zygote+to+blastocyst%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst.</a> Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).</li>
<li>Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).</li>
<li>D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+objective+copy+number+profiling+using+real-time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR.</a> Methods. 50 (4), 262-270 (2010).</li>
<li>Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).</li>
<li>Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Radiopaedia%22%5BJournal%5D)">Aorta.</a> Radiopaedia. , (2008).</li>
<li>Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+cell+populations+with+single-cell+gene+expression+profiling%3A+correlations+and+identification+of+astrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations.</a> Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).</li>
<li>Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).</li>
<li>Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cell-to-cell+variation+in+gene+expression+in+ageing+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart.</a> Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature%2C+nurture%2C+or+chance%3A+stochastic+gene+expression+and+its+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences.</a> Cell. 135 (2), 216-226 (2008).</li>
<li>Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Freier Zugang und Produktion dieses dieses Artikels ist Sigma-Aldrich gesponsert.</p

Diese Methode hat die Möglichkeit, Kardiomyozyten für eine Reihe von funktionalen als auch Genexpressionsstudien generieren. Die Untersuchung der einzelnen Zellen ist ein aktuelles Gebiet in der Genexpressionsanalyse. Der Vorteil der Untersuchung transkriptioneller Ebene auf der Ebene der einzelnen Zelle ist, dass sie die Prüfung eines reinen Zellpopulation, die nicht aus ganzen Gewebes Vorbereitungen möglich erlaubt. Darüber hinaus ermöglicht einzelne Zelle Analyse für die Prüfung der stochastischen Variation der mRNA-Spiegel in einzelnen Zellen auf Zellpopulationen, die bisher glaubten, eine homogene 8,9 definieren. Neben der Identifizierung von Genen, die möglicherweise stochastische in ihrer Genexpression 10,11,12 sind, die Methode ermöglicht es auch für die Identifizierung von seltenen Zellpopulationen durch ihre Genexpressionsprofile definiert. Während diese Methode bietet eine Reihe von spannenden Einsatzmöglichkeiten in der Genexpressionsanalyse, gibt es some Einschränkungen und Überlegungen in die Verwendung von einzelnen Zellen. Der primäre Beschränkung auf einzelne Zelle Analyse, ist die Sammlung von genügend Zellen in dem Experiment um eine statistische Signifikanz in Bezug auf die Metrik von Interesse zu erreichen, zum Beispiel Varianz. In Fällen, in denen die Zahl der Zellen aus dem Gewebe von Interesse isoliert ist keine Einschränkung, kann man untersuchen, Hunderte von Zellen pro Gruppe, wobei Ansätze wie der nächsten Generation Sequenzierung, oder nanofluidischen Arrays. In einigen Fällen kann es zu Schwierigkeiten bei der Beschaffung genügend Zellen aus dem Gewebe von Interesse sein. Dies kann zum Teil durch eigenwillige zeitintensive Verfahren für die Erhebung der gezielten Zelltyp verursacht werden. Allerdings kann eine sorgfältige Planung und Vorbereitung vor mit einzelnen Zelle Kollektion Verfahren noch einer strengen einzelne Zelle Analyse mit begrenzten technischen Fehler erlauben. Bei der Prüfung der Ergebnisse davon ausgegangen werden muss, dass, obwohl dieses Verfahren zur Isolierung von Zellen in zahlreichen studie verwendet wurdes (einschließlich Mikroskopie, Elektrophysiologie, etc.), könnte die Isolierung selbst potenziell Wirkung Genexpression. Wie bei jeder Methode, die biologischen Proben manipuliert, sollten Sie die Ergebnisse Ihrer Ergebnisse sorgfältig überprüft werden, um sicherzustellen, dass die einzelne Zelle Ausdruck steht stellvertretend für die Gewebe selbst und nicht technische Bias. Methoden wie in-situ-Hybridisierung kann nützlich sein, um diese Ergebnisse in der intakten Gewebe zu überprüfen. Schließlich ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass die generierten Daten sorgfältig für die Qualitätskontrolle überprüft. Die Daten in Abbildung 8 zeigt, dass qPCR-Assays können als sehr robust in ihrer Spezifität, wie z. B. Test Nr. 13 (A13) oder haben ein hohes Maß an Variabilität, die technische Varianz wie Assay # 34 (A34) führen kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71378 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 60128 </td><td></td></tr><tr><td> Brenztraubensäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4562 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54457 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1020 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 einbasischen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6721 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 72068 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O3777 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 21115 </td><td></td></tr><tr><td> Protease, Type XIV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Type I </td><td> Worthington </td><td> C9891 </td><td></td></tr><tr><td> 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) </td><td> TEKnova, </td><td> PN T0221 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8667 </td><td></td></tr><tr><td> Natrium-Pentobarbital </td><td> Henry Schein Vet. Versorgung * </td><td> Kontaktlieferant für die Bestellung </td><td> * Muss durch einen Tierarzt oder Versuchstier professionelle beschafft werden </td></tr><tr><td> ExoSAP IT </td><td> Affymetrix / USB </td><td> 78201 </td><td></td></tr><tr><td> CellsDirect 2x Rxn Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 11737-030 </td><td></td></tr><tr><td> SuperScript III RT Platinum Taq Mix </td><td> Invitrogen </td><td> 10928-042 </td><td></td></tr><tr><td> RT-STA Primermischung </td><td> IDT </td><td> Brauch </td><td></td></tr><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W4502 </td><td></td></tr><tr><td> WTA2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50rxn </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28104 </td><td></td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop Spektralphotometer </td><td>NanoDrop </td><td> 2000c </td><td></td></tr><tr><td> BioAnalyzer DNA 7500 Kit </td><td> Agilent </td><td> 7500 Kit </td><td></td></tr><tr><td> Eine Farbe Labeling Kit </td><td> Roche NimbleGen- </td><td> 5223555001 </td><td></td></tr><tr><td> Mus Musculus 12x135k Array </td><td> Roche NimbleGen- </td><td> 5543797001 </td><td></td></tr><tr><td> GenePix 4200A Scanner </td><td> Molecular Devices </td><td> 4200A </td><td></td></tr><tr><td> TransPlex Ganzes Transkriptom Amplification Kit (WTA2 Kit) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> WTA2-50RXN </td><td></td></tr></tbody></table>

single cell transcriptional profiling der erwachsenen maus kardiomyozyten

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Während zahlreiche Studien Veränderungen der Genexpression aus Homogenaten von Herzgewebe untersucht haben, verhindert dies die Untersuchung der inhärenten stochastischen Variation zwischen den Zellen innerhalb eines Gewebes. Isolierung von reinen Kardiomyozyten Populationen durch eine Kollagenase Perfusion von Mäuseherzen vereinfacht die Erstellung von einzelnen Zelle Microarrays für die ganze Transkriptom-Genexpression oder qPCR spezifische Ziele mit nanofluidischen Arrays. Wir beschreiben hier ein Verfahren zur einzelnen Zelle Genexpressionsprofile von Kardiomyozyten aus dem Herzen isoliert zu untersuchen. Dieses Paradigma ermöglicht die Auswertung der Messdaten von Interesse, die nicht auf den Mittelwert angewiesen (zB Varianz zwischen den Zellen innerhalb eines Gewebes), die nicht möglich ist, wenn mit konventionellen ganze Gewebe Workflows für die Auswertung der Gen-Expression (Abbildung 1). Wir haben robuste Verstärkung der einzelnen Zelle Transkriptom Nachgeben Mikrogramm doppelsträngigen cDNA, dass der Einsatz von Microarrays auf i erleichtert erreichtndividuelle Zellen. In das Verfahren beschreiben wir die Verwendung von NimbleGen Arrays, die für ihre Benutzerfreundlichkeit und die Fähigkeit, ihr Design anpassen ausgewählt wurden. Alternativ kann ein Reverse-Transkriptase - ermöglicht spezifische Target-Amplifikation (RT-STA) Reaktion, für die qPCR von Hunderten von Zielen durch nanofluidischen PCR. Mit diesen beiden Ansätzen ist es möglich, die Variabilität des Ausdrucks zwischen den Zellen, sowie die Prüfung Expressionsprofile von seltenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes zu untersuchen. Insgesamt ermöglicht die einzelne Zelle Genexpression Ansatz für die Generierung von Daten, die möglicherweise identifizieren können eigenwilligen Ausdruck Profile, die typischerweise sind bei der Prüfung Ausdruck von Millionen von Zellen, die aus typischen Homogenaten von ganzen Geweben erzeugt werden gemittelt.

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Während zahlreiche Studien Genexpressionsänderungen in Homogenaten von Herzgewebe untersucht haben, verhindert dieser Ansatz die Untersuchung der inhärenten stochastischen Variation ...

Die Ziele dieser Präsentation bestehen darin, zunächst die Isolierung lebensfähiger Kardiomyozyten aus erwachsenen Mäusen zu veranschaulichen und anschließend zwei Methoden zur Genexpressionsanalyse einzelner Zellen zu demonstrieren. Nach der Entnahme des Herzens von einer Maus wird das Herz mit einer Kollagenase-Digestionslösung perfundiert, um Einzelzellen zu gewinnen. Für die quantitative PCR einzelner Zellen werden die gereinigten Zellen direkt QPCR-Assays unterzogen. Die isolierten Kardiomyozyten können auch für die Microarray-Analyse verwendet werden. Die Microarray-Analyse einzelner Zellen umfasst die mRNA-Extraktion, die Amplifikation des gesamten Transkriptoms über eine plex-Bibliothek, gefolgt von einer begrenzten Amplifikation und schließlich der Markierung und Hybridisierung auf einem Microarray-Chip. Der letzte Schritt beider Verfahren dient der Sicherstellung von qualitativ hochwertigen Daten.Mit diesen Verfahren wird gezeigt, dass eine robuste Genexpressionsanalyse aus individuell isolierten adulten Kardiomyozyten möglich ist. Der Vorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden, wie der Genexpressionsprofilierung von gesamtem Gewebelysat, liegt darin, dass die Einzelzell-Genexpression es ermöglicht, Informationen über die Expression innerhalb einer einzelnen Zelle sowie über die Variabilität der Expression zwischen Zellen zu erhalten. Beginnen Sie mit einem vorbereiteten Isolationssystem, einschließlich der erforderlichen Lösungen und Puffer, sedieren Sie ein Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 0,25 Millilitern Natriumpentobarbital-Lösung terminal und stellen Sie sicher, dass die Maus bewusstlos ist und nicht auf Schmerzreize reagiert.Verwenden Sie keine Kohlendioxid-Betäubung oder Halsbruch, um die Maus zu töten, bevor die Maus aufhört zu atmen. Achten Sie darauf, die Atmung vorsichtig abzuschneiden. Öffnen Sie die Brusthöhle entlang des Thoraxrands durch das Zwerchfell hindurch.Danach nach oben hin überstehend schneiden und den vorderen Rippenkorb reflektieren. Das Herz vorsichtig in eine vorgeschnittene Plastikpipette ansaugen und das Herz aus dem Thorax entfernen. Das Herz in kalte Digestionslösung fallen lassen.Puffer A und spülen Sie das Blut nach 15 bis 45 Sekunden ab, führen Sie eine zweite kurze Spülung in Puffer A durch und überführen Sie dann das Herz in die Petrischale mit Puffer A und platzieren Sie es unter ein Dissektionsmikroskop. Isolieren Sie vorsichtig die Aorta und ihre Seitenäste. Schneiden Sie die Aorta direkt unterhalb des letzten Seitenastes ab.Bringen Sie die Kanülenspitze in die Aorta oberhalb der Koronararterien ein und fixieren Sie sie mit einer Vier- oder Sechs-U-Naht. Beginnen Sie die Perfusion mit Verdauungspuffer A. Der Ausfluss wechselt von rot zu klar, während das Blut aus dem Herzen gespült wird. Die Zeitdauer zwischen der Tötung des Tieres und der Anbindung des Herzens an die Perfusionsapparatur ist entscheidend.Im Idealfall sollte dies unter fünf bis zehn Minuten gehalten werden. Außerdem muss die Temperatur der Flüssigkeit, die durch die Perfusionsvorrichtung fließt, bei 37 Grad Celsius gehalten werden. Wenn sie zu heiß oder zu kalt ist, wird das Gewebe zerstört.Sobald das Blut aus dem Herzen gewaschen ist, wechseln Sie zur Verdauungspufferlösung und perfundieren Sie das Herz zwei bis drei Minuten lang, bis es seine Form verliert und rundlicher erscheint. Das Myokard sollte im Verlauf der Perfusion heller aussehen. Schneiden Sie nun die Ventrikel ab und zerkleinern Sie sie in kleinere Stücke.Geben Sie das Ventrikulargewebe in ein 50-Milliliter-Konischglas, das 15 Milliliter warmes Sammel-Puffer enthält. Mischen Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Plastikpipette im Puffer, um eine Einzelzellkardiomyozyten-Mischung herzustellen. Nach einer Minute überführen Sie die Mischung in ein neues Gefäß und lassen sie absetzen, nachdem sich das Pellet gebildet hat.Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Puffer für die Neutralisationswäsche. Die Zellen können nun für die Einzelzellanalyse ausgewählt werden.Verdünnen Sie die Zellen in einer kleinen Petrischale, sodass sie einzeln ausgewählt werden können. Wählen Sie unter dem Mikroskop gesunde Einzelzellen mit einer angezogenen Pipette, die an eine Luftschleuse angeschlossen ist. Vermeiden Sie beim Aufsammeln der Zellen Kontaminationen und halten Sie das Aufnahmenvolumen auf weniger als zwei Mikroliter minimiert.Platzieren Sie die einzelnen Zellen auf dem Boden einzelner PCR-Röhrchen und gefrieren Sie diese sofort auf Trockeneis ein. Lagern Sie die Zellen anschließend bei minus 80 Grad Celsius. Beginnen Sie damit, alle Primerpaare für die Gene des Interesses auf 100 µM und einen XDNA-Suspensionspuffer zu resuspendieren, kombinieren und verdünnen Sie die Primerpaare auf 20 µM. Verdünnen Sie schließlich alle Primerpaare zu einer Lösung mit einer Endkonzentration von 200 nM.Mit den vorbereiteten Primerlösungen den Mastermix ansetzen, gefrorene Zellen unmittelbar aus dem Gefrierschrank entnehmen und 30 Sekunden lang mit maximaler Kraft zentrifugieren. Dann neun Mikroliter des Mastermixes zu jedem Reaktionsgefäß hinzufügen und mit der PCR fortfahren. Die Röhrchen aus dem PCR-Gerät nehmen und vier Mikroliter Exonuklease zu jeder Reaktion hinzufügen.Führen Sie dann jede Reaktion 15 Minuten bei 37 Grad Celsius durch, gefolgt von 15 Minuten bei 80 Grad Celsius. Schließen Sie ab, indem Sie die Proben bei vier Grad Celsius lagern. Verdünnen Sie anschließend die Proben im Verhältnis 1 zu 5 mit DNA-Suspensionspuffer.Die Proben sind nun bereit für die quantitative PCR-Analyse. Wir verwenden nun dieses Material und das Fluid-IMS-BIOMARK-System mit den 48-Punkt-48- oder 96-Punkt-96-Genexpressionsarrays. Es ist möglich, auch traditionellere QPCR-Formate wie 96-Well- und 384-Well-Platten zu verwenden.Das Wella-Format beschränkt jedoch die Anzahl der durchführbaren Assays, die von einer einzelnen Zelle ausgehen. Dieser Prozess nutzt Sigmas WTA-Zwei-Kit, das doppelsträngige cDNA sowohl aus Pellets als auch aus Einzelzellen amplifizieren kann. Das Kit durchbricht zunächst die Membran der Einzelzellen und amplifiziert anschließend die Botenmoleküle in zwei Runden.Nach Durchführung des Bibliothekspräparationsschritts ein Fünftel der Bibliotheksprobe zu 70 Mikrolitern der WTA-two-Amplifikations-Master-Mix hinzufügen und die Proben mithilfe der Kit-Parameter für 25 Zyklen amplifizieren. Anschließend die Proben mit dem Kayak-Quick-PCR-Reinigungs-Kit reinigen und am Cain's-Kayak-Cube verarbeiten. Nach Abschluss die gereinigten Proben mittels Vakuumtrocknung auf fünf Mikroliter konzentrieren und mit dem WTA-two-Kit 17 zusätzliche Amplifikationszyklen unter denselben Parametern wie bei der vorherigen Amplifikation durchführen.Reinigen Sie die Proben wie zuvor und überprüfen Sie deren Qualität mithilfe eines NanoDrop-Spektrophotometers und des Agilent Bioanalyzer DNA 7500-Kits. Kennzeichnen Sie nun zwei Mikrogramm doppelsträngiger cDNA aus jeder amplifizierten Zellprobe mit Nimbles Gen One-Color-Labeling-Kit. Hybridisieren Sie fünf Mikrogramm der mit CY3 markierten Probe an ein NimbleGen-Genexpressionsarray. Nach der Hybridisierung waschen und trocknen Sie den Objektträger, damit er abgebildet werden kann. Verwenden Sie einen Genepix 4200A-Scanner von Molecular Devices mit den Einstellungen, die auf 100 POW und 300 bis 350 PMT kalibriert sind.Analysieren Sie die Genchips und erzeugen Sie anschließend Paikdateien für jedes Array mithilfe der NimbleGen-Software NimbleScan und fahren Sie mit der Datenanalyse fort. Ein erfolgreich perfundiertes Herz ergab einen hohen Prozentsatz gesunder Herzzellen, die ihre typische rechteckige Morphologie beibehielten. Falls die Perfusion nicht gut funktioniert hätte, wären viele Zellen abgestorben.Die Zellen wurden mit der WTA-Zwei-Methode amplifiziert und die Qualität der Endprodukte wurde überprüft. Die Probe zeigte eine starke Amplifikation sowohl in der Ablesung des Nano-Drop-Spektrometers als auch im Elektropherogramm des Bioanalyzer-Chips. Zusammenfassend wurden viele Gene in den Kardiomyozyten stark exprimiert.Jedoch sind nicht alle Assays gleich zuverlässig, wie in dieser Wärmekarte der Schmelztemperatur-Peaks aus einem Teil der nano fluid bei QPCR-Daten zu sehen ist. Jede Zeile dieser Karte repräsentiert eine einzelne Zellprobe in 43 separaten QPCR-Assays. Einige Assays weisen erhebliche Variabilität auf und sind wahrscheinlich weniger zuverlässig als solche mit höherer PCR-Spezifität.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass qualitativ hochwertige Zellen von Anfang an gewonnen werden müssen. Dies gewährleistet die Qualität Ihrer nachfolgenden Genexpressionsanalyse. Sobald das Verfahren beherrscht ist, kann die Einzelzellisolation in weniger als zweieinhalb Stunden abgeschlossen werden, und die Genexpressionsprofilerstellung anhand dieser Zellen kann in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl einzelner nicht-kardiomyozyten mit hoher Viabilität aus einem Mausherzen nach einem Myokardinfarkt (MI). Dies kann für die anschließende Einzelzellsequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse und primäre Zellkultur verwendet werden.

Herstellung einer Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einem erwachsenen Mausherzen nach Myokardinfarkt

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Erfahren Sie die Isolierung lebensfähiger erwachsener Maus-Kardiomyozyten und Einzelzell-Genexpressionsanalysen mittels qPCR und Microarray. Diese Methode ermöglicht detaillierte Einblicke in die zelluläre Variabilität der Herzzellen.

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Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

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