Name: Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen zyklischen Druck-Bioreaktor zur Untersuchung der Mechanobiologie von Aortenklappengewebe nutzen. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Experimente zur Analyse biologischer Reaktionen auf Druckveränderungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Shad Schipke und Daniel Chesser für ihre Hilfe bei der Konstruktion und Fertigung des Systems und Valtresa Myles für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.

1. Tissue Ernte und Zubereitung <ol><li> Aortenklappen sollte von ausgewachsenen Schweinen mit einem Gewicht von nicht mehr als £ 120 unmittelbar nach dem Tod gesammelt werden. </li><li> Waschen Sie die Ventile zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Transport ins Labor auf Eis. </li><li> Alle weiteren Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Flugblätter zeigen keine Anzeichen von Degeneration, Reißen oder Verkalkung. Entfernen Sie Prospekte von der Aortenwurzel, indem 1 / 3 des Abstandes von der Ring. </li><li> Ort Flugblätter in einzelnen Vertiefungen einer sechs-Well-Platte und inkubieren mit 3ml Dulbeccos Modified Eagle Medium mit 1% anti-biotic/anti-mycotic-Lösung und 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C und 5% CO 2 ergänzt Nacht. </li><li> Als Alternative isolierten Zellen lassen sich in sechs-well-Platten ausgesät werden und in der Druck-Gerät. Isolation des Ventils Endothelzellen und interstitiellen Zellen kann wie bisher 13, 14 beschrieben werden. </li></ol> 2. Pressure Studies <ol><li> Eine maßgeschneiderte Druck-System wurde entwickelt, um die mechanobiological Auswirkungen von zyklischen Druck auf Aortenklappe Gewebe 15 zu studieren. </li><li> Melden Sie sich an den Computer und öffnen Sie die LabVIEW-Programm (Abbildung 1). </li><li> Kalibrierung: <ol><li> Vor Experimenten, sollte das System korrekt kalibriert werden. </li><li> Schließen Sie das Netzteil an die Platine. Dieser versorgt die Magnetventile, dass der Luftstrom in und aus der Kammer zu steuern. </li><li> Achten Sie darauf, die Druckluft an das System angeschlossen ist, und öffnen Sie die Luftzufuhr in voller Geschwindigkeit. </li><li> Schalten Sie den Signalverstärker. Achten Sie darauf, die Spannung zu lesen ist 0,00. Passen Sie bei Bedarf </li><li> Die LabVIEW-Schnittstelle verfügt über einen Schalter mit der Aufschrift "TEST / RECORD". Sicherstellen, dass die Schalter auf "TEST". Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Aufschrift "Air Supply" mit dem Einlass-Magnetventil geöffnet. </li><li> Mit dem Gas-Druckregler, Druck der Kammer mit Druckluft bei 1 PSI. Der Druck in der Kammer kann mit dem digitalen Manometer an der hinteren Endplatte der Kammer befinden. Sobald der Druck äquilibriert, notieren Sie die Spannung Lesung aus dem Signalverstärker. Wiederholen Sie für 2, 3, 4 und 5 PSI. </li><li> Konstruieren Sie eine Eichkurve Druck vs Spannung. Der Druck sollte von PSI zu mmHg umgewandelt werden. Die Gleichung von der Grafik kann in den Code der LabVIEW-Programm platziert werden </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Aluminium-Frontplatte aus der Druckkammer und besprühen Sie die Kammer mit 70% Ethanol. Lassen Sie für ein Minimum von 10 Minuten, damit Restethanol Dämpfe zu zerstreuen. </li><li> Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit dem Flugblatt Proben in der Kammer und ersetzen Sie die vordere Endplatte. Sicherstellen, dass die Dichtung luftdicht ist durch Anziehen der Muttern auf die vier Gewindestangen (befindet sich an jeder Ecke der Endplatte) von Hand entfernt. Legen Sie die Druckkammer in der 37 ° C Inkubator. Eine schematische Darstellung der Druckkammer ist in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Die Schnittstelle wird der Benutzer aufgefordert, die Zeit, das System Zyklen zwischen Druckluft-und Ausgang bietet. Diese sollten auf 0,6 Sekunden und 0,4 Sekunden zu imitieren diastolischen und systolischen Bedingungen bzw. bei einer Frequenz von 1 Hz eingestellt werden. Der Benutzer sollte auch einen Datei-Pfad. </li><li> In LabVIEW, klicken Sie laufen und schalten Sie den "TEST / RECORD" toggle auf "RECORD". </li><li> Vergewissern Sie sich, der Druck auf dem gewünschten Niveau mit der Grafik auf der LabVIEW-Schnittstelle. Der Druck kann mit dem Gasdruckregler werden. </li><li> Run-Programm für die gewünschte Länge der Zeit. </li><li> Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Stopp-Taste auf LabVIEW, schalten Sie Luftzufuhr und öffnen Sie das Auslassventil auf der Druckkammer. </li><li> Entfernen Sie die vordere Endplatte aus der Kammer und Abrufen von sechs Well-Platte mit Proben. Muster können ab sofort für die Genexpression, Proteinexpression, Histologie, mechanische Eigenschaften usw. analysiert werden </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Der Druck ist für die Simulation maximale transvalvuläre Drücke unter normotensiven beobachtet, Stufe I und Stufe II hypertensive Bedingungen. Allerdings war der Druck nicht in der Lage, den systolischen Druckgradienten, die im wesentlichen Null ist in vivo nachahmen. Die Frequenz ist bei 1 Hz erhalten, mit einem Lufteinlass Zeit 0.6s und eine Abgas-Zeit von 0,4 Sekunden. Vertreter Druckkurven von normalen und erhöhten Druck Bedingungen aus dem System erhalten können in Bild 3 zu sehen. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Screenshot der LabVIEW-Schnittstelle. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der Druckkammer A. Isometrische Ansicht der Druckkammer; B. Seitenansicht der Druckkammer;C. Draufsicht Druckkammer. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Graph der Druck-Simulation in der Druckkammer bei (A) normotensiven, (B) Stadium I hypertensive und (C) Stufe II hypertensive Bedingungen.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der Druck-System erfolgreich Aortenklappensegel zyklische Belastungen, die Vertreter der diastolische Druck transvalvuläre ausgesetzt waren. Allerdings war es nicht möglich, systolische Druck transvalvuläre imitieren, da der Druck nur sank auf 40 mmHg. Transvalvuläre Druck ist der Unterschied zwischen dem Druck in der Aorta ascendens und des linken Ventrikels. Während der Diastole, wenn das Ventil geschlossen ist, wird die Druckdifferenz unter normotensiven Bedingungen und 90 mmHg 80mmHg und 100 mmHg im Stadium I und St...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Sigma </td><td> D5652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-mycotic/antibiotic Lösung </td><td> Sigma </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Viton-Membran-Magnetventile </td><td> McMaster Carr </td><td> 4868K11 </td><td></td></tr><tr><td> Druckaufnehmer </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> PX302-200GV </td><td></td></tr><tr><td> Wägezelle conditioner </td><td> Encore Electronics, Inc. </td><td> 4025-101 </td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition (DAQ) Module </td><td> Measurement Computing </td><td> PMD1608 </td><td></td></tr></tbody></table>

entwurf eines zyklischen druck bioreaktor für die ex vivo studium der aorten-herzklappen

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Die Aortenklappe zwischen der linken Herzkammer und der Aorta befindet, ermöglicht die unidirektionale Durchblutung und verhindert Rückfluss in die Herzkammer. Aortenklappensegel sind der interstitiellen Zellen innerhalb einer extrazellulären Matrix (ECM) suspendiert und mit einer endothelialen Monolayer gesäumt zusammen. Das Ventil hält eine harte, dynamischen Umfeld und ist ständig zu scheren, Flexion, Spannung und Kompression ausgesetzt. Die Forschung hat calcific Läsionen in erkrankten gezeigten Ventile kommen in Bereichen mit hoher mechanischer Belastung als Folge der endothelialen Störung oder interstitielle Matrix Schaden 1-3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass epidemiologische Studien haben hohen Blutdruck, eine führende Risikofaktor bei der Entstehung von Aortenvitien 4 dargestellt. Die einzige Behandlungsmöglichkeit, die jetzt bei Herzklappenerkrankungen ist die chirurgische Ersatz des erkrankten Ventil mit einem bioprothetischen oder mechanische Ventil 5. Verbessertes Verständnis des Ventils Biologie in Reaktion auf körperliche Belastungen helfen würde, Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese Ventil. Im Gegenzug könnte dies in der Entwicklung von nicht-invasive Therapien wie pharmazeutische Intervention oder Prävention zu helfen. Mehrere Bioreaktoren wurden bereits entwickelt, um die Mechanobiologie von nativen oder Herzklappen 6-9 studieren. Pulsierende Bioreaktoren sind auch entwickelt worden, um einer Reihe von Geweben einschließlich Knorpel 10, 11 und Knochen Blase 12 zu studieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine zyklische Druck-System, verwendet, um die biologische Reaktion der Aortenklappensegel zu einer erhöhten Druckbelastung klären könnten zu entwickeln. Das System bestand aus einem Acryl-Kammer, in der Proben Ort und produzieren zyklische Druck, Viton Membrane Magnetventile, um das Timing der Druck Zyklus zu steuern, und einen Computer, um elektrische Geräte zu steuern. Der Druck wurde unter Verwendung eines Druckaufnehmer, und das Signal war bedingt durch eine Kraftmessdose Conditioner. Ein LabVIEW-Programm reguliert den Druck mit einem analogen Gerät mit Druckluft ins System zu pumpen an der entsprechenden Rate. Das System imitiert die dynamische transvalvuläre Druckniveaus mit der Aortenklappe verbunden, eine Sägezahnwelle produziert eine schrittweise Erhöhung des Drucks, die typisch für die transvalvuläre Druckverlauf, der derzeit über dem Ventil ist während der Diastole, durch einen scharfen Druckabfall darstellt Ventilöffnung in gefolgt Systole. Die LabVIEW-Programm erlaubt Benutzern, das Ausmaß und die Häufigkeit der zyklische Druck zu kontrollieren. Das System war in der Lage, um Gewebeproben zu physiologischen und pathologischen Druckverhältnissen unterworfen. Dieses Gerät kann verwendet werden, um unser Verständnis, wie Herzklappen, um Änderungen in der lokalen mechanischen Umfeld zu reagieren erhöhen.

Eine zyklische Druck Bioreaktor in der Lage zu unterwerfen Herzklappengewebe zu physiologischen und pathologischen Druckverhältnisse ausgelegt ist. Ein LabVIEW-Programm ermöglicht es Benutzern, Druck Größe, Amplitude und Frequenz-Steuerung. Dieses Gerät kann verwendet werden, um die Mechanobiologie der Herzklappe Gewebe oder isolierte Zellen zu studieren.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

Die Aortenklappe, die sich zwischen dem linken Ventrikel und der Aorta befindet, ermöglicht einen unidirektionalen Blutfluss und verhindert so den Rückfluss in den Ventrikel. Aorten...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die biologische Reaktion von Aortenherzklappengewebe oder -zellen auf zyklischen Druck zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Klappengewebe aus minderwertigen Herzen isoliert und über Nacht in einem Gewebekulturmedium inkubiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass das Drucksystem kalibriert ist. Weiter.Das Ventilgewebe oder die Zellen werden in das Drucksystem eingebracht. Die Kammer wird in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt, und das zyklische Druckprofil wird über den gewünschten Zeitraum und mit der gewünschten Stärke und Frequenz gestartet. Schließlich wird das Gewebe aus dem System entnommen, um eine biologische Analyse durchzuführen.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, wie erhöhter Druck die Gen- und Proteinexpression mittels Echtzeit-PCR, Western Blotting oder Mikroskopie beeinflusst. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Wirkungen mechanischen Drucks von anderen mechanischen Kräften und biochemischen Stimulanzien trennen können. Dies ist ein Vorteil gegenüber anderen Techniken wie Tiermodellen, obwohl letztere uns helfen können, die Weise zu verstehen, in der mechanische Kräfte die Biologie und die Pathogenese von Herzklappen beeinflussen.Es kann außerdem zur Entwicklung gewebetechnischer Konstrukte verwendet werden. Ein Demonstrationsdurchgang dieses Verfahrens für uns wird von Toy Fate, einem Doktoranden in meinem Labor, durchgeführt, um Gewebe für den Druck vorzubereiten.Studien sammeln Aortenklappen von adulten weiblichen Schweinen mit einem Gewicht von nicht mehr als 120 Pfund unmittelbar nach dem Tod. Waschen Sie die Klappen zweimal mit steriler PBS-Lösung, legen Sie sie anschließend auf Eis und transportieren Sie sie ins Labor. Alle weiteren Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.Stellen Sie sicher, dass die Segel keinerlei Anzeichen einer Degeneration, Einrischung oder Verkalkung aufweisen. Entfernen Sie die Segel von der Aortenwurzel, indem Sie ein Drittel der Strecke vom Anulus entfernt abschneiden. Legen Sie die Segel in einzelne Vertiefungen einer 6-Loch-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid mit je drei Milliliter DMEM, das mit 1 % Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung und 10 % fetalem Kälberserum ergänzt wurde. Dieses Drucksystem ist eine Sonderanfertigung und wurde entwickelt, um die mechanobiologischen Effekte zyklischen Drucks auf das Gewebe der Aortenklappe zu untersuchen. Um das System zu benutzen, melden Sie sich am Computer an und öffnen das Lab-View-Programm. Überprüfen Sie, ob die Druckluftverbindung mit dem System verbunden ist, und öffnen Sie die Luftzufuhr vollständig.Schalten Sie den Signalverstärker ein. Stellen Sie sicher, dass die Spannungsanzeige 0,00 beträgt. Stellen Sie gegebenenfalls nach.Die Laboransichts-Oberfläche verfügt über einen Schalter, der mit „Testaufzeichnung“ beschriftet ist und sich in der Stellung „Test“ befindet. Klicken Sie auf die Taste mit der Aufschrift „Luftzufuhr“, um das Einlassmagnetventil zu öffnen. Drücken Sie mithilfe des Gasdruckreglers die Kammer mit Druckluft auf einen PS.I auf. Lesen Sie den Druck in der Kammer anhand des digitalen Druckmessgeräts ab, das sich an der hinteren Endplatte der Kammer befindet.Nachdem sich der Druck ausgeglichen hat, notieren Sie die Spannungsmessung aus dem Signalverstärker. Wiederholen Sie dies für 2, 3, 4 und fünf PSI. Erstellen Sie anschließend eine Kalibrierungskurve des Drucks in Abhängigkeit von der Spannung.Wandeln Sie den Druck von PSI in Millimeter Quecksilber um. Geben Sie die Gleichung aus dem Diagramm in den Code des Lab-View-Programms ein. Entfernen Sie die vordere Aluminiumplatte aus der Druckkammer und besprühen Sie die Kammer mit 70 % Ethanol.Stellen Sie die sechslochige Platte mit den Blättchenproben in die Kammer und setzen Sie die vordere Endplatte wieder ein. Stellen Sie sicher, dass die Dichtung luftdicht ist, indem Sie die Muttern an den vier Gewindestangen per Hand festziehen. Stellen Sie die Druckkammer in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator.Geben Sie die Dauer ein, für die das System zwischen Druckluftzufuhr und -abgabe wechselt. Diese Zeiten sollten 0,6 Sekunden bzw. 0,4 Sekunden betragen, um diastolische und systolische Bedingungen bei einer Frequenz von einem Hertz nachzuahmen. Anschließend geben Sie einen Dateipfad in LabVIEW ein.Klicken Sie auf „Ausführen“ und schalten Sie den Testaufzeichnungs-Regler auf Aufzeichnung. Überprüfen Sie mithilfe des Diagramms in der LabVIEW-Oberfläche, ob der Druck auf dem gewünschten Niveau liegt. Passen Sie gegebenenfalls den Druck mit dem Gasdruckregler an.Wenn das Experiment abgeschlossen ist, klicken Sie in der Laboransicht auf „Stop“ und schalten Sie die Luftzufuhr ab, öffnen Sie dann das Entlüftungsventil an der Druckkammer. Schließlich entnehmen Sie das Drucksystem aus dem Inkubator. Danach entfernen Sie die vordere Endplatte aus der Kammer und nehmen die Sechs-Loch-Platte heraus.Die Proben können nun auf Genexpression, Proteinexpression, Histologie und mechanische Eigenschaften analysiert werden, die Druckwellenformen bei normalem und erhöhtem Druck darstellen. Die hier gezeigten Bedingungen, die aus dem System gewonnen wurden, entsprechen in vivo-Bedingungen. Unter normalen physiologischen Bedingungen besteht während der Diastole ein Druckunterschied zwischen dem linken Ventrikel und der Aorta ascendens, der es ermöglicht, dass die Aortenklappe geschlossen bleibt.Dieser transvalvuläre Druck beträgt 80 Millimeter Quecksilber. Unter leichtem und mittelschwerem Bluthochdruck kann der transvalvuläre Druck jedoch auf 90 beziehungsweise 100 Millimeter Quecksilber ansteigen. Das Drucksystem ist in der Lage, die maximalen transvalvulären Drücke zu simulieren, die unter normotensiven, leicht hypertensiven und mittelschwer hypertensiven Bedingungen beobachtet werden.Hier sind repr&auml;sentative Druckwellenformen unter normalen und erh&ouml;hten Druckbedingungen dargestellt, die von dem System erhalten wurden. Indem wir dieses Verfahren befolgen, k&ouml;nnen wir weitere Methoden wie PCR, Western Blotting und Mikroskopie an den Segeln durchf&uuml;hren. Dies hilft uns, Ver&auml;nderungen in der Genexpression und Proteinsynthese zu verstehen, und unterst&uuml;tzt unser Verst&auml;ndnis der Mechanotransduktion in den Herzklappen.Diese Technik hat sich als äußerst nützlich erwiesen, um mechanische biologische Vorgänge und Krankheitsmechanismen besser zu verstehen, und sie könnte uns zukünftig dabei helfen, Veränderungen in anderen Geweben zu erfassen, die in vivo Druckänderungen unterliegen.

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Forschung

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Biotechnik

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Es wurde Interesse an der Entwicklung Polymer Ventile erneuert. Hier sind die Ziele, um die Machbarkeit der Modifizierung eine kommerzielle Puls duplicator zu tri-Merkblatt Geometrien aufnehmen und ein Protokoll zu definieren Polymer Ventil hydrodynamischen Daten im Vergleich zu nativen und Klappenprothese Daten unter nahezu identischen Bedingungen gesammelt präsentieren zu demonstrieren.

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Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine dynamische Kokultur von menschlichen Makrophagen und Myofibroblasten in röhrenförmigen elektrogesponnenen Gerüsten durchzuführen, um die materialgetriebene Geweberegeneration mit einem Bioreaktor zu untersuchen, der die Entkopplung von Scherspannung und zyklischer Dehnung ermöglicht.

Ein Multi-Cue-Bioreaktor zur Bewertung der entzündlichen und regenerativen Kapazität von Biomaterialien unter Strömung und Dehnung

Aorteninsuffizienz ist eine Herzerkrankung der Aortenklappe. Dieses Manuskript zeigt, wie die vierdimensionale Strömungsmagnetresonanztomographie die Aorteninsuffizienz unter Verwendung von In-vitro-Herzklappen bewerten kann, die das Aorteninsuffizienz nachahmen.

In vitro Beurteilung der Aorteninsuffizienz mittels vierdimensionaler Strömungsmagnetresonanztomographie

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Dieses Protokoll stellt den Aufbau und Betrieb eines neu entwickelten, 3D-gedruckten Bioreaktors für die ex vivo Kultur von Blutgefäßen in Perfusion vor. Das System ist so konzipiert, dass es leicht von anderen Benutzern übernommen werden kann, praktisch, erschwinglich und an verschiedene experimentelle Anwendungen wie grundlegende biologische und pharmakologische Studien anpassbar ist.

Ex Vivo Perfusionskultur großer Blutgefäße in einem 3D-gedruckten Bioreaktor

Wir stellen eine Methode vor, um eine Schweineaortenklappe auf einem Pulsduplikator zu montieren, um ihre hydrodynamischen Eigenschaften zu testen. Mit dieser Methode kann die Änderung der Hydrodynamik nach der Anwendung eines experimentellen Verfahrens oder eines neuartigen Medizinprodukts vor dem Einsatz in einem Großtiermodell bestimmt werden.

Ein ex vivo Schweinemodell für die hydrodynamische Erprobung experimenteller Aortenklappenverfahren und neuartiger Medizinprodukte

Erfahren Sie, wie Sie einen zyklischen Druck-Bioreaktor zur Untersuchung der Mechanobiologie von Aortenklappengewebe nutzen. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Experimente zur Analyse biologischer Reaktionen auf Druckveränderungen.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

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