Name: Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung von EBV-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien aus menschlichen B-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die frühzeitige Vorhersage erfolgreicher Transformation durch Flow-Zytometrie.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH gewährt K08 AI062732, K12 HD001401 und 1UL1RR024139-02 und einem Child Health Research Grant von der Charles H. Hood Foundation zu SB-M finanziert. und von der Research Foundation an der State University of New York at Stony Brook.

1. EBV Stoffaufbereitung <ol><li> Subculture exponentiell wachsenden B95-8-Zellen (ATCC # CRL 1612; 13) auf 3 x 10 5 Zellen / ml in einem 75 cm 2 Zellkulturflasche mit sterilen Technik. Die Zellen werden in kompletten RPMI 1640 mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin / Streptomycin bei 100U/ml und 100 ug / ml, und Amphotericin B bei 0,5 pg / ml bei 37 ° C in der Gegenwart von 5% CO 2. </li><li> Achtundvierzig Stunden später, die Zellen in frisches vollständiges RPMI 1640 mit 1 x 10 6 Zellen / ml. Zur Induktion Virus-Produktion stimulieren Zellen mit 20ng/ml Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA) für 1 Stunde in einem Standard-CO 2-Inkubator. Wash Zellen dreimal mit RPMI 1640 zu TPA zu entfernen. </li><li> Die Zellen in das ursprüngliche Volumen des kompletten RPMI 1640 (von 1,2) und der Kolben in CO 2-Inkubator für 96 Stunden. Diese Methode hat sich gezeigt, dass hohe Titer von infektiösen Virus par produzierenTeilchen 6. </li><li> Zentrifugation bei 600 x g für 10 min bei 4 ° C zu EBV-haltigen Kulturüberstand von Zellen zu trennen. Filter Überstand durch ein 0,45-Mikron-Filter, Aliquot und bei -70 ° C über einem Jahr. Eine Alternative ist der Überstand von B95-8 Zellen mit EBV aus der ATCC (VR-1492) zu erhalten und den Einsatz bei der Verdünnung durch die ATCC empfohlen. </li></ol> 2. Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) <ol><li> Draw 10 ml Blut vom Spender in einer heparinisierten Spritze oder einer heparinisierten Blut Röhre. Verdünnen Sie das Blut mit 20 ml PBS bei Raumtemperatur in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Underlay verdünntes Blut mit 15 ml Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedium. Zentrifugation bei 225 x g ohne Bremse bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Entfernen Buffy-Coat und den Transfer in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Raise Volumen von 50 ml mit PBS und Spin bei 600 xg bei Raumtemperatur für 10 Minuten. </li><li> Pour off Überstand. Wash-Zellen durch Resuspendieren Pellet in 50 ml PBS und Spinnen bei 600 x g bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wash zweimal in ähnlicher Weise. </li><li> Resuspendieren gewaschenen Zellen in 1 ml vollständigem RPMI. Verwenden Sie 5 ul der Zellen zu einer 1 / 10 Verdünnung in Trypanblau vorzubereiten. Graf lebenden Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. </li><li> Die Lautstärke mit komplettem RPMI in einer 25 cm 2 Zellkulturflasche auf eine Zellkonzentration von 2 x 10 6 / ml erhalten. </li></ol> 3. Eine Infektion mit EBV <ol><li> Add FK506 (AG Scientific) zur Zellsuspension von 2,6 auf eine Endkonzentration von 20 nM. Küvette in CO 2-Inkubator bei 37 ° C für eine Stunde. </li><li> Schnell Tauwetter ein Aliquot von EBV. Entfernen Flasche aus Inkubator und fügen EBV zu den Zellen in 1 / 10 Verdünnung. In der Regel bietet diese Verdünnung einer MOI von 50-100. Swirl Kolben zu mischen und legen Sie sie aufrecht in CO 2-Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> Hinweis thIn Schritt 4 durchgeführt, um Erfolg vorherzusagen, ist ein optionaler Schritt. Wenn Schritt 4 ausgeführt werden soll, müssen Sie eine zusätzliche Flasche un-infizierten PBMC bei 2 x 10 6 Zellen / ml als Kontrolle inkubiert. 4. Identifizieren proliferierenden Zellpopulation (optionaler Schritt) <ol><li> Bereiten FACS-Puffer: PBS + 5% FBS. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie die folgenden Antikörper mischt in 50 ul Volumen jeweils zum Färben von Zellen in Schritt 4.6. Antikörper-Verdünnungen sollten in FACS-Puffer mit 1mg/ml von Maus-IgG (Sigma) auf nicht-spezifische Bindung von Antikörpern hemmt werden. <ol class="lroman"><li> Single-gefärbt mit PE-konjugierte anti-CD23-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Single-mit FITC-konjugierte anti-CD58-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Single-gefärbt mit PE-Cy5-konjugierte anti-CD19-Antikörper (1 / 50 Verdünnung) </li><li> Triple-gefärbt CD23, CD58 und CD19 (1 / 50 Verdünnung jeder) </li><li> Single-gefärbt mit PE konjugiert IsotypkontrolleAntikörper abgestimmt auf CD23-PE (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD23-Antikörper) </li><li> Single-mit FITC konjugiert Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf CD58-FITC (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD58-Antikörper) </li><li> Single-gefärbt mit PE-Cy5 konjugiert Isotypkontrollantikörper auf abgestimmt CD19-PE-Cy5 (bei der gleichen Konzentration wie anti-CD19-Antikörper) </li><li> Triple-gefärbt mit allen drei Isotypkontrolle Antikörper. </li></ol> Vorübergehend speichern mischt bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> In dem dritten Tag nach der Exposition mit EBV, schwenken Kolben zu erhalten eine gleichmäßigere Zellsuspension. Entfernen Sie 2ml von Kolben in ein 2ml Eppendorf-Röhrchen. Spin Rohr in einer Mikrozentrifuge mit 3000 rpm bei Raumtemperatur für 3 Minuten. </li><li> Saugen Sie den Überstand und die Zellen in FACS-Puffer bei 5 x Oktober von 06 bis 1 x 10 7 Zellen / ml. </li><li> Entfernen Sie acht 50 ul Aliquots in einzelne Eppendorf-Röhrchen oder einer 96-Well V-Bodenplatte. Spin-Röhrchen oder die Platte bei 1500 x gfür 3 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen und Wirbelrohren / Platte. Die Zellen in jedes Röhrchen / well in 50 ul FACS-Puffer mit geeigneten Antikörper-Verdünnungen in 4,2 vorbereitet. </li><li> Die Röhrchen / Platte auf Eis im Dunkeln für 30 Minuten. Centrifuge Zellen bei 3000 rpm für 3 Minuten, entfernen Sie den Überstand und 200 ul FACS-Puffer. Centrifuge Zellen wieder und entfernen Überstand der Wäsche komplett. Wiederholen Sie zwei weitere Wäschen. </li><li> Die Zellen in 200 ul FACS Puffer und Daten erfassen mit einem Durchflusszytometer, Erwerb 20.000 Events / Rohr. </li><li> Analysieren von Daten mit WinMDI (freeware für FACS Datenauswertung am PC). Tor auf lebende Zellen mit Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Profilen. Dann Tor lebenden Zellen für die Expression von CD19 + (B-Zell-Marker) nach einem Vergleich mit Zellen, die mit Isotypkontrollantikörper abgestimmt auf anti-CD19-Antikörper gefärbt. Plot CD19 + Live-B-Zellen mit Fluoreszenz-Intensität für CD23 auf der x-Achse und Fluoreszenzintensität für CD58 auf der y-Achse. Bestimmen CD23 + und CD58 +-Zellen durch einen Vergleich mit EBV-exponierten Zellen mit aufeinander abgestimmten Isotypkontrolle Antikörpern gefärbt. Anwesenheit von CD23 +-Zellen CD58 hallo in EBV-exponierten Kultur (Abbildung 2C) prognostiziert erfolgreiche Auswuchs der EBV-infizierten Wachstum transformierten Zellen. Im Gegensatz dazu CD23 hallo CD58 +-Zellen nicht entstehen, wenn Zellen nicht zu EBV (Abbildung 2A) ausgesetzt sind oder ausgesetzt zu einem nicht verewigen Stamm EBV (Abbildung 2B). CD23 CD58 +-Zellen hallo wurden experimentell nachgewiesen, dass die Proliferation zu unterziehen und anschließend zu etablieren LCL (14). </li></ol> 5. Expansion und Kryokonservierung von LCL <ol><li> Visualisierung von Zellen durch Lichtmikroskopie: Durch eine Woche nach EBV-Infektion, sind Cluster von Zellen sichtbar unter dem Lichtmikroskop. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der frühen mikroskopischen Cluster (Abbildung 3B) in einem Kolben. </li><li> Mit fortschreitender Zeit werden mikroskopische Cluster größer, so dass Klumpen sind sichtbarmakroskopisch in den Kolben. 3C zeigt größere Cluster von Zellen in etablierte LCL mittels Lichtmikroskopie. </li><li> Feeding-Zellen: Doppelte Volumen Kulturmedium in der Kulturflasche am Tag 12. Anschließend erweitern Kultur durch eine Erhöhung der Lautstärke 2-3 fach mit komplettem RPMI. </li><li> Die Periodizität der Fütterung Zellen sollten auf der Grundlage von Zellwachstum bestimmt werden. Wenn das Kulturmedium gelb wird, ist es in der Regel Zeit, um die Medien wie oben ersetzen. In der Regel tritt diese einmal pro Woche. Jedoch können einige Zelllinien müssen mehr oder weniger häufig gefüttert werden. Expand Kultur 75-100 ml in den nächsten paar Wochen. </li><li> Kryokonservierung: Beim Einfrieren unten Zellen, Zentrifuge Zellen bei 600 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in kaltem Einfriermedium mit 90% FBS und 10% Dimethylsulfoxid bei 1 x 10 7 Zellen / ml. Das Röhrchen in flüssigem Stickstoff. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse: Erfolgreiche Bilanz wird durch die Anwesenheit von CD23 +-Zellen CD58 hallo vorhergesagt. Etwa 2-3% der lebenden Zellen an Tag 3-4 nach Exposition gegenüber EBV sollte das Profil (Abb. 2C). Andere Sub-Populationen von CD23 +, CD23 -, CD58 + und CD58 - Zellen beobachtet nach der Exposition gegenüber EBV zeigen minimale Proliferation 14. Un-infizierten Zellen (Abbildung 2A) und Zellen, die EBV von HH514-16-Zellen (Abbildung 2B), Beherbergung einer nicht verewigen Stamm EBV, zeigen nicht CD23 hallo CD58 +-Zellen. Sie können auch visualisieren Zellen unter dem Lichtmikroskop zu Erfolg zu überwachen: Wie bereits erwähnt, innerhalb einer Woche nach EBV-Infektion, sind kleine Gruppen von Zellen in der Flasche sichtbar durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 3B). Mit fortschreitender Zeit und Zellen in LCL entwickeln, werden mikroskopisch kleine Cluster größer (Abbildung 3C), so dass Klumpen zu sehen sind makroskopisch in den Kolben. Abbildung 1. Workflow zur Erzeugung und Kryokonservierung von lymphoblastoiden Zelllinien. Periphere Blut wird durch einen Ficoll-Gradienten zentrifugiert. PBMC in der Buffy-Coat eines etablierten Gradienten sind FK506 durch Zugabe von EBV gefolgt ausgesetzt. EBV-exponierten Zellen werden bei 37 ° C in Anwesenheit von 5% CO 2 zu errichten und anschließend zu erweitern LCL für die Kryokonservierung gewachsen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig2.jpg"> Abbildung 2. Identifizierung einer Subpopulation von B-Zellen erwartet, dass die Proliferation nach Exposition mit EBV zu unterziehen. Un-infizierten PBMC (A) oder PBMC ausgesetzt EBV abgeleitet von HH514-16-Zellen (B) oder von B95-8-Zellen (C) in Gegenwart von FK506 wurden am Tag 3 geerntet. Die Zellen wurden mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen CD19, CD23, CD58 und Regie gefärbt. Nach Gating auf lebenden Zellens, un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B und C) CD19 + B-Zellen wurden für die Expression von CD23 und CD58 untersucht. Eine Subpopulation von B-Zellen, die CD58 und ein hohes Maß an CD23 (CD23 hallo CD58 +), beobachtet nur in den Zellen, die Transformation kompetenter EBV (abgeleitet von B95-8-Zellen), dargestellt ist. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3321/3321fig3.jpg"> Abbildung 3. Visualisierung der Zellhaufen in EBV-infizierten Zellen. PBMC wurden mit FK506 behandelten und infizierten mit EBV. Un-infizierten (A) und EBV-ausgesetzt (B) Zellen wurden untersucht 1 Woche nach der Infektion durch Phasenkontrast-Mikroskopie (10fache Vergrößerung). Fünf Wochen alte lymphoblastische Zellinie ist in C gezeigt

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<li>Tosato, G., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-immortalized+B+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Epstein-Barr virus (EBV)-immortalized B cell lines.</a> Current Protocols of Immunology. Chapter 7, 22-22 (1991).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode in diesem Papier beschrieben erzeugt LCL vom Spender peripheren Blut mit schnellen Immortalisierung und Kryokonservierung Zeiten. Durch den Einsatz von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum, und hohe Titer von infektiösen Viren sind wir in der Lage, die Proliferation der EBV-infizierten B-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen zu fördern. Diese Eingriffe machen das beschriebene Verfahren effizienter zu gestalten, was zu einer raschen Expansion von Zellen für die nachfolgenden Experimente. Traditionell wurde das Wachstum Transformation durch Visualisierung von Clustern von Zellen unter dem Lichtmikroskop etwa eine Woche nach der Exposition gegenüber EBV 6, 15 überwacht. Allerdings ist Clustering von Zellen, die nicht einer bestimmten Indikator für EBV-vermittelte Wachstum Transformation. Wir haben früher die konsistente Identifikation der proliferierenden Zellpopulation über Durchflusszytometrie 14 gezeigt, und bietet eine genaue und spezifische Methode zur erfolgreichen Ergebnis so früh zu bestimmen, wie 3 Tage nach achterner Exposition der B-Zellen, die EBV.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP 928-250 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma </td><td> D 2650 </td></tr><tr><td> Rinderfötenserum, hitzeinaktiviertem </td><td> Sigma </td><td> F 4135 </td></tr><tr><td> Ficoll Hypaque Lymphozyten Trennmedien </td><td> Mediatech </td><td> 25-072 </td></tr><tr><td> FK506 </td><td> AG Scientific </td><td> F 1030 </td></tr><tr><td> IgG aus Maus-Serum </td><td> Sigma </td><td> I 8765 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD23 konjugiert PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555711 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554680 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD58 konjugiert FITC </td><td> Pierce Thermo Scientific </td><td> MA1-82159 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 FITC konjugiert </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550616 </td></tr><tr><td> Maus anti-human CD19 konjugiert PE-Cy5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555414 </td></tr><tr><td> Maus Isotyp IgG1 konjugiert PE-Cy5 </td><td> Dako </td><td> X 0955 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 Medium </td><td> Sigma </td><td> R 8758 </td></tr><tr><td> Tetradecanoyl Phorbol-Acetat (TPA) </td><td> Calbiochem </td><td> 407952 </td></tr><tr><td> FACS-Puffer (1X Phosphate Buffered Saline + 5% fötalem Rinderserum) </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gründung des epstein-barr virus growth-transformierten lymphoblastoiden zelllinien

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Die Infektion von B-Zellen mit Epstein-Barr Virus (EBV) führt zu Vermehrung und anschließende Immortalisierung, was in Gründung lymphoblastoiden Zelllinien (LCL) in vitro. Da LCL latent mit EBV infiziert sind, stellen sie ein Modellsystem zur EBV-Latenz-und Viren-driven B-Zell-Proliferation und Tumorgenese 1 Untersuchen. LCL wurden verwendet, um Antigene in einer Vielzahl von immunologischen Assays 2, 3 zu präsentieren. Darüber hinaus können LCL verwendet, um humane monoklonale Antikörper 4, 5 zu erzeugen und eine potentiell unbegrenzte Quelle, wenn der Zugang zu primären biologischen Materialien 6, 7 begrenzt ist. Eine Vielzahl von Methoden beschrieben worden, LCL generieren. Frühere Methoden haben den Einsatz von Mitogene wie Phytohämagglutinin, Lipopolysaccharid 8 enthalten, und Pokeweed mitogen 9, um die Effizienz der EBV-vermittelte Immortalisierung zu erhöhen. In jüngerer Zeit haben andere immunosuppr verwendetEssiv Substanzen wie Cyclosporin A zu hemmen T-Zell-vermittelte Abtötung der infizierten B-Zellen 7, 10-12. Die beträchtliche Länge der Zeit von EBV-Infektion für die Niederlassung von Zelllinien treibt die Forderung nach schneller und zuverlässiger Methoden zur EBV-driven B-Zell-Wachstum Transformation. Mit einer Kombination aus hohen Titer EBV und ein Immunsuppressivum, sind wir in der Lage, konsequent zu infizieren, transformieren und erzeugen LCL von B-Zellen im peripheren Blut. Diese Methode verwendet eine kleine Menge von peripheren mononukleären Zellen, die in vitro-Cluster von Zellen infiziert sind, nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 mit EBV in Gegenwart von FK506, ein T-Zell-Immunsuppressivum. Traditionell ist Auswuchs der proliferierenden B-Zellen durch Visualisierung der mikroskopischen Cluster von Zellen etwa eine Woche nach der Infektion mit EBV überwacht. Klumpen von LCL kann mit bloßem Auge nach einigen Wochen zu sehen. Wir beschreiben einen Assay zu bestimmen, vorzeitig, wenn EBV-vermittelte gachstum Transformation erfolgreich ist, auch vor der mikroskopischen Cluster von Zellen nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von CD23 hallo CD58 +-Zellen beobachtet, wie bereits drei Tage nach der Infektion zeigt ein erfolgreiches Ergebnis.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von transformierten B-Zell-Linien mit Epstein-Barr-Virus. Wir zeigen auch eine neuartige Assays, dass B-Zellen bestimmt, Transformation bereits drei Tage nach der Infektion unterziehen identifizieren können.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Die Infektion von B-Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) führt zu einer Proliferation und anschließenden Immortalisierung, was zur Etablierung lymphoblastoider...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eps. Epstein-Barr-Virus-transformierte lymphoblastäre Zelllinien oder LCL aus menschlichen B-Zellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus peripherem Blut von Menschen aus dem Blut isoliert werden.Anschließend werden die Zellen mit eps Epstein-Barr-Virus in Gegenwart von FK 506 und immunsuppressiven Substanzen infiziert. Drei bis vier Tage nach der Infektion mit EP Epstein-Barr-Virus tritt eine Teilpopulation von Zellen auf, die als CD 23 hoch, CD 58 positiv markiert ist und bei der eine Proliferation vorhergesagt wird. CD 23 hoch, CD 58 positive Zellen können mittels Durchflusszytometrie als Prädiktor für ein erfolgreiches Ergebnis gezählt werden. Proliferierende Zellen können zusätzlich mikro- und makroskopisch anhand der Lymphoblasten-Zelllinien-Kluster identifiziert werden, die sich in erfolgreich transformierten Zellkulturen bilden.Der letzte Schritt besteht darin, Lymphoblastenzelllinien zur Kryokonservierung zu expandieren. In meinem Labor erzeugen wir Lymphoblastenzelllinien (LCLs), um die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Epstein-Barr-Virus zu untersuchen. Lymphoblastenzelllinien sind außerdem von allgemeinem breitem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft, insbesondere für Virologen, Immunologen und Krebsforscher.Als Postdoktorand O in einem du-Macintosh-Labor werde ich das Verfahren zur Erzeugung von Lymphoblasten-Zelllinien demonstrieren. Nachdem 10 Milliliter Blut von einem Spender entnommen wurden, das heparinisierte Blut einer 50-Milliliter-Konischgefäß hinzufügen und es anschließend im Verhältnis 1:2 verdünnen. Durch Zugabe von 20 Millilitern PBS bei Raumtemperatur zum Gefäß wird das verdünnte Blut mit 15 Millilitern FICO HIA-Lymphozyten-Trennmedium unterlaufen, und anschließend wird das Blut 30 Minuten lang bei 225 × g ohne Bremse bei Raumtemperatur zentrifugiert, um einen Gradienten zu bilden.Entfernen Sie anschließend die Büffycoat-Schicht und überführen Sie sie in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter ein und pelletieren Sie die Zellen bei 600 × g für 10 Minuten. Gießen Sie das Überstand ab, resuspendieren Sie das Pellet in 50 Milliliter PBS und waschen Sie die Zellen anschließend noch zweimal unter denselben Bedingungen. Suspendieren Sie die Zellen nun in einem Milliliter vollständigem RPMI. Ich verwende fünf Mikroliter Zellen, um eine Verdünnung von 1 zu 10 in Trypanblau herzustellen, und zähle die lebenden Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Anschließend stelle ich mit vollständigem RPMI das Volumen so ein, dass eine Zellkonzentration von zwei mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter erreicht wird, und überführe die Zellen in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturgefäß. Bereiten Sie die Zellen für die Infektion mit Epstein-Barr-Virus vor, indem Sie FK 5 0 6 dem Gewebekulturkolben in einer Endkonzentration von 20 M zusetzen. Stellen Sie den Kolben dann eine Stunde lang in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen fast fertig inkubiert sind, tauen Sie schnell ein Aliquot des Epstein-Barr-Virus auf, das aus B 95 8-Zellen gewonnen wurde. Entfernen Sie anschließend den Kolben aus dem Inkubator und geben Sie das Epstein-Barr-Virus im Verhältnis 1 zu 10 zu den Zellen. Schwenken Sie den Kolben, um das Epstein-Barr-Virus in Lösung zu verteilen, und stellen Sie den Kolben dann aufrecht in den Inkubator zurück, wobei der Verschluss geschlossen, aber leicht gelockert ist, falls ein nicht belüfteter Kolben verwendet wird, für zwei bis drei Wochen, bevor die Kultur zur Kryokonservierung vergrößert wird.Eine Woche nach eps, einer Epstein-Barr-Virus-Infektion, sind Zellcluster mittels Lichtmikroskopie sichtbar, wie in dieser repräsentativen Abbildung früher mikroskopischer Cluster zu sehen ist. Im Verlauf werden die mikroskopischen Cluster größer, sodass die Aggregate makroskopisch im Kolben sichtbar sind, wie in dieser Abbildung gezeigt, in der größere Cluster von LCL beobachtet werden können. Um die Zellen zu versorgen, verdoppeln Sie am 12. Tag das Volumen des unterstützenden Mediums im Kulturkolben. Wenn das Kulturmedium gelb wird, typischerweise etwa einmal pro Woche, ist dies im Allgemeinen der Zeitpunkt, um die Zellen zu versorgen, um die Zellen zu vermehren und das Kulturvolumen zwei- bis dreifach zu erhöhen.Erweitern Sie die Kultur mithilfe von vollständigem RPMI über die nächsten Wochen auf 70 bis 100 Milliliter in einer 75 Quadratzentimeter-Flasche, um Zellen für die Kryokonservierung zu gewinnen. Ein erfolgreicher Ausgang wird durch das Vorhandensein von CD 23 und einer hohen Anzahl CD 58-positiver Zellen vorhergesagt, wie in diesem Streudiagramm zu sehen ist. Ungefähr zwei bis 3 % der lebenden Zellen am dritten bis vierten Tag nach Exposition gegenüber eps Epstein-Barr-Virus weisen dieses Profil auf. Andere Teilpopulationen von CD 23-positiven, CD 23-negativen, CD 58-positiven und CD 58-negativen Zellen, die nach Exposition gegenüber eps Epstein-Barr-Virus beobachtet werden, zeigen minimale Proliferation. Uninfizierte Zellen oder Zellen, die mit einem nicht-immortalisierenden Stamm von ep. Epstein-Barr-Virus infiziert sind, zeigen kein CD 23-hoch. CD 58-positive Zellen. Die Zellen können ebenfalls mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Wie bereits erwähnt, sind innerhalb einer Woche nach Epstein-Barr-Virus-Infektion kleine Zellansammlungen im Kolben mittels Lichtmikroskopie sichtbar.Im Laufe der Zeit entwickeln sich die Zellen zu LCL, und die mikroskopischen Zellverbände werden größer, sodass Zellklumpen makroskopisch im Kolben sichtbar werden. Gut. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mononukleäre Zellen aus peripherem menschlichen Blut isoliert und Epstein-Barr-Virus-transformierte lymphoblastische Zelllinien aus menschlichen B-Zellen erzeugt, auch wenn die Erzeugung lymphoblastischer Zelllinien bereits von anderen Laboren beschrieben wurde.Der Vorteil unseres Protokolls liegt darin, dass es den Forschern eine Methode bietet, bereits drei bis vier Tage nach der Infektion von B-Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus eine erfolgreiche Outcome vorherzusagen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Diese Technik zeigt eine effiziente Möglichkeit, replikationsdefekte retroviralen Aktien Kodierung eines menschlichen Onkogen vorzubereiten, und anschließend zur Induktion der myeloproliferativen Erkrankung im Mausmodell verwendet.

Produktion von replikationsdefekte Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen

Eine schnelle, einfache und kostengünstige Protokoll für die Erzeugung von Spender-derived multivirus-spezifische CTLs (RCTL) zur Infusion einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Empfänger die Gefahr der Entwicklung CMV, Adv. oder EBV-Infektionen. Dieses Herstellungsverfahren ist GMP-konform und sollte die breitere Umsetzung von T-Zell-Immuntherapie über spezialisierte Zentren zu gewährleisten.

Generierung von Multivirus-spezifischen T-Zellen zu verhindern / zu behandeln virale Infektionen nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Die Manipulation der temporalen Genexpression in differenzierenden embryonalen Stammzellen (ESCs) kann mit induzierbaren Gensystemen erreicht werden. Die Erzeugung dieser Zelllinien ist jedoch kostspielig und zeitaufwändig. Dieses Protokoll erreicht eine schnelle Expression eines Transgens bei der Differenzierung von ES-abgeleiteten Zellen und die anschließende Analyse der nachgeschalteten hämatopoetischen Differenzierung.

Retrovirale Infektion von murinen embryonalen Stammzellen abgeleitete Embryoidkörper Zellen für die Analyse von hämatopoetischen Differenzierung

Kaposi-Sarkom (KS) ist ein Tumor induziert durch eine Infektion mit onkogenen Viren menschliche Herpesvirus-8/KS Herpesvirus (HHV-8/KSHV). Die Endothelzellen Kultur Modell hier beschriebenen eignet sich eindeutig für die Untersuchung der Mechanismen, mit denen KSHV Wirtszellen verwandelt.

Ein In-vitro- Modell für die Erforschung der zellulären Transformation von Kaposi-Sarkom-Herpesvirus

Eine einfache roten Blutkörperchen die Lyse Verfahren zum Aufbau B-LCLs mit hoher Immortalisierung Effizienz entwickelt, eine kleine Menge von Blut benötigt und die Zeit von der Initiierung der Gefrierkonservierung zu speichern.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

Eine einfache Methode für den Erhalt der NK und T-Zell-Klone von CAEBV Patienten wurde mit hohem Wirkungsgrad, eine kleine Menge des peripheren Blutes und einen Low-Dose von IL-2 entwickelt.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

Hier werden Methoden zur Untersuchung der funktionellen Wirkung von RYR1-Mutationen beschrieben, die endogen in immortalisierten menschlichen B-Lymphozyten und muskelbiopsiebasierten Satellitenzellen exprimiert werden, die in Myotuben differenziert sind.

Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Epstein-Barr-Viruspartikeln aus der menschlichen P3HR1-Zelllinie nach Induktion des viralen lytischen Zyklus mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat. Anschließend wird DNA aus der viralen Zubereitung extrahiert und einer Real-Time-PCR unterzogen, um die Viruspartikelkonzentration zu quantifizieren.

Isolierung und Quantifizierung des Epstein-Barr-Virus aus der P3HR1-Zelllinie

Erfahren Sie die Methode zur Erzeugung von EBV-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien aus menschlichen B-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht die frühzeitige Vorhersage erfolgreicher Transformation durch Flow-Zytometrie.

Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

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