Gründung des Epstein-Barr Virus Growth-transformierten lymphoblastoiden Zelllinien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eps. Epstein-Barr-Virus-transformierte lymphoblastäre Zelllinien oder LCL aus menschlichen B-Zellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus peripherem Blut von Menschen aus dem Blut isoliert werden.

Anschließend werden die Zellen mit eps Epstein-Barr-Virus in Gegenwart von FK 506 und immunsuppressiven Substanzen infiziert. Drei bis vier Tage nach der Infektion mit EP Epstein-Barr-Virus tritt eine Teilpopulation von Zellen auf, die als CD 23 hoch, CD 58 positiv markiert ist und bei der eine Proliferation vorhergesagt wird. CD 23 hoch, CD 58 positive Zellen können mittels Durchflusszytometrie als Prädiktor für ein erfolgreiches Ergebnis gezählt werden. Proliferierende Zellen können zusätzlich mikro- und makroskopisch anhand der Lymphoblasten-Zelllinien-Kluster identifiziert werden, die sich in erfolgreich transformierten Zellkulturen bilden.

Der letzte Schritt besteht darin, Lymphoblastenzelllinien zur Kryokonservierung zu expandieren. In meinem Labor erzeugen wir Lymphoblastenzelllinien (LCLs), um die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Epstein-Barr-Virus zu untersuchen. Lymphoblastenzelllinien sind außerdem von allgemeinem breitem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft, insbesondere für Virologen, Immunologen und Krebsforscher.

Als Postdoktorand O in einem du-Macintosh-Labor werde ich das Verfahren zur Erzeugung von Lymphoblasten-Zelllinien demonstrieren. Nachdem 10 Milliliter Blut von einem Spender entnommen wurden, das heparinisierte Blut einer 50-Milliliter-Konischgefäß hinzufügen und es anschließend im Verhältnis 1:2 verdünnen. Durch Zugabe von 20 Millilitern PBS bei Raumtemperatur zum Gefäß wird das verdünnte Blut mit 15 Millilitern FICO HIA-Lymphozyten-Trennmedium unterlaufen, und anschließend wird das Blut 30 Minuten lang bei 225 × g ohne Bremse bei Raumtemperatur zentrifugiert, um einen Gradienten zu bilden.

Entfernen Sie anschließend die Büffycoat-Schicht und überführen Sie sie in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Volumen mit PBS auf 50 Milliliter ein und pelletieren Sie die Zellen bei 600 × g für 10 Minuten. Gießen Sie das Überstand ab, resuspendieren Sie das Pellet in 50 Milliliter PBS und waschen Sie die Zellen anschließend noch zweimal unter denselben Bedingungen.

Suspendieren Sie die Zellen nun in einem Milliliter vollständigem RPMI. Ich verwende fünf Mikroliter Zellen, um eine Verdünnung von 1 zu 10 in Trypanblau herzustellen, und zähle die lebenden Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Anschließend stelle ich mit vollständigem RPMI das Volumen so ein, dass eine Zellkonzentration von zwei mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter erreicht wird, und überführe die Zellen in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturgefäß.

Bereiten Sie die Zellen für die Infektion mit Epstein-Barr-Virus vor, indem Sie FK 5 0 6 dem Gewebekulturkolben in einer Endkonzentration von 20 M zusetzen. Stellen Sie den Kolben dann eine Stunde lang in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen fast fertig inkubiert sind, tauen Sie schnell ein Aliquot des Epstein-Barr-Virus auf, das aus B 95 8-Zellen gewonnen wurde. Entfernen Sie anschließend den Kolben aus dem Inkubator und geben Sie das Epstein-Barr-Virus im Verhältnis 1 zu 10 zu den Zellen. Schwenken Sie den Kolben, um das Epstein-Barr-Virus in Lösung zu verteilen, und stellen Sie den Kolben dann aufrecht in den Inkubator zurück, wobei der Verschluss geschlossen, aber leicht gelockert ist, falls ein nicht belüfteter Kolben verwendet wird, für zwei bis drei Wochen, bevor die Kultur zur Kryokonservierung vergrößert wird.

Eine Woche nach eps, einer Epstein-Barr-Virus-Infektion, sind Zellcluster mittels Lichtmikroskopie sichtbar, wie in dieser repräsentativen Abbildung früher mikroskopischer Cluster zu sehen ist. Im Verlauf werden die mikroskopischen Cluster größer, sodass die Aggregate makroskopisch im Kolben sichtbar sind, wie in dieser Abbildung gezeigt, in der größere Cluster von LCL beobachtet werden können. Um die Zellen zu versorgen, verdoppeln Sie am 12. Tag das Volumen des unterstützenden Mediums im Kulturkolben. Wenn das Kulturmedium gelb wird, typischerweise etwa einmal pro Woche, ist dies im Allgemeinen der Zeitpunkt, um die Zellen zu versorgen, um die Zellen zu vermehren und das Kulturvolumen zwei- bis dreifach zu erhöhen.

Erweitern Sie die Kultur mithilfe von vollständigem RPMI über die nächsten Wochen auf 70 bis 100 Milliliter in einer 75 Quadratzentimeter-Flasche, um Zellen für die Kryokonservierung zu gewinnen. Ein erfolgreicher Ausgang wird durch das Vorhandensein von CD 23 und einer hohen Anzahl CD 58-positiver Zellen vorhergesagt, wie in diesem Streudiagramm zu sehen ist. Ungefähr zwei bis 3 % der lebenden Zellen am dritten bis vierten Tag nach Exposition gegenüber eps Epstein-Barr-Virus weisen dieses Profil auf. Andere Teilpopulationen von CD 23-positiven, CD 23-negativen, CD 58-positiven und CD 58-negativen Zellen, die nach Exposition gegenüber eps Epstein-Barr-Virus beobachtet werden, zeigen minimale Proliferation. Uninfizierte Zellen oder Zellen, die mit einem nicht-immortalisierenden Stamm von ep. Epstein-Barr-Virus infiziert sind, zeigen kein CD 23-hoch.

CD 58-positive Zellen. Die Zellen können ebenfalls mittels Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden. Wie bereits erwähnt, sind innerhalb einer Woche nach Epstein-Barr-Virus-Infektion kleine Zellansammlungen im Kolben mittels Lichtmikroskopie sichtbar.

Im Laufe der Zeit entwickeln sich die Zellen zu LCL, und die mikroskopischen Zellverbände werden größer, sodass Zellklumpen makroskopisch im Kolben sichtbar werden. Gut. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mononukleäre Zellen aus peripherem menschlichen Blut isoliert und Epstein-Barr-Virus-transformierte lymphoblastische Zelllinien aus menschlichen B-Zellen erzeugt, auch wenn die Erzeugung lymphoblastischer Zelllinien bereits von anderen Laboren beschrieben wurde.

Der Vorteil unseres Protokolls liegt darin, dass es den Forschern eine Methode bietet, bereits drei bis vier Tage nach der Infektion von B-Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus eine erfolgreiche Outcome vorherzusagen.