Name: Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Lernen Sie die Ableitung angereicherter Oligodendrozytenvorläuferzellen aus neonatalen Mäusen und deren Differenzierung zu reifen Oligodendrozyten. Diese Methode ermöglicht myelinisierende Co-Kulturen mit dorsalen Wurzelganglienneuronen.

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Dieses Projekt wurde durch einen Zuschuss von der Multiple Sclerosis Society von Kanada bis RKRWO finanziert ist ein Empfänger ein Stipendium von der Multiple Sclerosis Society von Kanada. SDR ist ein Empfänger von Post-Doctoral Fellowships aus dem Multiple-Sklerose-Gesellschaft von Kanada und kanadischen Institutes of Health Research.

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieser Bericht beschreibt ein Verfahren zur Isolierung muriner OPCs für die Differenzierung in OL-angereicherten Kulturen oder OL / DRGN Co-Kulturen. Wenn kultivierte allein, differenzieren die OPCs in MBP + ve OLS, produziert Myelin-like membranöse Blatt. Wenn hinzugefügt, um Neuriten Betten DRGN, umhüllen OLs die DRGN Neuriten mit MBP + ve Membran. Dieses Modell profitiert die Erforschung der komplexen Grundlagen über OL-vermittelte axonale ensheathment. Während von großem Wert, ist die Einrichtung eines solchen Kulturen technisch anspruchsvoll. Dazu gehören insbesondere anspruchsvolle Aspekte effizienter Gewebe Verdauung / Dissoziation, die Aufrechterhaltung der ausgewogenen Kulturmedien pH-Wert und DRGN Medien ändert. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Länge der Verdauung, Menge an Gewebe verdaut wird und die Höhe der Verreibung Einfluss auf die Wirksamkeit und Endergebnis der Gewebedissoziation. Es ist nicht für erfahrene Wissenschaftler ungewöhnlich niedrigen zellulären Erträge aus dissoziierten Nervensystem Gewebe zu erhalten. Darüber hinaus neigen murine OPCs zu empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes der Kultur Medien, insbesondere unter alkalischen Bedingungen. Die Pflege der Kulturen bei 8,5% CO 2 zielt darauf ab, dies zu verhindern, da OPCs besser tolerieren leicht sauren Bedingungen über grundlegende erscheinen. Im Hinblick auf die Fütterung DRGNs, Medien ändert sich schnell durchgeführt werden muss, um nicht auszutrocknen den Neuronen, muss jedoch sanft wie nicht stören die Entwicklung von Neuriten Bett. Abrupte Änderungen können Medien verdrängen die Neuriten Bett aus dem Substrat, und wahrscheinlich zu seiner vollständigen Loslösung von dem Deckglas. Das Potenzial Verdienst dieses Modellsystem stark überschattet seine technisch anspruchsvollen Natur. Ein Vorteil dieses Systems ist die Verwendung von postnatalen Mäusen für die Zellkultur Ableitung unter Umgehung der Notwendigkeit, weibliche Zuchttiere zu opfern, um embryonale Gewebe zu ernten. Ein weiterer Vorteil ist die fehlende Voraussetzung für Wachstumsfaktoren (GF) für den Ausbau der OPCs. Mixed glialen Kulturen bieten ein Umfeld, das die Ausbreitung von OPCs, vermutlich wegen der Anwesenheit von Astrozyten-derived trophischen Faktoren unterstützt. Andere Methoden, wie z. B. Ableitung über Neurosphären 7,8, vertrauen auf die mitogene Eigenschaften von GF wie basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und platelet-derived growth factor (PDGF) für OPC Expansion. Auch mit der Geburt (P5-10) Mäuse für DRGNs vermeidet das Erfordernis der Ergänzung der Kulturmedien mit nerve growth factor (NGF), einen neurotrophen Faktor für die in vitro das Überleben von embryonalen DRGNs 9, 10 erforderlich. Es ist interessant zu vermeiden, mit NGF, wie es wirkt sich negativ auf myelinisierenden Kapazität von OLS, wenn sie mit DRGNs 4 kultiviert. Vermeidung der Verwendung von GF-ergänzt Medien hat auch wirtschaftliche Vorteile, da diese Reagenzien teuer werden, wenn in großem Maßstab eingesetzt. Vielleicht der wichtigste Vorteil dieser Kultur Modells ist seine Ableitung aus Maus-only Gewebe, wodurch die Chancen abzuleiten beiden OPCs und DRGNs aus der Vielzahl von transgenen Mauslinien. Dies ermöglicht die Untersuchung der beiden DRGN und / oder OPC-spezifische Eigenschaften, die Myelinisierung zu regieren. Dies ist besonders wichtig für die Aufklärung der Rezeptor / Ligand-Interaktionen regulieren OL-vermittelte Myelinisierung der Axone. Alles in allem ist diese Technik von großem Wert in Bezug auf neurowissenschaftliche Forschung aufgrund ihrer Anwendungen zum Verständnis der molekularen Signale zugrunde liegenden Myelinisierung.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Product Name </td><td> Firma </td><td> Produktnummer </td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Multicell </td><td> 319 bis 005-CL </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td> Minimum Essential Media (MEM) </td><td> GIBCO </td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (FBS) </td><td> GIBCO </td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep) </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2636 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Menschliche merosin gereinigtes Protein (LN2) </td><td> Millipore </td><td> CC085 </td></tr><tr><td> Rekombinantes Ratten ciliary neurotrophen Faktors (CNTF) </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L-Thyroxin </td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27 ergänzen </td><td> GIBCO </td><td> 0080085-SA </td></tr><tr><td> Rinderinsulin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiod-L-thyronine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8783 </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7505 </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin (FUDR) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F0503 </td></tr><tr><td> Papain-Lösung </td><td> Worthington </td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> ROCHE </td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> CELLSTAR </td><td> 662-160 </td></tr><tr><td> T25-Zellkulturflaschen mit Entlüftungskappe </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10 cm Gewebekulturschalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10 cm Petrischale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713 </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> ROCHE </td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50 um Filter (optional) </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td> Myelin Basic Protein (MBP) Antikörper </td><td> AbD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2 Antikörper </td><td> Millipore </td><td> AB5320 </td></tr><tr><td> Myelin-assoziierte Glykoprotein (MAG) Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2 &#39;, 3&#39;-zyklische Nukleotid-3&#39;-Phosphodiesterase (CNP) Antikörper </td><td> Covance </td><td> SMI-91R-100 </td></tr><tr><td> Actin pan Ab-5-Antikörper </td><td> Fitzgerald </td><td> 10R-A106AX </td></tr><tr><td> Neurofilament-200 (NF)-Antikörper </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N4142 </td></tr><tr><td> Tubulin beta-3-Kette (Tuj1) Antikörper </td><td> Millipore </td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A11008 </td></tr><tr><td> Alexa 555 Ziege anti-Maus IgG (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte (IgG) (H + L) Sekundär-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> A21247 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Maus IgG (H + L)-HRP-konjugierten sekundären Antikörper </td><td> BioRad </td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td> Ziege anti-Ratte-IgG (H + L)-HRP-konjugierten sekundären Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-2065 </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole (DAPI) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9542 </td></tr></tbody></table> Medien Rezepte 100X OL-Supplement * <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Amount hinzufügen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1,02 g </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 0,6 mg </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> 161 mg </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> 0,05 mg </td></tr><tr><td> 3,3 &#39;,5-Triiod-L-thyronine </td><td> 4 mg </td></tr></tbody></table> * Lagerung bei -80 ° C in 250 ul Aliquots t &quot;&gt; OL Medien <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Amount hinzufügen </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 23,75 mL </td></tr><tr><td> 100X OL-Supplement </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Rinderinsulin (von 1 mg / mL Lager) </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> Holo-Transferrin (von 33 mg / mL Lager) </td><td> 37,5 ul </td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 125 ul </td></tr><tr><td> CNTF (von 50 ng / ul Lager) </td><td> 25 ul </td></tr></tbody></table> Mixed Gliazellen Kulturmedien (bis in DMEM gemacht) <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (0,33% ab Lager lieferbar) </td><td> 33 Einheiten / ml Penicillin und 33 ug / ml Streptomycin </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> DRGN Medien (bis in DMEM gemacht) <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Pen / Strep (1% ab Lager lieferbar) </td><td> 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin </td></tr></tbody></table> Aufschlusslösung Rezepte: OPC Papain-Lösung (in MEM gemacht) <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Papain-Lösung </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> 360 pg / mL </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60 ug / mL </td></tr></tbody></table> DRG Papain-Lösung (in HBSS gemacht) <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Papain </td><td> 1,54 mg / mL </td></tr><tr><td> L-Cystein </td><td> 360 pg / mL </td></tr></tbody></table> DRG Collagenase A-Lösung (in HBSS gemacht) <table border="1"><tbody><tr><td> Zutat </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> 4 mg / mL </td></tr></tbody></table>

ableitung von enriched oligodendrozyten kulturen und oligodendrozyten / neuron myelinisierenden co-kulturen von post-natal mausgeweben

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifizierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen OL Entwicklung ist nicht nur entscheidend für die Förderung unserer Kenntnis der OL Biologie, sondern hat auch Implikationen für das Verständnis der Pathogenese der demyelinisierenden Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS). Cellular Entwicklung wird allgemein mit primären Zellkultur-Modellen untersucht. Primäre Zellkultur erleichtert die Auswertung eines bestimmten Zelltyp durch die Bereitstellung einer kontrollierten Umgebung, frei von der Störvariablen, die in vivo sind. Während OL Kulturen von Ratten abgeleitet eine große Menge an Einsicht in OL Biologie zur Verfügung gestellt haben, hat ähnliche Bemühungen zur Schaffung OL Kulturen aus Mäusen, die mit großen Hindernissen erfüllt. Entwicklung von Methoden zur Kultur murine primäre OLs ist zwingend notwendig, um die Vorteile der zur Verfügung stehenden transgenen Mauslinien zu nehmen. Mehrere Methoden zur Extraktion von OPCs von Nagetier Gewebe beschrieben worden, von Neurosphäre Ableitung, Differential Haftung Reinigung und immunopurification 1-3. Während viele Methoden Erfolg bieten, verlangen die meisten umfangreichen Kultur-mal und / oder teure Ausrüstung / Reagenzien. Um dies zu umgehen, ist reinigend OPCs aus murinen Gewebe mit einer Anpassung der Methode ursprünglich von McCarthy &amp; de VELLIS 2 beschrieben bevorzugt. Bei dieser Methode wird die räumliche Trennung OPCs aus einer gemischten Gliazellen Kultur von neugeborenen Nagern Cortex abgeleitet. Das Ergebnis ist eine gereinigte OPC Bevölkerung, die in eine OL-angereicherten Kultur unterschieden werden können. Dieser Ansatz ist aufgrund seiner relativ kurzen Kulturzeit und der unnötige Voraussetzung für Wachstumsfaktoren oder Immunopanning Antikörper ansprechend. Während der Erkundung der Mechanismen der OL Entwicklung in eine gereinigte Kultur ist informativ, bietet es keine der physiologisch relevanten Umfeld für die Beurteilung der Myelinscheide Bildung. Co-Kultivierung OLS mit Neuronen würden Einblick in die molekularen Grundlagen zur Regelung OL-vermittelte Myelinisierung von Axonen zu verleihen. Für viele OL / Neuron Co-Kultur-Studien haben Spinalganglien Neuronen (DRGNs) nachweislich das Neuron Art der Wahl sein. Sie sind ideal für Co-Kultur mit OLs durch ihre einfache Extraktion, minimale Menge an kontaminierenden Zellen und die Bildung von dichten Neuriten Betten. Während Studien mit Ratte / Maus myelinisierenden xenocultures veröffentlicht worden sind 4-6, ein Verfahren zur Ableitung solcher OL / DRGN myelinisierenden Co-Kulturen von postnatalen murinen Gewebe wurde nicht beschrieben. Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Methoden auf, wie man effektiv produzieren solche Kulturen, zusammen mit Beispielen von den erwarteten Ergebnissen. Diese Methoden sind nützlich für die Behandlung relevanten Fragen OL Entwicklung / myelinisierenden Funktion und sind nützliche Werkzeuge im Bereich der Neurowissenschaften.

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung von angereicherten Populationen von murinen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) in primären Kultur, die, um zu reifen Oligodendrozyten (OLS) produzieren differenzieren. Darüber hinaus beschreibt dieser Bericht Techniken zur Herstellung murine myelinisierenden Co-Kulturen durch Impfen Maus OPCs auf einen Neuriten Bett Maus Spinalganglien Neuronen (DRGNs).

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Hi, ich bin Ryan O'Mara, Doktorand an der University of Ottawa und am Ottawa Hospital Research Institute. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Herstellung angereicherter Populationen von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen aus Mäusen, die allein oder in Kombination mit murinen dorsalen Wurzelganglien-Neuronen differenziert werden können, um myelinisierende Kulturen zu erzeugen. Beginnen wir mit einem kurzen Überblick über das Verfahren.Neugeborene Mäusegehirne werden dissoziiert und in T-25-Flaschen ausgesät. Nach einer Kultivierungszeit von neun Tagen bildet sich eine Astrozyten-Monoschicht auf dem Boden der Flasche, auf der sich Vorläuferzellen der Oligodendrozyten vermehren. Anschließend werden die Vorläuferzellen der Oligodendrozyten gewonnen und gereinigt und können danach in einer angereicherten Kultur zu reifen Oligodendrozyten differenziert werden.Wenn myelinisierende Kulturen gewünscht sind, werden Neuronen aus den Spinalganglien von Mäusen im Alter von P5 bis P10 gemeinsam mit den gemischten Gliazellkulturen kultiviert. Innerhalb von neun Tagen bilden diese Neuronen ein dichtes Netzwerk aus Neuriten, auf dem Vorläuferzellen der Oligodendrozyten ausgesät werden können.Dies ermöglicht die Oligodendrozyten-vermittelte Umhüllung der Neuriten, wodurch eine myelinisierende Kultur entsteht. Zunächst werden ganze Gehirne von Mäusen im Alter von P null bis P zwei in eiskaltes MEM gelegt und mit einem Skalpell unter dem Präparationsmikroskop so bearbeitet, dass die meningeale Schicht jedes Kortex längs durchtrennt wird. Danach werden die Meningen vorsichtig vom darunterliegenden Kortex abgehoben. Anschließend werden die Riechkolben entfernt, wobei das Gehirn mit der ventralen Seite nach oben liegt.Schneiden Sie tiefe Längsschnitte dort, wo die Kortices auf das ventrale Cephalon treffen. Heben Sie bei nach oben weisender dorsaler Seite des Gehirns die Kortices ab und zerkleinern Sie den Cordis in jeweils etwa vier Stücke. Überführen Sie die Kortices in ein 15-Milliliter-Konischgefäß, das 350 Mikroliter eiskaltes MEM pro Gehirn enthält.Gehirne desselben Genotyps werden im selben Gefäß zusammengefasst, sodass für vier Gehirne 1400 Mikroliter MEM erforderlich sind. Sobald die Dissektion abgeschlossen ist, bringen Sie die gesammelten Gehirne für drei Minuten in ein 37-Grad-Wasserbad. Danach überführen Sie im sterilen Zellkulturwerkbank die Gehirnstücke durch eine P-1000-Pipettenspitze, um sie in kleinere Stücke zu zerlegen.Fügen Sie 75 µL vorgewärmtes OPC Pap-Schmerzmittel pro Gehirn dem kegelförmigen Reagenzglas hinzu. Anschließend 20 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, wobei alle zwei Minuten zur Verhinderung einer Gewebeaggregation das Reagenzglas umgedreht wird.Nach Abschluss der Inkubation zwei Milliliter gemischte gliale Kultur hinzufügen. Medium pro Gehirn zum Verdau zugeben und 10 Minuten stehen lassen. Nach 10 Minuten die Gewebesuspension in Fünf-Milliliter-Kunststoffröhrchen portionieren.Die Anzahl der Röhrchen sollte der Anzahl der Gehirne in der Vorbereitung entsprechen. Unter Verwendung einer flammenglatten Pasteurpipette aus Glas werden die Inhalte jedes Röhrchens zunächst langsam, dann mit zunehmender Intensität versetzt, sobald die Gewebestücke zu dissociieren beginnen. Das Tririeren wird beendet, sobald keine sichtbaren Gewebestücke mehr in der Suspension vorhanden sind. Die Inhalte jedes Röhrchens werden in ein 50-Milliliter-Konischglas gegeben, das vier Milliliter gemischte Gliazellkultur enthält.Das Medium pro Gehirn nach mehrmaligem vorsichtigem Umstülpen des Röhrchens mischen, die Zellsuspension in 15-Milliliter-Konikalröhrchen portionieren. Die Anzahl der Röhrchen sollte der Anzahl der Gehirne in der Präparation entsprechen. Die Röhrchen bei 300 × g fünf Minuten lang zentrifugieren und die Pellets in je einem Milliliter gemischt glialen Kulturmedium resuspendieren. Die resuspendierten Zellen aus jedem Konikalröhrchen zu Poly-L-Lysin-beschichteten T-25-Flaschen hinzufügen, die zuvor mit fünf Millilitern gemischt glialem Kulturmedium vorgequollen wurden.Die Anzahl der Kolben sollte der Anzahl der dissezierten Gehirne entsprechen. Inkubieren Sie die Kolben in einem 37 °C-Inkubator mit 8,5 % CO₂. Nach drei bis vier Stunden sollten sich die Zellen am Substrat angeheftet haben. Es verbleibt jedoch viel Debris im Medium, das die Zellviabilität negativ beeinflussen kann.Um dies zu vermeiden, wechseln Sie das Medium nach drei bis vier Stunden durch frisches, gemischtes Gliazell-Kulturmedium, soweit möglich. Dieser Mediumwechsel entfernt einen Großteil des zellulären Abfalls. Am nächsten Tag.Es sollten viele Zellen auf dem Boden des Kolbens sichtbar sein. Am dritten Tag sollte sich eine Astrozyten-Monoschicht auf dem Boden des Kolbens bilden. Führen Sie zu diesem Zeitpunkt einen zwei Drittel Mediumwechsel durch, indem Sie vier Milliliter Medium entfernen und vier Milliliter frisches Medium hinzufügen.Dieser Schritt sollte alle drei Tage wiederholt werden. Am sechsten Tag sollte eine Astrozyten-Monoschicht deutlich sichtbar sein, auf deren Oberfläche sich Oligodendrozyten-Vorläuferzellen vermehren. Zu diesem Zeitpunkt das Kulturmedium am neunten Tag mit Insulin auf eine Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter ergänzen; an diesem Punkt sind die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen bereit, von der Astrozyten-Monoschicht getrennt zu werden.Um dies durchzuführen, stellen Sie die Kolben auf einen Rüttelapparat und in einen 5 % CO2-Inkubator. Lassen Sie die Kolben eine Stunde lang im Inkubator akklimatisieren. Anschließend schütteln Sie die Zellen 45 Minuten lang mit 50 U/min.Dieser Schritt entfernt viele locker angeheftete kontaminierende Zellen. Führen Sie einen kompletten Mediumwechsel durch, indem Sie das gesamte Medium entfernen und vier Milliliter frisches Kulturmedium hinzufügen. Stellen Sie das Kolben in einen 5% CO₂-Inkubator und lassen Sie es drei Stunden lang akklimatisieren.Zum Zeitpunkt von drei Stunden überprüfen Sie die Färbung des Kulturmediums. Das Kulturmedium sollte rot sein, was auf einen ausgeglichenen pH-Wert hinweist. Wenn die Farbe ins Orange oder Lila geht, stellen Sie den CO2-Gehalt des Inkubators entsprechend ein.Die Aufrechterhaltung eines ausgeglichenen pH-Werts ist wichtig für das Überleben der Vorläuferzellen der Oligodendrozyten während der nächtlichen Schüttinkubation. Sobald ein ausgeglichener pH-Wert erreicht ist, schütteln Sie den Kolben 220 U/min für etwa 16 Stunden. Am nächsten Morgen nehmen Sie den Kolben vom Schüttler und überführen das Medium aus den Kolben in 10 Zentimeter große Zellkulturgefäße.Diese Petrischalen dienen der weiteren Reinigung der Vorläuferzellen der Oligodendrozyten durch differenzielle Adhäsion. Jede Schale sollte Medium aus zwei Kolben erhalten und anschließend 30 Minuten bei 5 % CO2 inkubiert werden. Zum Zeitpunkt von 15 Minuten sollte jede Schale vorsichtig bewegt werden, um die Adhäsion der Vorläuferzellen der Oligodendrozyten an den Kunststoff zu verhindern.Nach der 30-minütigen Inkubation die Petrischalen im Phasenkontrast untersuchen. Oligodendrozyten-Vorläuferzellen sind als kleine Zellansammlungen erkennbar. Einige dieser Zellen können an der Schale haften.Lösen Sie die anhaftenden Vorläuferzellen der Oligodendrozyten durch vorsichtige Schütteln von der Schale. Seien Sie vorsichtig. Zu starkes Schütteln kann dazu führen, dass kontaminierende Zelltypen sich lösen.Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 300 × g. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer P-1000-Pipettenspitze. Anschließend zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer unter Verwendung einer P-200-Pipettenspitze. Die gereinigten Oligodendrozyten können dann am ersten Tag auf lamininbeschichtete Deckgläser aufgebracht werden, um sich zu angereicherten Oligodendrozytenkulturen zu differenzieren.Nach der Aussaat weisen die angereicherten Vorläuferzellen der Oligodendrozyten eine relativ einfache Morphologie auf und bilden nur wenige Fortsätze aus. Am dritten Tag haben sich differenzierende Oligodendrozyten ausgeprägt, wobei zahlreiche Fortsätze hervortreten, die an unreife Oligodendrozyten erinnern. Am sechsten Tag haben die Oligodendrozyten zu jedem Zeitpunkt in diesem Zeitraum myelinähnliche membranöse Ausstülpungen gebildet.Koverscheiben können fixiert und für die immunzytochemische Analyse verarbeitet werden. Anstelle der Aussaat der gereinigten Vorläuferzellen von Oligodendrozyten auf lamininbeschichteten Koverscheiben können diese auf Neuritenbetten von dorsalen Wurzelganglien ausgesät werden, um myelinbildende Koinulturen zu erzeugen. Der folgende Abschnitt beschreibt die Methoden zur Herstellung dieser Kulturen.Um zu beginnen, isolieren Sie ganze Wirbelsäulen von Mäusen im Alter von P5 bis P10 und überführen Sie sie unter einem Präparationsmikroskop mit Präparationscheren. Schneiden Sie durch den ventralen mittigen Bereich der Wirbelsäule in longitudinaler Richtung. Entfernen Sie vorsichtig die dorsalen Wurzelganglien oder DRGs mit feinspitzigen Pinzetten.Überführen Sie die Ganglien in Hank’s Pufferlösung mit Salz in eine Petrischale. Beschneiden Sie die DRG, sofern ihre Wurzeln übermäßig lang sind. Verwenden Sie eine breite Pipettenspitze für einen P 1000. Überführen Sie die Ganglien in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf, bis alle Mäuse verarbeitet wurden. Wenn die DRG-Isolierung abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei etwa 300 × g.Überführen Sie das Reagenzglas in eine sterile Zellkulturhaube und entfernen Sie das Überstand. Geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmtes DRG-Papin in das Reagenzglas und inkubieren Sie es 10 Minuten lang in einem 37-Grad-Wasserbad. Sobald die Papin-Digestion abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie und ersetzen Sie anschließend die Papin-Lösung.Mit 500 µL vorgewärmter Kollagenase-A-Lösung 10 Minuten bei 37 °C inkubieren. Wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt und ersetzen Sie die Kollagenase-A-Lösung durch 1 mL DRGN-Kulturmedium. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt 1 mL DRGN-Medium zugeben und mit einer flammenglätteten Pasteur-Pipette auftragen.Bewerten Sie die Ganglien zunächst langsam, dann mit zunehmender Intensität, während das Gewebe zu dissociieren beginnt. Sobald keine Gewebestücke mehr sichtbar sind, überführen Sie die Zellsuspension in eine Petrischale, die sieben Milliliter DRGN-Medien enthält. Inkubieren Sie die Schale in einem 37-Grad-Inkubator bei 8,5 % CO2 für eineinviertel Stunden.Nach dieser Inkubation die Petrischale beobachten. Im Phasenkontrast erscheinen die DRG-Neuronen als Zellen mit großem Zellkörper. Viele kontaminierende Zellen sollten fest an der Petrischale haften.Überführen Sie das Medium in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Platte mit vier Millilitern DRGN-Medium aus, um eventuell verbliebene Neuronen zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das resultierende Pellet in 500 Mikroliter DRGN-Medium.Zählen Sie die Zellen mithilfe eines HEO-Zytometers. Achten Sie darauf, nur die DRG-Neuronen zu zählen, und säen Sie 30 bis 50.000 Neuronen pro 12 Millimeter großem lamininbeschichtetem Deckglas in einem Milliliter DRGN-Kulturmedium aus. Inkubieren Sie die Zellen in einem Gewebekulturinkubator mit 8,5 % CO₂.Am nächsten Morgen erfolgt ein kompletter Mediumwechsel, indem das DRGN-Medium durch OL-Medium ergänzt mit 10 Mikromolar FUD R alle zwei Tage ersetzt wird. Danach erfolgt ein dreiviertel Mediumwechsel mit FUD r-supplementiertem OL-Medium. Bei Untersuchung unter dem Phasenkontrastmikroskop am ersten Tag haben die Neuronen bereits damit begonnen, einige Fortsätze auszubilden. Am dritten Tag haben sich die neuronalen Fortsätze verlängert.Am sechsten Tag hat sich ein Neuritenbett entwickelt, das aus zahlreichen miteinander verflochtenen Ausläufern besteht. Am neunten Tag hat die Dichte dieses Neuritenbetts zugenommen und es ist bereit, Oligodendrozyten aus wachsenden gemischten Hirnkulturen aufzunehmen. Parallel zu den Neuronenkulturen können am neunten Tag der Neuronenkulturen Oligodendrozyten-Vorläuferzellen gereinigt werden.Anschließend können sie auf die Neuritenbetten aufgebracht werden, indem 50.000 Zellen pro Vertiefung einer 24er-Platte hinzugefügt werden. Am sechsten Tag der Koevolution sind Zellen, die Oligodendrozyten ähneln, in Interaktion mit den DRG-Neuronen zu beobachten.Diese Kulturen können nun fixiert und für die Immunzytochemie aufbereitet werden. Wenn angereicherte Oligodendrozytenkulturen mit Antikörpern gegen die Oligodendrozyten-Marker NG2, MAG und MVP markiert werden, zeigen sich immunpositiv gefärbte Zellen mit stagespezifischen Morphologien. Diese Kulturen entstehen aus einer Population von NG2-positiven Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und bilden im Verlauf von sechs Tagen der Differenzierung MAG-positive reife Oligodendrozyten aus.Wenn eine SDS-Page an Lysaten durchgeführt wird, die aus oligodendrozytenangereicherten Kulturen gewonnen wurden, ist erkennbar, dass Oligodendrozyten über den Zeitraum von sechs Tagen hinweg CNPP und MVP exprimieren. Bei Betrachtung der DRG-Neuronen vor der Zugabe von Oligodendrozyten zeigen sich am neunten Tag dichte Taj1-positive und neurofilamentpositive Neuritbetten. Am sechsten Tag der Oligodendrozyten-DRG-Neuronen-Kokultur sind bei höherer Vergrößerung zahlreiche MBP-positive Oligodendrozyten sichtbar, die mit den Neuriten der Neuronen interagieren.Man sieht, dass Oligodendrozyten diese Neuriten mit einem MBP-positiven Membranüberzug umhüllen, der an Myelinisierung erinnert; eine digital vergrößerte Ansicht zeigt das Ausmaß der Überlappung der MBP-positiven Membran auf dem neurofilamentpositiven Fortsatz. Hallo, ich bin Scott Ryan, wissenschaftlicher Mitarbeiter am Ottawa Hospital Research Institute. Diese Techniken ermöglichen die Erzeugung von Ligament-, Endozyt- und DRG-Neuronen-Kokulturen aus Mäusen.Diese Technik ist wertvoll für die Untersuchung sowohl experimentell induzierter als auch transgener Modelle von myelinisierenden Erkrankungen. Sie eignet sich zudem zur Untersuchung neuartiger therapeutischer Substanzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Primary, vermehren humanen fötalen brain-derived, multipotente...

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Dieses Video zeigt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung der lateralen Ventrikelwände aus dem erwachsenen Mausgehirn und zur Durchführung einer enzymatischen Gewebedissoziation, um einzelne Zellen zu erhalten. Diese Zellen werden dann spezifischen Kulturbedingungen ausgesetzt, die die Proliferation von neuralen Stammzellen selektiv fördern und ihre Differenzierung in Co-Kulturen von Oligodendrozyten und Astrozyten fördern.

Gewinnung einer gemischten Oligodendrozyten- und Astrozytenkultur aus adulten neuralen Stammzellen der Maus

Dieses Video zeigt den Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) aus menschlichen embryonalen Stammzellen, gefolgt von der Reifung von OPCs zu Oligodendrozyten. Dieser Prozess der Erzeugung von Oligodendrozyten eröffnet zahlreiche Möglichkeiten, die Erforschung und Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, einschließlich Alzheimer, zu verbessern.

Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen in Oligodendrozyten

Dieses Video zeigt die Etablierung einer Co-Kultur von humanen induzierten Neuronen (iNs) und induzierten Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (iOPCs). iNs werden mit iOPCs in einer Co-Kultur gemischt und dann inkubiert, um die Reifung von iNs zu Neuronen und iOPCs zu Oligodendrozyten zu unterstützen. Neuronen bilden synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen und Oligodendrozyten, während Oligodendrozyten Myelinscheiden um die Axone der Neuronen bilden.

Eine Co-Kultur-Methode zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Das Video demonstriert ein Protokoll zur Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs) in Oligodendrozyten und zur Induktion der Myelinisierung in einer Co-Kultur mit Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG). Die OPCs werden mit lentiviralen Vektoren transduziert, die für ein Signalprotein kodieren, das die Myelinisierung reguliert. Die transduzierten OPCs werden mit DRG-Neuronen co-kultiviert, um die Differenzierung in Oligodendrozyten und die Signalprotein-induzierte...

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Oligodendrozyten sind die myelinisierenden Zellen des Zentralnervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung ihrer Vorläufer, der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, aus der Rattenrinde sowie eine schnelle und zuverlässige quantitative Methode zur Bewertung der Oligodendrogenese in vitro als Reaktion auf experimentelle Faktoren.

Herstellung von Ratten Oligodendrozyten Vorläuferkulturen und Quantifizierung von Oligodendrogenesis Mit Doppel-Infrarot-Fluoreszenz-Scanning

Wir beschreiben die Immunomagnetic Isolierung der primäre Maustaste Oligodendrozyten, ermöglicht die schnelle und spezielle Isolierung der Zellen für in-vitro- Kultur.

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

Hierin zeigen wir eine effiziente Methode zur Reinigung von Oligodendrozyten und zur Herstellung von Oligodendrozyten-konditionierten Medien, die für Kokulturexperimente verwendet werden können.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

Die Neuron-Glia-Interaktionen bei der Neurodegeneration sind aufgrund unzureichender Werkzeuge und Methoden nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir optimierte Protokolle zur Gewinnung induzierter Neuronen, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Oligodendrozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen und geben Beispiele für die Werte dieser Methoden zum Verständnis zelltypspezifischer Beiträge bei der Alzheimer-Krankheit.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

Wir beschreiben die Produktion von Mischkulturen von Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, die aus fetalen oder adulten neuralen Stammzellen gewonnen werden, die sich in reife Oligodendrozyten unterscheiden, und in vitro die Modellierung schädlicher Reize. Die Kopplung mit einer zellbasierten High-Content-Screening-Technik bildet ein zuverlässiges und robustes Wirkstoff-Screening-System.

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Lernen Sie die Ableitung angereicherter Oligodendrozytenvorläuferzellen aus neonatalen Mäusen und deren Differenzierung zu reifen Oligodendrozyten. Diese Methode ermöglicht myelinisierende Co-Kulturen mit dorsalen Wurzelganglienneuronen.

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben (Video) | JoVE Journal

Ableitung von Enriched Oligodendrozyten Kulturen und Oligodendrozyten / Neuron myelinisierenden Co-Kulturen von Post-Natal Mausgeweben

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