Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Proteasomaktivität in lebenden Zellen mithilfe eines GFP-Deron-Fusionsproteins zu messen. Klonen Sie zunächst die maßgeschneiderten Oligonukleotide für Deron und den Deron-Rahmenverschiebungsmutanten in den P-E-G-F-P-C1-Vektor und fahren Sie anschließend mit den Protokollen für das Gateway-System von Vitrogen fort. Erzeugen Sie danach mit HEK 293 FT-Zellen Viren für jeden Konstrukt. Nach der Bestimmung der Titration transduzieren Sie die Zellen mit dem Virus und setzen eine antibiotische Selektion ein, um anschließend die resultierenden stabilen GFP-DRON- oder GFP-Dron-Rahmenverschiebungsmutanten exprimierenden Zellen zu vermehren.

Diese Technik ermöglicht Experimente, bei denen die Zellantworten auf bestimmte Behandlungen durch Messung von Fluoreszenzsignalen überwacht werden. Beispielsweise kann die Proteasomaktivität einfach mittels Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie luminogenen oder fluorogenen Assays unter Verwendung ganzer Zellen und Säuren besteht darin, dass die Proteasomaktivität in lebenden Zellen gemessen wird. Für die Transfektion verdünnen Sie 36 Mikroliter Lipo 2000-Reagenz in 1,5 Milliliter DMEM; in einem anderen 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen verdünnen Sie die DNA-Konstrukte in 1,5 Milliliter DMEM.

Nach fünf Minuten beide Komponenten vereinigen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Ersetzen Sie nun das Medium einer konfluenten Kultur von HEK 2 93 FT-Zellen in einem T-75-Fläschchen durch sieben Milliliter DMEM. Anschließend die DNA-Lipo-Mischung zum Fläschchen hinzufügen und durch vorsichtiges Hin- und Herbewegen mischen.

Inkubieren Sie das Kolbenüberstand über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium durch 10 Milliliter DMEM. Nach 48 Stunden gewinnen Sie den Überstand. Filtern Sie den virushaltigen Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-PVDF-Filter.

Um das Virus zu konzentrieren, eine Volume PEG-Lösung zu vier Volumina Überstand geben und zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter periodischem Mischen durch Inversion inkubieren. Das Virus durch Zentrifugation gewinnen, nachdem der SNA des weißen Pellets abgesaugt wurde; zentrifugieren Sie erneut, um verbleibende PEG-Lösung zu entfernen. Den endgültigen Pellet in PBS durch Pipettieren resuspendieren und dann kräftig 20 bis 30 Sekunden vortexen.

Lagern Sie 100-Mikroliter-Aliquote des Virus bei minus 80 Grad Celsius. Säen Sie U2-OS-Zellen in Sechswellplatten und inkubieren Sie sie über Nacht. Ersetzen Sie für die Transfektion das Kulturmedium durch ein Milliliter DMEM, das acht Mikrogramm pro Milliliter enthält. Legen Sie eine Vertiefung als positiven Kontrollansatz beiseite und testen Sie eine Reihe von Virus-Konzentrationen in den verbleibenden Vertiefungen.

Inkubieren Sie über Nacht am folgenden Tag. Ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter DMEM und inkubieren Sie 24 Stunden lang. Beginnen Sie die Selektion mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin und ersetzen Sie weiterhin alle zwei Tage das Antibiotikum enthaltende Medium.

Ungefähr sechs bis sieben Tage später die Zelltod der nicht transduzierten Zellen überprüfen. Anschließend die Zellen dreimal mit PBS waschen, um sie zu färben. Mit Kristallviolett bedecken und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dann die Färbung abziehen, die Vertiefungen zweimal mit zweifach destilliertem Wasser spülen und die Platte lufttrocknen lassen.

Zählen Sie abschließend die Kolonien, um die Transfektionseinheiten des Virus pro Milliliter zu berechnen. Säen Sie humane diploide Fibroblasten in Sechs-Well-Platten mit acht Mikrogramm pro Milliliter Polybrain als Transduktionsverstärker.

Verwenden Sie eine Multiplizität der Infektion von zwei in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter. Wechseln Sie das Medium. Am nächsten Tag, wenn die Kultur 70 bis 80 % konfluent ist.

Beginnen Sie die chronische Selektion mit 10 Mikrogramm pro Milliliter. Über mehrere Tage hinweg die vollständige Zelltodentwicklung überwachen, was anzeigt, dass die Selektion abgeschlossen ist. Die stabil transduzierten Zellen vermehren, um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die GFP DERON- oder GFP Deron-Frameshift-Fusionsproteine exprimiert. Beginnen Sie damit, Zellen, die entweder GFP DRON oder GFP DRON-Frameshift tragen, am nächsten Tag drei Stunden vor den Fakten zu säen.

Behandeln Sie die Kontrollzellen mit einem Proteosom-Inhibitor. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und gewinnen Sie sie mit 0,5 Milliliter Trypsin. Um das Trypsin zu stoppen.

Verwenden Sie 4,5 Milliliter Kulturmedium und überführen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Nach einem Waschschritt mit PBS resuspendieren Sie das Pellet in 400 Mikroliter Fax-Puffer. Überführen Sie die Zellen in Fax-Röhrchen und stellen Sie sie auf Eis.

Jetzt Proben per Durchflusszytometrie messen. Das GFP-Deron-Fusionsprotein trägt eine Sequenz, die für den Proteasom-vermittelten sofortigen Abbau bestimmt ist. Im Gegensatz dazu wird der Rahmenverschiebungsmutant GFP Deron FS nicht durch Proteasome abgebaut.

Daher zeigen junge, mit GFP-Deron transduzierte humane primäre Fibroblasten mit erwartungsgemäß hoher proteasomaler Aktivität unter Epifluoreszenz ein geringes fluoreszierendes Signal. Dieselben Zellen, die mit GFP-Deron-Frameshift transduziert wurden, weisen 39,7 % positiver Zellen auf. Die Behandlung der Zellen mit dem Proteasomhemmer ll und L führt bei beiden Zelltypen – GFP-Deron und GFP-Deron-Frameshift – zu einem Anstieg der Signale auf maximal etwa 63 %.

Ähnliche Messungen in dermalen Fibroblasten, isoliert von jungen, mittelalten und alten Spendern, zeigen eine deutliche Zunahme des GFP-Signals zwischen jungen Individuen und mittelalten Spendern, was auf eine Abnahme der Proteasomaktivität in Proben von älteren Spendern hindeutet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lentivirale Partikel herstellt, Zellen transfectiert und die Proteasomaktivität in lebenden Zellen bestimmt.