Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca ^{2 +} Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in Agar eingebettete Netzhautschnitte für die Untersuchung der Mikroschaltkreise zu präparieren, die sich in den präsynaptischen Nervenendigungen der bipolaren Zellen befinden. Dies wird erreicht, indem zuerst die Netzhaut von einem dunkel angepassten Goldfischauge entnommen und ein kleines rechteckiges Stück dieser Netzhaut geschnitten wird. Das Netzhautstück wird dann in eine transparente Agarlösung mit niedrigem Schmelzpunkt getaucht, die dann in einer schönen Kaltscheibenlösung verfestigt wird.

Der nächste Schritt besteht darin, den festen Agarblock, der das rechteckige Stück Netzhaut enthält, mit einem Vibrator zu schneiden. Der letzte Schritt besteht darin, zu visualisieren, zu identifizieren und zu patchen. Klemmen Sie eine bipolare Nervenendigung ein.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse den präsynaptischen Kalziumstrom und die synaptische physikalische Exozytose mit Membrankapazitätsmessungen von zerstäubten und intakten bipolaren Zellterminals. Hallo, mein Name ist Han Kim. Ich bin Postdoc im PCO des Labors am Burham Institute.

Heute werde ich die AGA-eingebettete Schichtpräparation von kalter Gesichtsretina vorstellen und die Messung der Patch-Clamp-Kapazität an einer einzigen Pipeline demonstrieren. Um diesen Vorgang zu beginnen, säumen Sie jedes Auge eines Goldfisches, indem Sie mit einer Federschere gleichmäßig um die Vorderseite des Auges herum schneiden. Legen Sie dann die Augenmuscheln in eine gekühlte Scheibenlösung ohne Kalzium.

Entfernen Sie gegebenenfalls die Linse mit einer Pinzette. Entfernen Sie als Nächstes das an der Netzhaut haftende Pigmentepithel, indem Sie die Netzhaut mit einer um 45 Grad abgewinkelten Pinzette von der Augenmuschel abziehen. Schneiden Sie danach den Sehnerv entweder mit einer feinen Pinzette oder einer Federschere durch.

Saugen Sie dann mit einer modifizierten Nudelpipette oder einer Transferpipette mit großer Spitze ab. Um die Netzhaut zu entfernen, entfernen Sie vorsichtig den Rest des Pigmentepithels, das an der Netzhaut haftet. Die Oberfläche der gereinigten und gesunden Netzhaut sollte glatt erscheinen.

Behandeln Sie dann die isolierte Netzhaut mit etwa 0,03 % höherer IDE für 15 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um den Glaskörper zu entfernen, beachten Sie, dass der Eingriff bei schwachem Licht durchgeführt werden sollte. Im nächsten Schritt schneidest du ein rechteckiges Stück Netzhaut von etwa zwei mal zwei Millimetern ab, das die volle Dicke der Netzhaut enthält, indem du die gebogenen Kanten mit einer Rasierklinge entfernst.

Übertragen Sie dann das Netzhautstück in einen kleinen Behälter, der mit Agarlösung gefüllt ist, und versuchen Sie, die Menge der Lösung um die Netzhaut herum zu minimieren, wenn sie in den flüssigen Agar gegeben wird. Tauchen Sie anschließend die Netzhaut mit dem Agar direkt in die eiskalte Scheibenlösung, um den Agar zu verfestigen. Schneiden Sie als Nächstes den festen Agarblock, der das rechteckige Stück Netzhaut enthält, in einen Würfel nach dem anderen mal einen Zentimeter

Kleben Sie den Block auf die Oberfläche der Schneideplatte in der preco Scheibenkammer. Schneiden Sie dann den Block in der eiskalten Scheibenlösung in Scheiben mit einer Dicke von 200 bis 250 Mikrometern. Mit einem Vibrato können insgesamt fünf bis 10 Scheiben gewonnen werden, die etwa fünf bis sechs Stunden haltbar sind.

Übertragen Sie danach eine der Scheiben in die Aufnahmekammer. Lege einen U-förmigen Platinrahmen mit einem Gitter aus Nylonfäden auf die Scheibe. Perfundieren Sie die Scheibe kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Millilitern pro Minute mit einer Aufzeichnungslösung, die mit Carbogen blasig ist.

Verwenden Sie in diesem Schritt eine Spritze mit einer 0,2-Mikron-Filterspitze, um die Glaspflasterpipette bis zu einer Höhe von ein bis zwei Zentimetern von der Rückseite der Pipette entfernt mit interner Lösung zu füllen. Entfernen Sie anschließend Luftblasen von der Spitze. Befestigen Sie die Pipette in der Halterung.

Üben Sie positiven Druck auf die Pipette aus und bewegen Sie sie mit einem Mikromanipulator in Richtung des Zielanschlusses, während Sie die Spitze durch die Scheibe nach unten bewegen. Bewegen Sie die Pipette in eine seitliche Schwenkrichtung, um sicherzustellen, dass die Scheibe nicht mit der Spitze mitgezogen wird. Bewegen Sie dann die Pipettenspitze um den Anschluss, um die Membranoberfläche zu reinigen.

Drücken Sie die Spitze nach unten gegen die Kante des Anschlusses, um ein Grübchen zu erzeugen und den Überdruck abzulassen. Wenn sich keine Giga-Ohm-Dichtung bildet, üben Sie sofort leichten Unterdruck auf die Pipette aus. Sobald eine Giga-Ohm-Dichtung gebildet ist, schalten Sie den E PC nine Patch Clamp-Verstärker in den Onsell-Aufnahmemodus und ändern Sie das Haltepotenzial auf minus 60 oder minus 70 Millivolt.

Wenden Sie die schnelle Kapazitätskorrektur an und warten Sie, bis sich die Dichtung zwischen fünf und 10 Gigaohm stabilisiert hat. Reißen Sie dann die Membran mit scharfem, sanftem Sog auf. So richten Sie die Konfiguration für die Aufzeichnung ganzer Zellen ein.

Sie können auch eine Mundabsaugung anstelle einer Spritze verwenden. Nachdem die gesamte Zellkonfiguration auf einem zerstäubten MB-Anschluss eingerichtet wurde, wenden Sie eine Depolarisation in Schritten von 200 Millisekunden von minus 70 auf null Millivolt an. Denken Sie daran, dass eine Sinuswelle von zwei Kilohertz in einem Spannungsklemmmodus vor und nach dieser Depolarisation angelegt wird. Um die Membrankapazität zu messen, ermöglicht die Depolarisation die direkte Messung von nach innen gerichteten Kalziumströmen, die durch das Öffnen von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen vom Typ L mit einer internen Lösung auf Cäsiumbasis aktiviert werden.

Parallel dazu ist man in der Lage, den Kapazitätssprung zu überwachen, der durch die kalziumabhängige Exozytose der synaptischen Vesikel verursacht wird, wodurch die Membranoberfläche vergrößert wird. Wenn eine intakte MB-Bipolarzelle mit der Pipette am synaptischen Anschluss geflickt wird, werden aufgrund der großen Leckströme aufgrund der Gap-Junction-Kopplung in den Do-Rechten der MB-Bipolarzellen keine erkennbaren Calciumströme beobachtet. Was man beobachtet, ist ein großes, nach außen fließendes Leck wie Strom.

Man ist jedoch immer noch in der Lage, den Kapazitätssprung mit einem hochfrequenten sinusförmigen Stimulus zu überwachen, der vor und nach dem gezeigten Depolarisationsschritt aktiviert wird. Hier sind die Beispiele für I-R-D-I-C, Bilder von M bipolaren Zellterminals. Die intakten Klemmen erscheinen eher elliptisch, wie in A und B gezeigt, während C den misierten Anschluss zeigt, der rund und kreisförmig erscheint.

Die Farbstofffüllmethode kann auch zur Klassifizierung der Zellterminalien verwendet werden. Hier sind die Beispiele für die Fluoreszenzbilder von bipolaren MBI-Zellterminalien mit einem intakten Axon in D, einem teilweise durchtrennten Axon in e und einem vollständig entfernten Axon in F. Ihre Teria sind durch die blauen Pfeile gekennzeichnet. Hier sind die direkten Messungen von Calcium-Bildgebungssignalen, Exozytose und inhibitorischer Rückkopplung zu sehen.

In einem bipolaren MB-Zellterminal wurde eine transient ansteigende Calciumkonzentration in der Teleria eines MB-Terminals durch eine Depolarisation in einem Spannungsklemmenstufen-Depolarisation aktiviert. Das entsprechende Fluoreszenzbild der MB-Teleria ist in B zu sehen. Beispiele für eine kurzfristige synaptische Depression der Neurotransmitterfreisetzung sind in C gezeigt. Es ist wichtig, daran zu denken, die Menge der Lösung um die Netzhaut herum zu minimieren, wenn sie in den Kit-Agar gegeben wird. Dies verbessert die Anhaftung von latinisierten aus dem Agarblock.