Nach Cell-Schicksal E. coli Nach Infektion mit Phagen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops der Sulfatverteilung in E. coli in Echtzeit nach einer Infektion mit dem Phagen Lambda zu folgen. Erstellen Sie zunächst ein grobes Lysat des Phagen Lambda. Anschließend reinigen Sie den Phagen und infizieren E. coli im Reagenzglas mit dem Phagen Lambda.

Verfolgen Sie weiterhin das Schicksal der Bakterienzellen unter dem Mikroskop. Letztendlich können die Ergebnisse in Echtzeit unterschiedliche Zellschicksale in E. coli zeigen, basierend auf der Expression verschiedener fluoreszierender Proteine, die mit Zellwachstum oder Zelltod assoziiert sind. Eine allgemeine Herausforderung dieser Methode liegt in der Herstellung einer gereinigten Front und einer markierten FI-Stammlösung.

Um eine Teilung der Fige während der Vorbereitung und Reinigung zu vermeiden, optimieren Sie auch die Bildgebungsparameter am Mikroskop, um ein gesundes Zellwachstum zu ermöglichen. Inokulieren Sie eine Übernachtkultur von E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in LBM-Medien bei einer Zelldichte von OD 600 von etwa 0,6 und induzieren Sie die Lygen in einem Wasserbadrührer bei 42 Grad Celsius.

Fortsetzen der Inkubation bei 37 Grad Celsius, bis eine Lyse erkennbar ist. Die Kultur wird klar. Nun 2 % Chloroform hinzufügen und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Als Nächstes überführen Sie das Phagenlysat in 250-Milliliter-Flaschen und zentrifugieren die Kultur. Danach gewinnen Sie den Überstand, der die Phagenpartikel enthält, und führen eine zweite Zentrifugation durch, um sichtbare Rückstände gemäß standardmäßigen Phagentitrationsprotokollen zu entfernen. Bestimmen Sie die Phagenkonzentration, reinigen Sie anschließend die Phagen über einen Cäsiumchlorid-Gradienten und prüfen Sie die Aktivität mittels DPI zur Herstellung von aro-Platten.

Reinigen Sie sechs Objektträger mit 70 % Ethanol. Ordnen Sie fünf Objektträger wie gezeigt an und sichern Sie sie mit Klebeband. Gießen Sie nun eine Lösung von 1,5 % Aros in Medium auf die befestigten Objektträger.

Platzieren Sie den letzten Objektträger oben darauf und vermeiden Sie sorgfältig Luftblasen. Legen Sie ein Gewicht darauf und lassen Sie das AROS etwa 30 Minuten abkühlen. Entfernen Sie die vier seitlichen Objektträger und verpacken Sie den Objektträgerblock mit Frischhaltefolie.

Unter Verwendung einer Übernachtkultur transformierter Bakterien als Inokulum eine Kultur in LBMM ansetzen, einen Milliliter Bakterien pelletieren und resuspendieren. Die Zellen in 20 Mikroliter eiskaltem LBMM mit einer breiten Pipettenspitze suspendieren.

Fügen Sie 20 Mikroliter gereinigten Phagen hinzu. Vorsichtig mischen und zunächst 30 Minuten auf Eis inkubieren, um die Phagenabsorption zu ermöglichen. Anschließend fünf Minuten im Wasserbad bei 35 Grad Celsius.

Um die Phagen-DNA-Injektion auszulösen, lösen Sie alle Zellaggregate durch Mischen auf. Verdünnen Sie die Mischung im Verhältnis 1:10 in LBMM. Stellen Sie nun eine LBM-Agroschale bereit.

Geben Sie einen Mikroliter der Phagen-Zellmischung auf einen Deckgläser. Sobald die Flüssigkeit absorbiert ist, platzieren Sie vorsichtig einen weiteren Deckgläser darauf. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines Bildsatzes über den YFP-Kanal für den ersten Zeitrahmen.

Nehmen Sie eine Serie von 15 Bildern in 200 Nanometer Z-Achsen-Abständen auf. Zusätzlich nehmen Sie ein einzelnes scharfes Bild durch die Phasenkontrast- und mCherry-Kanäle auf. Anschließend erfassen Sie einen Zeitrafferfilm zum Zellschicksal nach der Infektion.

Um die Ausbleichung und Phototoxizität während der Zeitrafferaufnahme zu minimieren, verwenden Sie pro Zeitpunkt ein einzelnes Z-Positionsbild pro Kanal und nehmen Sie die Probe in den Phasenkontrast-, YFP- und M-cherry-Kanälen in Intervallen von 10 Minuten über einen Zeitraum von etwa vier Stunden auf. Beginnen Sie die Bildanalyse mit einer manuellen Zählung der Phagen und notieren Sie außerdem die Phagenlokalisation sowie die Zelllänge. Vermerken Sie im initialen Zeitfenster die Zellschicksale lytisch, lysogen oder nicht infiziert.

Dokumentieren Sie außerdem die Lysezeit und alle weiteren gewünschten Informationen, indem Sie den Zeitrafferfilm abspielen, und gewinnen Sie weitere quantitative Daten wie den Fluoreszenzlevel über die Zeit in einzelnen Zellen, indem Sie automatisierte Algorithmen zur Zellerkennung und Linientracing verwenden. Typischerweise sind die Plaques der fluoreszenzmarkierten Phagen deutlich kleiner als die des Wildtyps, und die YFP- und DAPI-Signale eines erfolgreich gereinigten Phagen colokalisieren. Diese Daten kombinieren Bildsätze aus den Phasenkontrast-, YFP- und mCherry-Kanälen sowie die entsprechenden überlagerten Bilder aus einem Zeitrafferfilm.

Die einzelnen Phagen sind im Anfangszeitraum deutlich sichtbar. Hier werden zwei Zellen gesehen, von denen jede von einem einzelnen Phagen infiziert ist, und eine Zelle, die von drei Phagen infiziert ist. Typischerweise befinden sich mehrere Phagen auf der Zelloberfläche, während andere Phagen nicht adsorbiert sind.

Mit der Zeit wird das Infektionsoutcome unterscheidbar. 80 Minuten später sind die beiden Zellen, die jeweils durch einzelne Phagen infiziert wurden, in den lytischen Weg eingetreten. Bei intrazellulärer Produktion neuer Phagen hat die durch drei Phagen infizierte Zelle den lysogenen Weg eingeschlagen, gekennzeichnet durch die Produktion von mCherry aus dem Prämotor.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie gut verstehen, wie man einen gereinigten Phagenstamm herstellt, um E. coli-Bakterien mit dem Phagen Lambda zu infizieren, und wie man die Lebensweise in Echtzeit unter dem Mikroskop bildlich darstellt.