Name: Nach Cell-Schicksal E. coli Nach Infektion mit Phagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Lernen Sie die Präparation fluoreszenzmarkierter Bakteriophagen Lambda und deren Infektion von E. coli für die Echtzeit-Beobachtung unter dem Fluoreszenzmikroskop. Diese Methode ermöglicht die Analyse unterschiedlicher Zellschicksale.

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Wir sind dankbar, dass Michael Feiss und Jean Sippy für die Führung auf Phagen Erstellung und Reinigung. Wir danken Michael Elowitz für die Bereitstellung der Zell-Erkennung Software, Schnitzcell. Der Welch Foundation (Grant Q-1759) und Human Frontier Science: Arbeit in der Golding Labor ist durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01GM082837), der National Science Foundation (Center für Physik von lebenden Zellen 082265, PFC) unterstützt Program (RGY 70/2008).

<ol><li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switches+in+bacteriophage+lambda+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+genetic+switch+%3A+phage+lambda+revisited%22">A genetic switch : phage lambda revisited</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHendrix%2C+RW+%22Lambda+II%22">Lambda II</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1983).</li>
<li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHershey%2C+AD+%22The+Bacteriophage+lambda%22">The Bacteriophage lambda</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. (1971).</li>
<li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li>
<li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. , John Wiley & Sons. (1994).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFasman%2C+GD+%22Practical+handbook+of+biochemistry+and+molecular+biology%22">Practical handbook of biochemistry and molecular biology</a>. , CRC press. (1989).</li>
<li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li>
<li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Personal communication with M. Feiss. , Forthcoming.</li>
<li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host%3A+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bakterienstämme, Phagen und Plasmide: Stamm LE392 ist supF. Es wurde gewählt, um die Sam7 Mutation im Phagengenoms unterdrücken (siehe Tabelle 1 für weitere Details). So wird induzierten Lysogene schließlich lysieren und lassen Phagenpartikel, ebenso wie infizierte Zellen, die die lytischen Weg gewählt haben. Lysogenen Zellen werden bei 30 ° C aufgrund der Anwesenheit des temperaturempfindlichen cI 857-Allel im Phagengenom. Nach Wärmeinduktion werden gpD-EYFP und Wildtyp gpD aus dem Genom von λ LZ1 und dem Plasmid pPlate * D jeweils coexprimiert. Als Ergebnis enthält das Kapsid des neugeschaffenen Phagen λ LZ2 eine Mischung aus gpD-EYFP und gpD Proteine. Dieses Mosaik Phagen ist strukturell stabil und ausreichend Fluoreszenz auf die Detektion von einzelnen Phagen 5 zu ermöglichen. pP RE - mCherry ist ein Reporterplasmid zur Wahl des lysogenen pathwa erkenneny. Der Promotor P RE wird durch CII beim Aufbau Lysogenie 1,11 aktiviert. pP RE - mCherry 5 wurde aus pE-gfp 11 durch Austausch gfp mit mCherry 12 abgeleitet. Für weitere Details siehe unseren früheren Arbeiten 5. Growth Zustand Parameter: Während Lysogen Induktion (Abschnitt 1), gibt milde Schütteln bei 180 rpm ein guter Virus Ausbeute 13. Verwenden von Glucose im Wachstumsmedium sollte als Glucosemetabolismus vermieden werden erzeugt sauren Stoffwechselprodukte, und reife Lambda Partikel sind instabil bei saurem pH 13. Die Zugabe von MgSO 4 wird zur Stabilisierung des Phagen-Kapsid 3 ab. Für tragende Phagen cI Wildtyp (statt cI 857), kann die induzierte Lysogen Verwendung der DNA-schädigende Mittel Mitomycin C 3 ist. Im Schritt 1.3 wird die Inkubation bei 37 ° C normalerweise nicht länger als 90 Minuten. Es ist usef<html> ul die Zelldichte von OD 600 Check alle 30 min. Für eine gute Lysat sinkt OD 600 auf etwa 0,2 oder weniger, und der verbleibende OD 600 ist ein Ergebnis der Zelltrümmer. Inkubation zu lange in einer niedrigeren Phagen Ertrag führen, da die neu geschaffene Phagen können beginnen, ihre DNA in Zelltrümmer zu injizieren. Um ein sichtbares Phagen Band (mindestens 1 x 10 11 Phagenpartikel) in den Schritten 2.11 und 2,13 zu erhalten, wachsen mindestens 500 ml Kultur in Schritt 1.2. Der Zusatz von 0,2% Maltose in das Wachstumsmedium in den Schritten 5.1 und 5.2 an die Induktion der Expression des LamB, der Rezeptor für den Phagen Lambda-Adsorption 3,14 abzielen. MCherry - das 1000-fache Verdünnung statt 100-fach in Schritt 5.2 wird zur Verringerung der mCherry Hintergrundpegels von der Reporterplasmid pP RE abzielen. In Schritt 5.5 für Phagen DNA-Injektion auslöst, 35 ° C gewählt wird, um die Induktion des temperatursensitiven cI857 Allel vermeiden. Phage Reinigung: jove_content &quot;&gt; Die Phagen Reinigungsschritte (Schritte 2.1 bis 2.11) können mit anderen Aufreinigungsprotokolle 5 ersetzt werden, aber die endgültige Ultrazentrifugation durch CsCl Gradienten Gleichgewicht (Schritte 2.12 und 2.13) ist unvermeidbar. Ausschwingrotoren in den Schritten 2.10 und 2.12 bis benötigten sorgen für scharfe sichtbar Phagen Bands. Erhalt einer reinen Phagen Lager kann leicht bis zu einer Woche, so ist es notwendig, die Phagentiter auf dem Weg zu überprüfen, um sicherzustellen, dass nichts schief geht während der Zwischenschritte. Phage Handhabung: Bei allen Reinigungsverfahren in Abschnitt 2, ist es wichtig zu handhaben Phagen vorsichtig Lysat zu vermeiden Scher Phagen tails aus Phagen Köpfe. Während Zellinfektion in Abschnitt 5 (zB Schritte 5.5 bis 5.7), ist es auch wichtig, um die Scherung von Phagenpartikeln aus der infizierten Zelle zu vermeiden. Beachten Sie, dass, wenn der Phage aus der infizierten Zelle nach dem Injizieren seine DNA geschert wird, das Ergebnis ein &quot;dunkel&quot; Infektion ist, dh der infection Ergebnis wird im Experiment beobachtet werden, aber die Infektion Phagen nicht. Um solche Probleme zu minimieren, verwenden wir eine breite Pipettenspitze Beim Einsatz von Phagen oder Phagen / Zellgemisch. DAPI Testing: Färbung des Phagen Lager mit DAPI (Abschnitt 4) ist eine schnelle und effiziente Methode, um die Reinheit des Phagen Lieferverfügbarkeit überprüfen. Es kann auch verwendet werden, um mögliche Abbau eines bestehenden Phagen Lager über die Zeit zu testen. Lager für ein reines, sollte die Ko-Lokalisation von YFP und DAPI-Signale unter dem Fluoreszenzmikroskop nahe 100% liegen. Wir beobachten, dass typischerweise weniger als 1% der YFP Spots enthalten keine DAPI (repräsentiert Kapside ohne Virusgenom), was bedeutet, dass diese Teilchen nicht erfolgreich verpacken virale DNA anzeigt oder bereits ihre DNA injiziert anderswo. Weniger als 1% der DAPI-Spots enthalten keine YFP (entsprechend nicht fluoreszierenden Phagen). Ist dies nicht der Fall ist, die Schritte 2,12 bis 2,14 Notwendigkeit, in o wiederholt werdenrder wieder zu reinigen. Im Hinblick auf die Bildparameter, ist das Mikroskop Setup in Schritt 4,3 nicht so kritisch wie in Abschnitt 5, da keine langfristigen live-cell imaging hier erforderlich ist. Allerdings halten die gleichen Mikroskopie Einstellungen wie in Abschnitt 5 ist nützlich, wenn man wünscht, die Fluoreszenzintensität eines einzelnen Phagenpartikel zu kalibrieren. Falls der PBS-Agarose Bramme nicht sehr sauber oder zu sehr DAPI Farbstoff verwendet wird, können einige DAPI Stellen entsprechend Phagen-DNA mit einem &quot;Halo&quot; umgeben sein. Wenn zu wenig DAPI Farbstoff verwendet wird, kann das Signal von der DAPI-Kanal sehr schwach sein. Microscope System: Für die Bildgebung in Abschnitt 6, verwenden wir eine kommerzielle invertierten Epifluoreszenzmikroskop (Eclipse TE2000-E, Nikon) mit einer 100x-Objektiv (Plan Fluo, numerische Apertur 1,40, Öl-Immersion) und Standard-Filter-Sets (Nikon). Die Fluoreszenz Lichtquelle eine Bogenlampe mit Steuerung der Lichtintensität. Die folgenden Funktionen sind computergesteuert: x, y und z position; Hellfeld-und Fluoreszenz-Shutter und Fluoreszenz-Filter Wahl. Eine Autofokus-Funktion erforderlich ist. Andernfalls kann der Fokus leicht abdriften während der Zeitraffer-Film (in der Regel 4 Stunden lang). Die Möglichkeit, mehrere (x, y)-Positionen zu jedem Zeitpunkt zu erwerben ist nützlich, da sie mehrere Infektionsereignissen parallel verfolgen können. Wir in der Regel erwerben 8 Bühne Positionen in jedem Film, nach bis zu 100 Infektionen Veranstaltungen. Die Kamera, die wir verwenden, ist eine gekühlte 512x512 CCD mit 16x16 um Pixel-Kamera mit einem Dynamikbereich von 16 Bit (Cascade512, Photometrics). Akquisition unter Verwendung MetaMorph Software (Molecular Devices). Das Mikroskop sollte in einem temperierten Raum gestellt werden, alternativ der Mikroskoptisch sollte durch eine temperaturgesteuerte Kammer umgeben sein. Image Acquisition: Für Live-Cell-Imaging, ist es wichtig, um unnötige Belastung der Probe, die Bleich-und pho führen könntetotoxicity. Daher ist es am besten, zuerst zu charakterisieren Ihr System, um eine optimale Belichtung, die für die Fluoreszenz-Detektion ermöglicht zwar nicht was zu übermäßigen Bleichen oder Hemmung des Zellwachstums zu finden. Um eine gute Fluoreszenz-Bild zu erhalten, mit dem spannenden Lichtintensität, Belichtungszeit und Kamera Gewinn spielen. In den Schritten von 6,2 bis 6,3, wird das Gestell 10 min Intervall für den Zweck der Minimierung Belichtung gewählt. In jedem Rahmen ist nur ein einziger In-Fokus-Bild im Phasenkontrastmikroskop (für Zellerkennung) und fluoreszierenden Kanäle (zum Bestimmen Zellschicksals) benötigt. In dem ersten Zeitpunkt sind jedoch mehrere Bilder z-Position durch den Kanal YFP erforderlich, um alle infizierenden Phagen an der Zelloberfläche zu erfassen. Die YFP Belichtungszeit im Anfangs-Rahmen müssen gegebenenfalls auch höher sein als die für den Zeitraffer-Film in den späteren Zeitrahmen verwendet. Image Analysis: Sehr genau rechnen Phagenpartikel Umgebung der Zelloberfläche in Schritt 7.1. Alsbereits erwähnt, nehmen wir eine Reihe von Z-Stapel durch YFP-Kanal in Schritt 6.2. Dies kann jedoch noch verlassen einige fluoreszierende Phagenpartikel out-of-focus, die die Zählung herausfordert. Die Zellenlänge in der anfänglichen Zeitspanne wird gemessen unter Verwendung des Metamorph Software. Die Zelle kann auch durch Länge ImageJ oder andere Software-Tools zu messen. Zusätzlich kann ein automatisiertes Haus gebaut Matlab Programm sehr nützlich sein, Informationen zu erhalten, wie Fluoreszenz-Änderung über die Zeit entlang Zelllinien.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Fisher Scientific </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM-Puffer </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> Sigma </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> Nadel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> Dialysekassette </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Corning </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti ultra-durchsichtigen Schlauch </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti ultra-durchsichtigen Schlauch </td><td> Beckman Coulter </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti Rotors </td><td> Beckman Coulter </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti Rotors </td><td> Beckman Coulter </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> Refraktometer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluoreszenzmikroskop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000-E </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Ausrüstung.

nach cell-schicksal<em&gt; e. coli</em&gt; nach infektion mit phagen

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Das System umfasst Bakteriophagen (Phage) Lambda und das Bakterium E. coli ist seit langem als ein Paradigma für die Zell-Schicksal Bestimmung 1,2 serviert. Nach der simultanen Infektion der Zelle durch eine Anzahl von Phagen wird einer der zwei Pfade ausgewählt lytischen (virulenten) oder lysogenen (ruhenden) 3,4. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, Fluoreszenzmarkierung einzelnen Phagen und konnten die nach der Infektion Entscheidung in Echtzeit unter dem Mikroskop zu untersuchen, auf der Ebene der einzelnen Phagen und Zellen 5. Hier beschreiben wir die ganze Prozedur für die Durchführung der Infektion Experimente in unseren früheren Arbeiten 5 beschrieben. Dazu gehören die Schaffung von fluoreszierenden Phagen, Infektion der Zellen, Bildgebung unter dem Mikroskop und Datenanalyse. Das fluoreszierende Phage ist ein &quot;Hybrid&quot;-, Co-exprimierenden Wildtyp und YFP-fusion Versionen des Kapsids gpD Protein. Eine grobe Phagenlysat wird zunächst durch Induktion einer Lysogen der gpD-EYFP (Enh erhaltenWEITERFÜHRENDE Yellow Fluorescent Protein) Phagen, ein Plasmid, die Wildtyp-gpD. Eine Reihe von Reinigungsschritte werden dann durchgeführt, gefolgt von DAPI-Kennzeichnung und Bildgebung unter dem Mikroskop. Dies wird getan, um die Gleichmäßigkeit, DNA Verpackungseffizienz, Fluoreszenzsignal und strukturelle Stabilität des Phagen Lager verifizieren. Die anfängliche Adsorption der Phagen an Bakterien wird auf Eis durchgeführt, dann gefolgt von einer kurzen Inkubation bei 35 ° C, um virale DNA-Injektion 6 auslösen. Die Phagen / Bakterien Gemisch wird dann auf die Oberfläche einer dünnen Nähr-Agar-Platte, bedeckt mit einem Deckglas und abgebildet unter einem Epifluoreszenzmikroskop bewegt. Die nach der Infektion Prozess wird für 4 Stunden folgte, bei 10 min Intervall. Mehrstufige Positionen nachgeführt, so dass ~ 100 Zellen Infektionen in einem einzigen Experiment zurückgeführt werden kann. An jeder Position und Zeitpunkt werden die Bilder in der Phasenkontrast-und rot und grün fluoreszierendes Kanäle erfasst. Die Phasenkontrast-Bild wird später für die automatisierte cel verwendetl Anerkennung während die fluoreszierenden Kanäle verwendet werden, um die Infektion zu charakterisieren Ergebnis: Herstellung neuer fluoreszierenden Phagen (grün) durch Zelllyse oder Expression Lysogenie Faktoren (rot) durch Wiederaufnahme Zellwachstum und-teilung folgt. Die erworbenen Zeitraffer-Filme verarbeitet werden mit einer Kombination aus manuellen und automatisierten Methoden. Datenanalyse führt zur Identifizierung einer Infektion Parameter für jeden Infektion Ereignis (z. B. Anzahl und Positionen der infizierenden Phagen) sowie Infektion Ergebnis (Lyse / Lysogenie). Zusätzliche Parameter extrahiert werden, falls gewünscht.

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren zur Herstellung eines fluoreszenzmarkierten Version des Bakteriophagen Lambda, Infektion<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien nach der Infektion Ergebnis unter dem Mikroskop, und die Analyse von Infektion führt.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

Das System, bestehend aus dem Bakteriophagen (Phagen) Lambda und dem Bakterium E. coli, dient seit langem als Paradigma für die Determination des Zellschicksals1,2. Nach der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops der Sulfatverteilung in E. coli in Echtzeit nach einer Infektion mit dem Phagen Lambda zu folgen. Erstellen Sie zunächst ein grobes Lysat des Phagen Lambda. Anschließend reinigen Sie den Phagen und infizieren E. coli im Reagenzglas mit dem Phagen Lambda.Verfolgen Sie weiterhin das Schicksal der Bakterienzellen unter dem Mikroskop. Letztendlich können die Ergebnisse in Echtzeit unterschiedliche Zellschicksale in E. coli zeigen, basierend auf der Expression verschiedener fluoreszierender Proteine, die mit Zellwachstum oder Zelltod assoziiert sind. Eine wichtige Überprüfung dieses Verfahrens liegt in der Herstellung einer gereinigten Front und einer markierten FI-Stammlösung.Um eine Teilung der Fige während der Vorbereitung und Reinigung zu vermeiden, optimieren Sie auch die Bildgebungsparameter am Mikroskop, um ein gesundes Zellwachstum zu ermöglichen. Inokulieren Sie eine Übernachtkultur von E 3 92 Lambda LZ one PPL star D in LBM-Medien bei einer Zelldichte von OD 600 von etwa 0,6 und induzieren Sie die Lygen in einem Wasserbadrührer bei 42 Grad Celsius.Weiter bei 37 Grad Celsius inkubieren, bis eine Lyse erkennbar ist. Die Kultur wird klar. Nun 2 % Chloroform hinzufügen und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Überführen Sie anschließend das Phagenlysat in 250-Milliliter-Flaschen und zentrifugieren Sie die Kultur. Gewinnen Sie dann den Überstand, der die Phagenpartikel enthält, und führen Sie eine zweite Zentrifugation durch, um sichtbare Rückstände gemäß standardmäßigen Phagentitrationsprotokollen zu entfernen. Bestimmen Sie die Phagenkonzentration, reinigen Sie die Phagen anschließend über einen Cäsiumchlorid-Gradienten und prüfen Sie die Aktivität mittels DPI zur Herstellung von Aro-Platten.Reinigen Sie sechs Objektträger mit 70 % Ethanol. Ordnen Sie fünf Objektträger wie gezeigt an und sichern Sie sie mit Klebeband. Gießen Sie nun eine Lösung von 1,5 % Aros in Medium auf die befestigten Objektträger.Platzieren Sie die letzte Objektträgerplatte oben darauf und vermeiden Sie sorgfältig Luftblasen. Legen Sie ein Gewicht darauf und lassen Sie das AROS etwa 30 Minuten abkühlen. Entfernen Sie die vier seitlichen Objektträgerplatten und verpacken Sie den Objektträgerblock mit Frischhaltefolie.Unter Verwendung einer Übernachtkultur transformierter Bakterien als Inokulum eine Kultur in LBMM ansetzen, einen Milliliter Bakterien pelletieren und resuspendieren. Die Zellen in 20 Mikroliter eiskaltem LBMM mit einer breiten Pipettenspitze suspendieren.Fügen Sie 20 Mikroliter gereinigten Phagen hinzu. Vorsichtig mischen und zunächst 30 Minuten auf Eis inkubieren, um die Phagenabsorption zu ermöglichen. Anschließend fünf Minuten im Wasserbad bei 35 Grad Celsius. Um die Phagen-DNA-Injektion auszulösen, lösen Sie zelluläre Aggregate durch Mischen auf. Verdünnen Sie die Mischung im Verhältnis 1:10 in LBMM. Stellen Sie nun eine LBM-Agroschale bereit.Auf einen Deckgläser geben Sie einen Mikroliter der Phagen-Zell-Mischung. Sobald diese absorbiert ist, platzieren Sie vorsichtig einen weiteren Deckgläser darauf. Beginnen Sie mit der Aufnahme eines Bildsatzes über den YFP-Kanal für den ersten Zeitrahmen.Nehmen Sie eine Serie von 15 Bildern in 200 Nanometer Z-Achsen-Intervallen auf. Zusätzlich nehmen Sie ein einzelnes scharfes Bild durch die Phasenkontrast- und mCherry-Kanäle auf. Anschließend erfassen Sie einen Zeitrafferfilm des Zellverhaltens nach der Infektion.Um die Ausbleichung und Phototoxizität während der Zeitrafferaufnahme zu minimieren, verwenden Sie pro Zeitpunkt ein einzelnes Z-Positionsbild pro Kanal und nehmen Sie die Probe in den Phasenkontrast-, YFP- und mCherry-Kanälen in Zeitintervallen von 10 Minuten über einen Zeitraum von etwa vier Stunden auf. Beginnen Sie die Analyse der Bilder mit einer manuellen Zählung der Phagen und notieren Sie außerdem die Phagenlokalisation sowie die Zelllänge. Vermerken Sie im initialen Zeitraum die Zellschicksale lytisch, lysogen oder nicht infiziert.Dokumentieren Sie außerdem die Lysezeit und alle weiteren gewünschten Informationen, indem Sie den Zeitrafferfilm abspielen, und gewinnen Sie weitere quantitative Daten, wie beispielsweise den Fluoreszenzpegel über die Zeit in einzelnen Zellen, mithilfe automatisierter Algorithmen zur Zellerkennung und Linienverfolgung. Typischerweise sind die Plaques der fluoreszenzmarkierten Phagen deutlich kleiner als die des Wildtyps, und die YFP- und DAPI-Signale eines erfolgreich gereinigten Phagen colokalisieren. Diese Daten kombinieren Bildserien aus den Phasenkontrast-, YFP- und mCherry-Kanälen sowie die entsprechenden überlagerten Bilder aus einem Zeitrafferfilm.Die einzelnen Phagen sind im Anfangszeitraum deutlich sichtbar. Hier sieht man zwei Zellen, von denen jede von einem einzelnen Phagen infiziert ist, und eine Zelle, die von drei Phagen infiziert ist. Typischerweise befinden sich mehrere Phagen auf der Zelloberfläche, während andere Phagen nicht adsorbiert sind.Im Laufe der Zeit wird das Infektionsergebnis unterscheidbar. 80 Minuten später haben sich die beiden Zellen, die jeweils durch einzelne Phagen infiziert wurden, in den lytischen Weg begeben. Bei intrazellulärer Produktion neuer Phagen hat die durch drei Phagen infizierte Zelle den lysogenen Weg eingeschlagen, gekennzeichnet durch die Produktion von mCherry aus dem Prä-Motor.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine gereinigte Phagenstammlösung herstellt, um E. coli-Bakterien mit dem Phagen Lambda zu infizieren, und wie man die Lebensweise in Echtzeit unter dem Mikroskop bildlich darstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

Wir beschreiben eine Methode, um die Genexpression in einer wachsenden Population von E. coli-Zellen unter Verwendung sequenzgesteuerter sRNA-Expressionskassetten zu unterbinden, die von einem M13-Phagemid-Vektor abgegeben werden.

Phage-vermittelte Lieferung von Targeted sRNA Konstruiert Down-Gene nach Knock Expression in<em&gt; E. coli</em

Eine neue Generation von zellfreien Transkription-Übersetzung Plattformen wurde entwickelt, um die biochemischen Systemen in Vitro durch die Ausführung des Gens Schaltungen aufbauen. In diesem Artikel beschreiben wir, wie aus ihrem Genom mit einem alle E. Coli zellfreie TXTL System Bakteriophagen MS2, ΦΧ174 und T7, synthetisiert werden.

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Nach Cell-Schicksal

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