Name: Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Optogenetik-Methode zur präzisen Steuerung adultgeborener Neuronen in Hirnschnitten mittels LED-Arrays. Diese Technik ermöglicht lichtbasierte Aktivitätskontrolle für Studien zur adulten Neurogenese.

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Diese Arbeit wurde von der Versicherungsgesellschaft &quot;AG2R-La-Mondiale&quot;, Ecole des Neurosciences de Paris (ENP), die Agence Nationale de la Recherche &quot;ANR-09-neur-004&quot; im Rahmen des &quot;ERA-NET NEURON unterstützt &quot;des RP7-Programm von der Europäischen Kommission und der Pasteur-Stiftung. Sebastien Wagner wurde von den Letten Foundation unterstützt.

1. Optical Calibration: Mess-LED Power <ol><li> Bringen Sie ein LED-Array in einen Kühlkörper aktiv durch einen Lüfter aus und bringen diese LED / Kühlkörper aparatus eine Kollimationslinse gekühlt. </li><li> Ersetzen Sie die Lampe in Hellfeld-Beleuchtung mit LED / Kühlkörper / Lüfter / Linsenapparat verwendet. Dieses Gerät muss sorgfältig positioniert werden, so dass die gebündelte LED-Strahl entlang einer geraden optischen Weg der Kondensorlinse Reisen. Sicherstellen, dass die Kühlkörper / Lüfter korrekt an das System der gemeinsamen geerdet. </li><li> Fahren Sie die LED-Array mit einer Stromversorgung, die schnell und Platz Stromimpulse geben kann. Dieses Netzteil kann durch eine 5V TTL-Puls aus einem Impulsgeber gesteuert werden. </li><li> Zentrum der gebündelten Strahl entlang der Lichtweg zwischen der Leuchtfeldblende und die Kondensorlinse definiert. Im Idealfall wird der LED-Strahl leicht überfüllen vollständig geöffnet Feldblende. Typischerweise wird ein enger kollimiert LED Balken füllen diese Öffnung weniger, und wird mor produzierene Macht auf Kosten der Einheitlichkeit. In unserer Einrichtung haben wir mehr Licht Einheitlichkeit, indem Sie eine Sammellinse, dass eine leicht erweiterte Bild des LED-Arrays an seinem konjugierten Ebene an der consenser Membran projiziert. </li><li> Erzielen Kohler Beleuchtung durch die Fokussierung des Kondensators, so dass das Bild der Leuchtfeldblende (das Zwerchfell am nächsten an der Lichtquelle) auf der Scheibe Kammer (Abb. 1) ausgerichtet ist. Eine dünne Gewebe der Linse Papier kann als Projektionsfläche zu handeln, um das fokussierte Bild der Leuchtfeldblende in anderen Tiefen zu visualisieren. </li><li> Drill einer Reihe von Nadelstichen von bekanntem Durchmesser in einem undurchsichtigen Material. Legen Sie eine dieser kleinen Nadelstiche über den Sensor einer optischen Leistung Meter. Setzen Sie den Leistungsmesser auf dem Objekttisch und Zentrum der Macht Meter über dem scharfes Bild der Leuchtfeldblende durch einfaches Verschieben Sie das Power Meter, bis es ein Maximum Lesen gibt. Bringen Sie den Leistungsmesser in dieser Position. </li><li> Vollständig geöffnet Öffnungen (aperature Membran undLeuchtfeldblende). Systematisch bewegen Sie den beigefügten Scheibe Kammer / Leistungsmesser relativ zur optischen Lichtweg und berechnen Sie die Einheitlichkeit der optischen Leistung innerhalb der ausgeleuchteten Fläche. Erstellen Sie die Einheitlichkeit Grundstück für Ihr System. Wenn das Mikroskop richtig Setup mit Kohler-Beleuchtung an der Zielsetzung der Fokus zentriert, sollten maximale Leistung direkt unter das Ziel sein, und Regionen außerhalb dieser Schwerpunkt sollte nun eine bekannte Menge an Energie entsprechend der Einheitlichkeit Grundstück. </li><li> Für jede Größe Lochkamera bauen eine Standardkurve der optischen Leistung vs Pinhole Oberfläche. Durch die Anpassung der Eingangsstrom auf das LED-Array, produzieren diese Kurve mit mehreren Leistungsstufen und aus jeder Kurve berechnen die Leistung pro mm2. Wenn die LED-Array ist für das Patchen Optik verwendet werden, stellen Sie sicher, um optische Elemente, die für das Patchen (Kondensatoren, Pinholes und Filter) einzuführen, zu wissen, wie viel Licht unter das Patchen Beleuchtung übertragen wird. </li><li> Das Umlegen des LeistungsmesserGesicht dem Ziel, die Berechnung der Beleuchtungsstärke bei 470nm, wenn das Quecksilber Lampe eingeschaltet ist. </li><li> Fügen Sie eine Live-Scheibe in die Kammer, und erstellen Sie Standard-Kurven, um die Lichtleistung durch die Streuung Hirngewebe übertragen zu bestimmen. </li></ol> 2. Slicing Verfahren und Elektrophysiologie Teil A: Slice Vorbereitung <ol><li> Anesthetize (60 mg / kg Ketamin und Xylazin 2mg/kg) und köpfen die Maus. Dissect des Gehirns in künstlichen Rückenmarksflüssigkeit (ACSF, in mM: 124 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgSO 4, 26 NaHCO 3, 1,25 NaHPO 4, 20 Glucose, 2 CaCl 2; ~ 310mOsm, pH 7,4, wenn mit einer Mischung aus sprudelte 95% O2 und 5% CO 2 5,1), dabei nicht auf die Riechkolben Schäden. Trennen Sie die beiden Hemisphären und Ort auf Agar mit dem ventralen Oberfläche auch mit einer Kante (für horizontale Abschnitte). </li><li> Kleben Sie die Agar und dorsale Oberfläche jeder kortikalen Hemisphäre auf die Vibrationatome Futter, und langsam füllt die Badewanne mit eiskaltem ACSF. Scheiben aus Ventralfläche in 300 um Abschnitte, die Übertragung jeden Abschnitt zu warm (34-36 ° C) und Sauerstoff ACSF, so dass sie für 30-45 Minuten zu erholen. </li></ol> Teil B: Loose-Patch Messung der Schwelle zu Spike <ol start="3"><li> Nach bringen die Scheiben auf Raumtemperatur für 30 Minuten, sanft statt einer Scheibe in die Aufnahme Kammer des Mikroskops Kammer unter konstanter Perfusion von mit Sauerstoff angereichertem ACSF. Bei Gefahr von übermäßig stimulierenden ChR2 infizierten Neuronen, kann das Vorhandensein von EYFP-ChR2 unter Epifluoreszenz (Abb. 2a) bestätigt werden </li><li> Pull-Glaselektroden auf einer Pipette Abzieher (Sutter P-97). Füllen Sie diese Elektrode mit ACSF. Wenn in der ACSF Bad platziert die Spitze Widerstand sollte zwischen 7-10 MOhm sein. </li><li> Unter fluoreszierende Beleuchtung, in die Scheibe ein gesundes ChR2-EYFP Neuron mit reifen Morphologie zu finden. Auch finden dieses Neurons Soma unter Patchen Optik. </li><li> Mit leichten Überdruck durch die Spitze der Elektrode weitergegeben, senken Sie die Patch-Elektrode in Richtung der identifizierten fluoreszierende Nervenzelle. Als Membran Kontakt hergestellt ist, schnell Freisetzung positiver Druck und geben Sie eine kleine und kurze Betrag von Saug-durch die Spitze. Ein Giga-Ohm-Siegel sollte zwischen der Plasmamembran und die Wände der Patch-Elektrode vorgenommen werden. </li><li> Selbst wenn ein Giga-Seal ist nicht gebildet, wenn die Elektrode ist ausreichend, um ein fluoreszierendes Neuron spiking Aktivität in der Nähe eine messbare lokale Feld Potenzial produzieren sollte. Aktivieren ChR2 in diesem Neuron durch Blinken verschiedenen Dosierungen von Licht. Da Licht-Dosis ist eine Funktion der beiden LED-Leistung und die Dauer berechnen, wie viel Licht notwendig, um ein Aktionspotential an mehreren Kräften und der Dauer (Abb. 2b) hervorrufen wird. Beachten Sie auch, wie viel spiking tritt unter Quecksilberlampe Beleuchtung. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse: Auf unserem Mikroskop (Olympus BX51WI), ist unser LED in line mit 2 Öffnungen und eine Kondensorlinse, so bleibt das ursprüngliche Lichtweg des werkseitig installierten Bogenlampe. Durch die Schließung sowohl der Leuchtfeldblende und die aperature Zwerchfell, erreichen wir Hellfeld Gegensatz ausreichend für Patch Clamp Messungen (Abb. 1b). Bei allen Membranen vollständig öffnen wir setzen die Scheibe, um maximale Lichtleistung für Channelrhodopsin Aktivierung (Abb. 1a). Auf unserem Mikroskop, produziert dieses Patchen Konfiguration Licht-Dichte, die etwa drei Größenordnungen niedriger als die maximale volle Felddichte (4,1 mW / mm 2 versus 6,88 mW / mm 2) ist. Wir sehen robust Kennzeichnung von Erwachsenen geboren Riechkolben Granulat-und periglomerular Neuronen Wochen nach lentiviralen Infektion der Migration Neuroblasten im rostralen wandernde Bach (Abb. 2a) Eine lose-patch-Aufnahme von einem Erwachsenen geboren ChR2-EYFP Ausdruck Körnerzelle zeigt an, dass ein 5 ms Stimulation Maximeum Macht (6,88 mW / mm 2) ist ausreichend, um hervorzurufen spiking (Abb. 2b). Seit Ausdruck variiert zwischen den Zellen, wird die Menge an Licht, dass die Schwelle geht auf Spike variieren und sollte statistisch für jeden Zelltyp des Interesses beschrieben werden. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. LED-Array-Setup für Full-Field Photostimulation und Patch-Clamp-Elektrophysiologie Scheibe. So aktivieren Sie Channelrhodopsin (ChR2) projizieren wir einen gebündelten Strahl durch offene Rückseite Öffnungen und Kondensoroptik (a). Diese Konfiguration kann in hohem Kontrast Patchen Optik durch die vollständige Schließen der Leuchtfeldblende und die Modulation der Breite des Feldes Membran (b) geändert werden. Abkürzungen: a. Lüfter, b. Kühlkörper, c. LED-Array, d. Kollimationslinse, e. Spiegel, f. Feldblende, g. Aperturblende, h. Kondensorlinse, i. sample Bühne, j. Ziel. <img src="/files/ftp_upload/3379/3379fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Das Bild einer 300 pm horizontale Scheibe Riechkolben für Patch-Clamp-und Ganzfeld-Photostimulation (a). Lentivirally infizierten Erwachsenen geboren Körnerzellen Ausdruck ChR2-EYFP sehen strahlenförmig von der Kern der Riechkolben werden. Die Licht-Dosis erforderlich zu evozieren spiking kann durch Erhöhung der Dauer der LED-Blitz (b) gefunden werden. Der Schwellenwert für diese Körnerzelle war Voll-LED-Intensität (2.43mW/mm 2) 5ms. Maßstab in (a) = 500 um, Maßstab in (b) = 50ms.

<ol><li>Nissant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+promotes+synaptic+plasticity+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis promotes synaptic plasticity in the olfactory bulb.</a> Nature Neuroscience. 12, 728-730 (2009).</li>
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<li>Dhawale, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-redundant+odor+coding+by+sister+mitral+cells+revealed+by+light+addressable+glomeruli+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Non-redundant odor coding by sister mitral cells revealed by light addressable glomeruli in the mouse.</a> Nature neuroscience. 13, 1404-1412 (2010).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In den letzten Jahren haben zu einer Explosion in der Popularität von optogenetische Werkzeuge für die neurowissenschaftliche Forschung 6 zu sehen. Als Ergebnis wird es immer wichtiger, um die Hürde für Labors wollen beginnen mit diesen neuen Instrumenten zu senken. Hier beschreiben wir, wie eine einfache und kostengünstige Nachrüstung und Kalibrierung eines herkömmlichen Patch-Clamp-rig durchzuführen, so dass es Full-Field-optische Stimulation Channelrhodopsin-exprimierenden Neuronen tun können. Insbesondere...

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Imalg&amp;#232;ne 1000</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Rompun</td><td></td><td>2%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>&amp;amp;nbps;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>P-97</td></tr><tr><td>Glas-Kapillaren</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150T-10</td><td>1,5 mm Außendurchmesser/1,17 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>LED-Anordnung</td><td>Bridgelux</td><td>BXRA-C2000</td><td></td></tr><tr><td>Kollimationslinse</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDC1</td><td>40 mm Strahldurchmesser</td></tr><tr><td>Netzteil</td><td>A1W Electronik</td><td>HKO2800</td><td>2,8 Ampere</td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PM 100</td><td></td></tr><tr><td>Kühlkörper</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Lüfter</td><td>Thermaltake</td><td>A1838</td><td>Silent Boost K8</td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

mit affordable led arrays für photo-stimulation von neuronen

Using Affordable LED Arrays for Photo-Stimulation of Neurons

Standard-Scheibe Elektrophysiologie konnten die Forscher einzelnen Komponenten des neuronalen Schaltkreisen durch die Aufnahme elektrischen Reaktionen der einzelnen Zellen in Reaktion auf elektrische oder pharmakologische Manipulationen 1,2 Sonde. Mit der Erfindung von Methoden zur optischen Kontrolle genetisch gezielt Neuronen (Optogenetik), Forscher haben nun ein beispielloses Maß an Kontrolle über bestimmte Gruppen von Neuronen in der Standard-Scheibe Vorbereitung. Insbesondere erlaubt lichtempfindliche Channelrhodopsin-2 (ChR2) Forscher Neuronen mit Licht 3,4 aktivieren. Durch die Kombination sorgfältige Kalibrierung des LED-basierte Photostimulation von ChR2 mit Standard-Scheibe Elektrophysiologie, sind wir in der Lage, mit mehr Details Sonde die Rolle der Erwachsenen-geboren Interneuronen im Riechkolben, die erste zentrale Relais des olfaktorischen Systems. Mit viralen Ausdruck ChR2-YFP speziell im Erwachsenenalter geboren Neuronen, können wir selektiv steuern, junge Erwachsene geboren Neuronen in einem Milieu älter eind reifen Neuronen. Unsere optische Kontrolle benutzt eine einfache und kostengünstige LED-System, und wir zeigen, wie dieses System kalibriert werden, um zu verstehen, wie viel Licht benötigt wird, zu evozieren spiking Aktivität in einzelnen Neuronen werden. Somit können kurze Blitze aus blauem Licht fernsteuern das Feuern Muster von ChR2-transduzierten neugeborenen Zellen.

Adult-geboren Neuronen exprimiert ChR2 kann in Scheiben elektrophysiologischen Vorbereitungen manipuliert werden, um ihren Beitrag zur Funktion des olfaktorischen neuronale Schaltkreise zu untersuchen.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

Die Standard-Schnitt-Elektrophysiologie hat es Forschern ermöglicht, einzelne Komponenten neuronaler Schaltkreise zu untersuchen, indem die elektrischen Antworten einzelner ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, LED-Anordnungen vorzubereiten und fernzusteuern, um die neuronale Aktivität in Gehirnschnitten zu steuern. Dies wird mithilfe von in vitro Schnitten von Tieren erreicht, deren Neuronen den Kanal REDSIN zwei exprimieren, sowie durch den Einsatz einer LED-Anordnung in Kombination mit einem Mikroskop, um diese Neuronen zu aktivieren. In diesem Video wird erläutert, wie man eine LED und ein Mikroskop kalibriert, um bekannte Lichtintensitäten in die Schnittkammer zu liefern.Mit diesem Aufbau können die Aktivierungsschwellen von Neuronen, die Kanal zwei exprimieren, präzise gemessen werden, indem Neuronen, die Kanal-Opsin zwei exprimieren, über eine Breitfeldstimulation mit Licht stimuliert werden. Diese Technik ermöglicht eine zeitlich präzise optische Steuerung einer großen neuronalen Population. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden optogenetischen Methoden, einschließlich solcher, die Laser oder Shutter-basierte Methoden verwenden, liegt darin, dass sie sehr kostengünstig ist und problemlos an ein vorhandenes Patch-Clamp-Mikroskop angepasst werden kann.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen auf dem Gebiet der adulten Neurogenese beantworten, beispielsweise, wie Aktivität die Integration neuer Neuronen in das erwachsene Gehirn beeinflusst. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis hin zu Therapien oder Diagnosen, die auf adulten neuronalen Stammzellen basieren, da sie eine präzise zeitliche Kontrolle über die Aktivität neu gebildeter Neuronen ermöglicht, die sich in bestehende neuronale Schaltkreise einfügen. Obwohl diese Methode Einblicke in die funktionellen Konsequenzen der adulten Neurogenese bietet, kann sie ebenfalls an jeder in-vitro-Präparation durchgeführt werden.Enthaltende Kanaladoption exprimierende Neuronen Beginnen Sie mit der Auswahl eines LED-Arrays, das seine maximale Leistung bei der gewünschten Wellenlänge erzeugt. Wählen Sie außerdem ein Array mit einer maximalen Strombelastbarkeit. Integrieren Sie das LED-Array in das Mikroskop.Befestigen Sie zunächst den LED-Array mithilfe von Wärmeleitpaste an einem Lüfter, der als Kühlkörper bezeichnet wird, um die Wirksamkeit des Kühlkörpers zu erhöhen. Entfernen Sie dann die ursprüngliche LED mit geringer Leistung aus ihrer Linsenhalterung und befestigen Sie die leistungsstärkere LED an der Linse. Ersetzen Sie nun die Hellfeldlampe durch die zusammengesetzte LED-Vorrichtung und stellen Sie sicher, dass der Lüfter ordnungsgemäß mit dem gemeinsamen Erdungspunkt des Systems verbunden ist.Sorgfältige Positionierung der LED-Anordnungen ist erforderlich, um sicherzustellen, dass das emittierte Licht auf der optischen Achse des Objektivs liegt. Ziel ist es, die Köhler-Beleuchtung einzustellen, indem der Kondensor so fokussiert wird, dass das Bild der Feldblende scharf auf der Schnittkammer liegt und unter der optischen Achse des Objektivs zentriert ist. Ein dünnes Stück Linsenpapier kann helfen, das Bild der rückwärtigen Blende in anderen Tiefen zu fokussieren.Bohren Sie nun Pinholes mit bekannten Durchmessern in ein undurchsichtiges Material, das als Blende für das Leistungsmessgerät dienen kann. Platzieren Sie eines dieser kleinen Pinholes über dem Sensor des optischen Leistungsmessgeräts. Befestigen Sie danach das Leistungsmessgerät am Mikroskop, um den Kondensor auf das Pinhole zu fokussieren.Positionieren Sie das Leistungsmessgerät manuell, bis es eine maximale Anzeige liefert. Befestigen Sie das Leistungsmessgerät in dieser Position. Wenn das Maximum des Leistungsmessgeräts über der Ebene des Schnitts liegt, stellen Sie die Köhler-Beleuchtung in dieser Ebene erneut ein.Öffnen Sie anschließend alle Blenden vollständig. Bewegen Sie das Leistungsmessgerät systematisch relativ zum optischen Lichtweg mithilfe der Bühnenmanipulatoren. Messen Sie danach die Gleichförmigkeit der optischen Leistung innerhalb des beleuchteten Bereichs, indem Sie systematisch Leistungsabnahmen in einem Raster um die maximale Leistung herum vornehmen, die sich unter dem Fokus des Objektivs befinden sollte. Das Mikroskop ist korrekt eingerichtet, wenn die kühlere Beleuchtung im Fokus des Objektivs zentriert ist; die maximale Leistung des Arrays sollte sich in diesem Fokus befinden. Bereiche außerhalb des Fokus sollten nun gemäß dem Gleichförmigkeitsdiagramm eine bekannte Leistung erhalten.Messen Sie nun die maximale Leistung für jede Lochblendenöffnung unter Kenntnis des zur Herstellung jeder Lochblende verwendeten Bohrerdurchmessers und tragen Sie die optische Leistung in Abhängigkeit von der Fläche der Lochblende auf. Da die gebohrten Lochblenden nicht perfekt sind, liefert die Mittelung dieser Werte eine gute Schätzung der optischen Leistungsdichte. Das LED-Array wird für die Patch-Optik verwendet werden.Beachten Sie beim Erstellen des Leistungsprofils und des Uniformitätsprofils alle optischen Elemente, die für das Patchen erforderlich sind. Viele Mikroskope verfügen beispielsweise über einen umklappbaren Diffusorschirm, der zwar die Leistung verringert, jedoch die Uniformität verbessert. Bereiten Sie Gehirnschnittpräparate mit Standardmethoden vor und stellen Sie während der 30 bis 45-minütigen Erholungsphase der Schnitte in erwärmtem ACSF die Patch-Pipetten her.Nachdem sich die Gewebe erholt haben, eine Schnitte vorsichtig in die Aufnahmekammer des Mikroskops unter kontinuierlicher Spülung mit oxygeniertem ACSF geben. Die Präsenz des EYFP-Kanals Redsin in zwei Kanälen mittels Epifluoreszenz unter fluoreszierender Beleuchtung bestätigen. In der Schnitte einen gesunden Kanal-zwei-EYFP-Neuronen mit ausgereifter Morphologie lokalisieren.Danach lokalisieren Sie den Neuronensoma unter den Patch-Optiken und erzeugen eine Gigaohm-Dichtung zwischen der Plasmamembran und den Wänden der Patch-Elektrode. Wenn die Elektrode ausreichend nahe an einem aktiven Neuron positioniert ist, sollte die spontane Aktivität bereits ohne Gigaohm-Dichtung ein messbares lokales Feldpotential erzeugen. Aktivieren Sie nun Channelrhodopsin-2 in diesem Neuron durch Lichtblitze unterschiedlicher Dosis, da die Lichtdosis sowohl von der LED-Leistung als auch von der Dauer abhängt. Berechnen Sie, wie viel Licht notwendig ist, um bei mehreren Leistungsstufen und Belichtungszeiten ein Aktionspotential auszulösen.Ein Olympus BX 51 WI-Mikroskop wurde mit einer LED, die in Reihe mit zwei Blenden und einer Kondensorlinse angeordnet war, konfiguriert. Um ausreichenden Hellfeld-Kontrast für die Patch-Clamp-Aufzeichnung zu erzielen, wurden sowohl die Feldblende als auch die Objektivblende geschlossen. Ein Gleichmäßigkeitsdiagramm der LED-Lichtintensität wurde in einem Bereich um das durch den gepunkteten Kreis angezeigte Sichtfeld des Objektivs erstellt.Bei vollständig geöffneten Blenden wurden die Schneidgeräte einer maximalen Lichtleistung für die Aktivierung des Channelrhodopsins ausgesetzt. Diese Konfiguration erzeugt Licht, das um drei Größenordnungen intensiver ist als die Konfiguration, die für die Visualisierung mittels Patch-Clamp verwendet wird. Vier Wochen nach der lentiviralen Infektion migrierender Neuroblasten im rostralen migratorischen Strom wurden eine breite Markierung erwachsenengeborener granulärer Zellen und periglomerulärer Neuronen im Riechkolben beobachtet.Loose-Patch-Aufnahmen von einem einzelnen, zwei EYFP exprimierenden Granulazellen-Kanal zeigten, dass für dieses Neuron eine fünfmillisekündige Stimulation mit maximaler Leistung ausreichte, um Aktionspotentiale auszulösen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie an einem Nachmittag durchgeführt werden. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass nach diesem Verfahren stets die Geräte und Einstellungen auf zeitliche Drifts überwacht werden müssen. Seit ihrer Entwicklung haben solche optogenetischen Techniken der Forschung im Bereich der Neurowissenschaften den Weg geebnet, synaptische Übertragung und Integration in einer Reihe von Modellorganismen wie Wurm, Fliege, Maus und sogar Primaten zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Adult-geboren Neuronen des Bulbus kann optogenetically gesteuert werden mit Channelrhodopsin2-exprimierenden lentiviralen Injektion in den rostralen wandernde Bach und chronischen Photostimulation mit einem implantierten Mini-LED.

Selektive Viral Transduktion von Adult-geboren olfaktorischen Neuronen für chronische In vivo Optogenetische Stimulation

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Analyse der synaptischen Konnektivität zwischen dem medialen präfrontalen Kortex (mPFC) und Amygdala-Neuronen anhand von akuten Amygdala-Hirnschnitten von Mäusen. Die mPFC-Neuronen in diesen Mäusen exprimieren Channelrhodopsin, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. Die Kanalrhodopsine erleichtern den Ioneneinstrom und die Generierung von Aktionspotentialen in den mPFC-Neuronen nach Lichtaktivierung. Folglich setzen mPFC-Neuronen...

Visualisierung und Kartierung neuronaler Signalwege in einem Amygdala-Hirnschnitt

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Hier beschreiben wir unsere Strategie, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen in der anästhesierten Mausrinde zu erhalten. Neuronen, die ChR2 exprimieren, werden durch ihre Reaktion auf blaues Licht identifiziert. Die Methode verwendet standardmäßige extrazelluläre Aufzeichnungsgeräte und dient als kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder visuell gesteuerten Pflasterung.

Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Es wird ein Verfahren zur Stimulation der elektrischen Aktivität von in-vitro-Zellkulturen mit sichtbarem Licht beschrieben, das auf der Verwendung organischer halbleitender Polymere basiert.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

Dieses Protokoll beschreibt, wie optogenetische Experimente zur Kontrolle der Genexpression mit rotem und tiefrotem Licht unter Verwendung von PhyB und PIF3 durchgeführt werden können. Enthalten sind Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Aufbau eines einfachen und flexiblen Beleuchtungssystems, das die Steuerung der Genexpression oder anderer Optogenetik mit einem Computer ermöglicht.

Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente

Hier stellen wir das Herstellungsverfahren eines Optrode-Systems mit optischen Fasern für die Lichtabgabe und einem Elektrodenarray für die neuronale Aufzeichnung vor. In-vivo-Experimente mit transgenen Mäusen, die Kanalrhodopsin-2 exprimieren, zeigen die Machbarkeit des Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung.

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

Jüngste Entwicklungen in der Schmerzforschung unterstreichen das Potenzial der Photoneuromodulation mit grünen Leuchtdioden (GLED) als nicht-pharmakologische Behandlung. GLED moduliert die Schmerzwege und bietet eine wirksame Schmerzlinderung. Dieser Artikel zielt darauf ab, GLED-Expositionsprotokolle zu standardisieren und zu verfeinern, die Konsistenz zwischen den Studien zu verbessern und die klinische Anwendung dieser Therapie voranzutreiben.

Optimierung von Photoneuromodulationstechniken zur Bewertung der Rolle von grünen Leuchtdioden in der Schmerztherapie

Lernen Sie eine kostengünstige Optogenetik-Methode zur präzisen Steuerung adultgeborener Neuronen in Hirnschnitten mittels LED-Arrays. Diese Technik ermöglicht lichtbasierte Aktivitätskontrolle für Studien zur adulten Neurogenese.

Mit Affordable LED Arrays für Photo-Stimulation von Neuronen

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