Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, transretinale Elektroretinogramm-Aufzeichnungen von isolierter intakter Mausnetzhaut durchzuführen, um stäbchen- und zapfengetriebene Photoantworten zu erhalten. Erste Glaskapillaren und eine Perfusionskammer werden für die Aufnahmen vorbereitet. Beide Augenmuscheln von dunkel adaptierten Mäusen sind hemis-betroffen.

Unter Infrarotbeleuchtung werden Hornhaut, Linse und Glaskörper entfernt. Die Netzhaut wird vom Pigmentepithel abgezogen und auf die Photorezeptorseite des Filterpapiers gelegt. Die Netzhaut auf dem Filterpapier wird in die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch überführt und zwischen zwei Elektroden platziert, die mit dem Kopftisch eines Differenzverstärkers verbunden sind.

Schließlich werden Stäbchen- und Zapfen-vermittelte Photoantworten von der flach montierten Mausnetzhaut aufgezeichnet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie klassischen Einzelzellaufzeichnungen besteht darin, dass sie medikamentenzugängliche Langzeitaufzeichnungen von Stäbchen- und Fettrezeptoren aus Klappen- und genetisch veränderten Mäusen ermöglicht. Es wird besonders nützlich, um eine stabile, fettere Reaktion der seltenen und zerbrechlichen Maus zu erhalten.

Nachteile Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Glaskapillaren. Stelle 10 Milliliter 1,2%Agar in einem heißen Wasserbad her. Füllen Sie die Glaskapillaren mit der Agarlösung mit einer Plastikspritze, wo sich der Agar schnell verfestigt.

Schneide die Kapillaren mit einem Diamantmesser in zwei Hälften. Weichen Sie die resultierenden Glaselektroden mindestens 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Mauselektrodenlösung ein. Bereiten Sie nun das Mikroskop generell vor, um mechanisches und elektromagnetisches Rauschen zu minimieren.

Montieren Sie das Mikroskop auf einem Antivibrationstisch und schirmen Sie es in einem Faradayschen Käfig ab. Diese Funktionen sind jedoch nicht unbedingt erforderlich. Kalibrieren Sie die Lichtquelle mit einem Photometer, das in der Ebene der Netzhaut platziert ist.

Verwenden Sie bei einer LED-Lichtquelle einen optischen Diffusor, um eine gleichmäßige Lichtverhältnisse mit Kunststoffschläuchen und einer Glaskapillare zu erreichen. Stellen Sie eine Verbindung zwischen der unteren Elektrode und dem Elektrodenhalter her. Füllen Sie dann den unteren Elektrodenraum der Perfusionskammer mit Elektrodenlösung.

Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in der Elektrode, dem Verbindungsschlauch oder dem Elektrodenhalter befinden. Entfernen Sie alle Blasen, indem Sie die Lösung mit einer Spritze reinigen. Nachdem Sie die Aufnahmekammer unter das Mikroskop gelegt haben, verbinden Sie den unteren Elektrodenhalter mit dem Pluspol des Kopftisches des Differenzverstärkers.

Zentrieren und richten Sie dann die untere Elektrodenöffnung der Kammer mit der Stimulus-Lichtpunktblase aus, der bikarbonatgepufferten Perfusionslösung mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid, während Sie sie in einem 40 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubieren. Der pH-Wert der Lösung beträgt 7,2. Verbinden Sie die Perfusionsleitung mit der Aufnahmekammer und schalten Sie die Perfusion ein.

Die Lösung fließt durch die Schwerkraft von der Flasche in die Aufnahmekammer. Durch einen Keramikwiderstand hindurch wird er wieder auf 36 oder 37 Grad Celsius erhitzt. Um den Wärmeverlust zu reduzieren, sollte die Heizung so nah wie möglich an der Aufnahmekammer aufgestellt werden.

Stellen Sie idealerweise auf dem Tisch des Mikroskops einen Durchflussregler in den Lösungsweg ein und stellen Sie ihn auf etwa einen Milliliter pro Minute ein. Verbinden Sie nun die obere Elektrode mit einem Elektrodenhalter mit einem O-Ring mit dem zweiten Minuspol des Kopftisches und binden Sie die Thermoelementsonde mit ihren Spitzen so nah wie möglich an diese Elektrode, so dass die Temperaturmessung in der Nähe der Mitte der Netzhaut erfolgt. Tauchen Sie dann die Spitze der oberen Elektrode in die Perfusionslösung und platzieren Sie sie in der Mitte der Kammer.

Warten Sie 10 bis 15 Minuten für die Stabilisierung der Ausgangswerte. Stellen Sie abschließend die Gleichspannung für die Heizung so ein, dass die Temperatur der Lösung 36 bis 37 Grad Celsius beträgt. Bereiten Sie die Maus bei Dunkelheit vor und passen Sie sie über Nacht an.

Verwenden Sie Wildtyp-Mäuse wie C 57 black six für stäbchengetriebene trans-retinale Aufzeichnungen oder stäbchentransduzierende Alpha-Knockout-Mäuse, denen die Stäbchensignalisierung für kone-trans-retinale Aufzeichnungen fehlt. Bevor Sie im Dunkeln arbeiten, bereiten Sie ein Stück quadratisches Filterpapier vor, indem Sie in der Mitte ein zwei bis 2,5 Millimeter großes Loch bohren und die Ecken einfetten. Alle folgenden Schritte müssen unter Infrarotlicht durchgeführt werden. Das Präpariermikroskop ist mit Infrarot-Bildkonvertern aus den halb sektorierten Augäpfeln ausgestattet.

Entfernen Sie sowohl die Hornhaut als auch die Linsen. Entfernen Sie bei diesen Prozessen so viel Glaskörper wie möglich. Fahren Sie fort, indem Sie jeweils mit einer Augenmuschel arbeiten.

Die zweite Augenmuschel kann mehrere Stunden lang in einer Schale mit Inkubationslösung in einer leichten Box aufbewahrt werden, die mit reinem Sauerstoff und Raumtemperatur gesättigt ist, um von ganzen Netzhäuten aufzuzeichnen. Schälen Sie die erste Netzhaut von der Pigmentepithelschicht und reinigen Sie sie gegebenenfalls gründlich mit einer Pinzette, um verbleibende Pigmentepithelkörner zu entfernen. Um aus dem dorsalen Bereich der Netzhaut aufzunehmen, entfernen Sie den ventralen Teil der Augenmuschel, bevor Sie die Netzhaut mit einer Rasierklinge oder einer Mikroschere schälen.

Entfernen Sie mit der Corry-Marker-Referenz die ventrale Augenmuschel. Verwenden Sie eine Pipette, um die isolierte Netzhaut in einen Tropfen Perfusionslösung auf dem Deckel einer Petrischale zu übertragen. Fügen Sie dann fünf bis sechs kleine Tropfen Elektrodenlösung hinzu, die Bariumchlorid enthält.

Legen Sie den vorbereiteten Filter mit dem Loch in einen Tropfen Perfusionslösung mit einer Pinzette mit der Netzhaut. Positionieren Sie die Netzhaut mit der Photorezeptorseite nach oben auf dem Filterpapier. Drücken Sie dann die Kanten an der Peripherie, um sie flach zu montieren.

Die Netzhaut sollte über der Öffnung im Filterpapier zentriert sein. Übertragen Sie nun das Filterpapier mit der Netzhaut in die Perfusionskammer und platzieren Sie es oberhalb des Stimulusflecks ausgerichteten unteren Elektrodenraums. Drücken Sie leicht auf die Fettränder des Filterpapiers, um es mit der Kammer zu verbinden.

Platzieren Sie abschließend die obere Elektrode über der Netzhautmitte, sodass die Elektrode die Photorezeptorschicht leicht berührt. Fahren Sie nun mit dem Experiment fort, bei dem transretinale Aufnahmen gemacht werden. Für unsere Analyse verwenden wir die Spitzenlampe 10 Datenerfassungs- und Analysesoftware aus molekularen Geräten, die nach unserer Übereinstimmung verrottet sind.

Wir haben ein 505 Nanometer LED-Licht aus dieser LED-Quelle während langer Aufnahmesessions hergestellt. Um eine effiziente Unterdrückung der glialen Komponente der Photoreaktion aufrechtzuerhalten, wird die untere Elektrodenlösung geändert. Vor dem Test sollte jede Netzhaut ausreichen.

Die Blitzintensität der LED-Lichtquelle wurde durch eine Kombination aus computergestützter Steuerung der schaltbaren LED-Spannungswiderstände und einem Satz Neutraldichtefilter zwischen der LED und der Netzhaut gesteuert. Die Dauer des LED-Testblitzes, typischerweise 20 Millisekunden, wurde von einem Computer gesteuert. Diese C 57 schwarzen transretinalen Aufzeichnungen mit sechs Mausstäbchen zeigen Spuren, die durchschnittlich fünf bis sechs Reaktionen bei schwachem Licht und zwei bis drei Reaktionen bei gesättigten Lichtintensitäten darstellen.

Jede Spur dieser zapfengesteuerten transretinalen Rekodierungsdaten von der stäbchentransduzierenden Alpha-Knockout-Maus repräsentiert durchschnittlich fünf bis 10 Reaktionen bei schwachen Lichtintensitäten und drei bis fünf Reaktionen bei gesättigten Lichtintensitäten. Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir auftreten müssen. Und achtens, unsere Elektrogramm-Beschichtungen aus isolierter Netzhaut von Mäusen, um fäulnis- und störungsbedingte Photoreaktionen zu erhalten.