Name: Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Erfahren Sie die transretinale ERG-Aufzeichnung aus intakter Mäuseretina zur Isolierung von Stäbchen- und Zapfen-Photoresponsen. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen für die Netzhautforschung.

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1. Herstellung von Elektroden <ol><li> Bereiten Glaselektroden. Wiegen Sie 120 mg Agar und mischen Sie es in 10 ml destilliertem Wasser (letzte Konzentration Agar 1,2%). Schmelzen Sie die Agar-Lösung im heißen Wasserbad. Füllen Sie Glaskapillaren (wir benutzen Word-Presision Instruments TW100-4 Kapillaren mit folgenden Abmessungen: Länge = 100 mm, Da / Di = 1/0.75 mm und innere Volumen = 44 mL) mit dem Agar-Lösung mit Kunststoff-Spritze. Verfestigen des Agar bei Raumtemperatur für 10 min. Somit können bis zu ca. 200 Kapillaren gefüllt (der Rest der Mischung kann Agar bei -4 ° C und wieder verwendet mehrfach gespeichert werden). </li><li> Schneiden Sie die Kapillaren in zwei Hälften mit einem Diamant-Messer. </li><li> Weichen Sie die daraus resultierenden Glaselektroden in Maus-Elektrode-Lösung für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Speichern der Elektroden bei 4 ° C und sie über den Zeitraum von 3-4 Monaten. </li></ol> 2. Einrichtung des Tests <ol><li> Dunkel-Anpassung der Maus über Nacht. Verwenden Wildtyp (zum Beispiel C57Bl / 6) Mäuse für Stab-driven transretinal Aufnahmen und T α - / - Mäuse ohne Stab Signalisierung 8 für Kegel transretinal Aufnahmen. </li><li> Bereiten Sie 1 L Perfusionslösung, 100-ml-Elektrode-Lösung und 20 mL Inkubation Lösung (siehe unten) und Filtern der Perfusionslösung Trog eines Millipore 0,45 um oder 0,22 um-Filter (optional). </li><li> Kalibrieren der Lichtquelle (505 nm LED oder Halogenlampe optischen Stimulator) mit Hilfe eines Photometers in der Ebene der Netzhaut zu liegen. Im Fall der LED-Lichtquelle, einen optischen Diffusor verwenden, um Licht Einheitlichkeit zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie die Perfusionskammer für Experiment (Kammer-Konstruktionen können abweichen). Unsere Kammer von 3 mm Plexiglas, mit einem Boden von dem Deckel einer kleinen Petrischale aus Kunststoff hergestellt ist und eine aktive Perfusion Volumen von ~ 400 ul (L = 25 mm, B = 8 mm, H ≈ 2 mm). Füllen der unteren Elektrode Raum der Kammer mit der Elektrode, enthaltend 2 mM L-Glutamat und 10 mM BaCl 2. Die Verwendung von Kunststoff-Schlauch und einer Glaskapillare, eine Verbindung zwischen der Lösung in die untere Elektrode Raum (aus Kunststoff Schlauchverbinder an dem Kammerboden) und dem Elektrodenhalter. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen in der Elektrode, der Verbindungsschlauch, oder der Elektrodenhalter (säubern die Lösung mit Kunststoff-Spritze falls erforderlich). </li><li> Montieren der Aufnahmekammer auf der Bühne des Mikroskops (optional: das Mikroskop über eine Anti-Vibrations-Platte zu befestigen, und abgeschirmt in einem Faraday-Käfig um mechanische und elektromagnetische Rauschen zu minimieren). Verbinden der unteren Elektrode Halter mit dem positiven Pol der headstage Differenzverstärkers (zB Warner Instruments DP-311-Verstärker). Center und richten Sie die Kammer unteren Elektrode Eröffnung mit dem Stimulus Lichtfleck. Verbinden Sie die Perfusion Linie auf die Aufnahme Kammer und drehen Sie die Durchblutung an. </li><li> Blase die Perfusionslösung mit 95% O 2/5% CO 2 inkubiert, während es in 40 ° C watER Bad. CO 2 wird der pH der Lösung auf 7,2. Die Lösung fließt aus der Flasche zu der Aufnahmekammer durch die Schwerkraft, die durch einen keramischen Widerstand Wiederaufheizen auf 36-37 ° C Um Wärmeverluste zu verringern, sollte die Heizung möglichst nahe an der Aufnahme Kammer wie möglich, idealerweise auf der Bühne des Mikroskops liegen. </li><li> Mit einem Durchflussregler die Strömungsrate bis etwa 1 ml / min. </li><li> Verbinden der oberen Elektrode mit dem zweiten (negativen) Pol der headstage unter Verwendung eines zweiten Elektrodenhalter. Binden die Thermoelementsonde an die obere Elektrode mit einem O-Ring. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode und Thermoelement Spitzen nahe beieinander, so dass die Temperaturanzeige so nah an der Mitte der Netzhaut wie möglich getroffen wird. Tauchen der Spitze der oberen Elektrode in der Perfusion und gibt sie in der Mitte der Kammer. Lassen Sie 10-15 Minuten, um grundlegende Stabilisierung. </li><li> Einstellen der Gleichspannung für die Heizung, so dass die Temperatur der Lösung 36 ist -37 ° C </li></ol> 3. Isolieren Sie die Maus-Retina <ol><li> Unter schwaches rotes Licht, einschläfern die Dunkelheit angepasste Maus mit CO 2 und Genickbruch. Optional: Erstellen Sie eine Referenzmarke auf jeder Maus Augapfel durch Ausbrennen der meisten dorsalen Punkt der Lederhaut mit einem Brenneisen Stift oder beheizten Sezieren Stift. Alle nachfolgenden Verfahren werden unter Infrarot-Licht mit Infrarot-Bildwandler Passform zu einem Binokular durchgeführt. </li><li> Präparieren Sie die Augen mit einer gebogenen Schere durch leichten Druck und Dehnung der Haut an den Seiten jedes Auge. Hemisect beide Augäpfel unter IR-Beleuchtung mit Mikroschere oder einer Rasierklinge. </li><li> Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. Entfernen Sie so viel wie möglich des Glaskörpers. </li><li> Schälen Sie den ersten Netzhaut vom Pigmentepithel Schicht und, wenn nötig, reinigen Sie es mit einer Pinzette, um verbleibende Granulat von Pigmentepithel zu entfernen. Wir sind in der Regel mit ganzen Netzhaut sowohl für die Stäbchen und Zapfen transretinal Aufnahmen. Allerdings, wenn Sie wollen, speziell aus dem dorsalen Teil der Netzhaut, die Maus mehr M / L-Zapfen 9 hat aufzuzeichnen, vor dem Schälen die Netzhaut entfernen Sie den ventralen Teil des Augenmuschel mit einer Rasierklinge oder Mikroschere mit dem Brenneisen Marke als Referenz. </li><li> Legen Sie die zweite hemiseziert Augapfel in einer kleinen Petrischale mit Inkubationslösung und inkubieren Sie die Zubereitung in einem lichtdichten Gehäuse mit reinem Sauerstoff bis zur Verwendung gesättigt. In der Regel unter diesen Bedingungen die zweite Maus Augenmuschel kann für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gelagert werden und für Aufnahmen. </li><li> Mit einem Glas oder Kunststoff Pipette übertragen die isolierte Netzhaut zu einem Rückgang der Perfusionslösung (ca. 300 ul) auf dem Deckel einer Petrischale. Fügen Sie 5-6 kleine Tropfen der Elektrode Lösung mit BaCl 2 vor, inkubieren der Netzhaut mit BaCl 2. Setzen Sie ein quadratisches Stück (ca. 5x5 mm) der Rückseite Ecke gefettet (wir verwenden Dow Corning 111 Ventil Schmier-und Dichtmittel) Millipore-Filterpapier (0,45 um HArg Typ) mit vorgefertigten Loch in ihrer Mitte (von 2 bis 2,5 mm Durchmesser) auf die gleiche Lösung Tropfen. Mit einer Pinzette die Netzhaut Position auf dem Filterpapier (Photorezeptor Seite nach oben) und drücken Sie den Rändern an der Peripherie zu Flachbild-mounten. Die Netzhaut sollte über der Öffnung in dem Filterpapier zentriert werden. </li><li> Mit einer Pinzette Das Filterpapier mit der Retina zum Perfusionskammer und legen Sie es über dem Stimulus-Spot ausgerichtet unteren Elektrode Raum. Leicht drücken Sie die gefetteten Kanten des Filterpapiers zu verbinden es mit der Kammer. </li><li> Legen Sie die obere Elektrode über die Netzhaut Zentrum (leicht berühren Photorezeptorschicht). Die Zentrierung des oberen Elektrode auf der Netzhaut erhöht die Signalamplitude (bis zu ~ 20-40% gegenüber rl es näher an der Retina Rand im Vergleich). Obwohl eine solche Elektrode Lage leicht verzerrt den effektiven Licht Reizintensität Erreichen eines kleinen Sektor der Netzhaut (~ 12-15% der Gesamtfläche), ist es immer noch die optimale Art und Weise der Abgabe des elektronischenzertrat. Das Präparat ist jetzt bereit für transretinal Aufnahmen. </li></ol> 4. Transretinal Recordings <ol><li> Abhängig von Ihrer Mauslinie, Rekord Stab oder M / L-Kegel-driven-Test Flash-Reaktionen zwischen schwach und stark Intensität der kalibrierten 505 nm Licht von LED-Lichtquelle oder optische Stimulator zur Verfügung gestellt. Im Falle unserer LED-Lichtquelle, wird der Blitz-Intensität durch eine Kombination von computerisierte Steuerung von LED-Eingangsspannung, schaltbare Widerstände, und eine Reihe von Neutralfilter (wir verwenden E-Farbe Nr. 211 0,9 ND-Filter von Film Rosco Laboratories gesteuert ) zwischen der LED und der Netzhaut platziert. Die Dauer der LED Probeblitz (20 ms) durch einen Computer gesteuert. Wenn unter Verwendung einer Halogenlampe optischen Stimulator kann Probeblitz Intensität und Wellenlänge durch einen Satz von Neutralfilter und Schmalband-Interferenz-Filter, jeweils gesteuert werden. Testen Blitzdauer kann durch Computer-gesteuerte Jalousien gesteuert werden. </li><li> Optional: zur Aufrechterhaltung eines effizientenUnterdrückung der Glia-Komponente der Photoreaktion mit BaCl 2 im Laufe des Tages, ändern Sie die untere Elektrode Lösung gelegentlich (z. B. vor der Prüfung jedes einzelnen Retina) durch Spülen Sie es mit einem Kunststoff-Spritze mit frischer Lösung gefüllt. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Lösungen <ol><li> Mausretina Perfusionslösung: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na Succinat, 0,5 mM Na Glutamat, 0,02 mM EDTA, und 10 mM Glucose. Darüber hinaus wird die Lösung mit 2 mM L-Glutamat und 10 pM DL-A-4, um Komponenten höherer Ordnung der Photoreaktion 10,11 Block ergänzt, und mit 0,1% MEM-Vitaminen und Aminosäuren MEM Lösungen (Sigma) bis zu Netzhaut zu verbessern Lebensfähigkeit. </li><li> Maus-Elektrode Lösung: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). Die Lösung in dem unteren Elementctrode Raum enthält auch 2 mM L-Glutamat in die synaptische Übertragung 10 und, zusätzlich zu blockieren, 10 mM BaCl 2 zu unterdrücken die Gliazellen Komponente des Photoantwort 3,12. </li><li> Retina Inkubationslösung: Man löst 272 mg L-15-Medium (Sigma) und 20 mg BSA in 20 ml deionisiertem Wasser. Endgültige L-15 und BSA-Konzentrationen sind 13,6 mg / ml und 1 mg / ml. Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl. </li></ol><img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1."> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung der Maus Netzhaut für transretinal ERG-Aufnahmen. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2."> Abbildung 2. Foto des Perfusionskammer und Aufzeichnungs-Elektroden mit ihren Haltern. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3."> Abbildung 3. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für transretinal ERG-Aufnahmen. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4."> . Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse: aufgezeichnet Familie Maus Stab-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt Spuren stellen Durchschnittswerte von 5-6 Antworten auf dim Lichtintensitäten und 2-3 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten. <img alt="Abbildung 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5."> Abbildung 5 Repräsentative Ergebnisse:. Aufgezeichnete Familie der Maus Kegel-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt werden Spuren AVERAGES von 5-10 Reaktionen bei schwachen Licht-Intensitäten und 3-5 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten.

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M%2FL-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li>
<li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
</ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfindlichkeit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentar </td></tr><tr><td> DL-A-4 </td><td></td><td> Tocris Bioscience </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> Alle anderen Reagenzien </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glaskapillaren </td><td></td><td> World Precision Instruments </td><td> TW100-4 </td><td> Zur Herstellung von Elektroden </td></tr><tr><td> Filterpapier </td><td> HArg </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> Photometer </td><td></td><td> UDT Instruments </td><td> S350 </td><td> Für leichte Kalibrierung </td></tr><tr><td> Radiometrische Silicon Sensor </td><td></td&gt; <td> UDT Instruments </td><td> 221 </td><td> Für leichte Kalibrierung </td></tr><tr><td> Antischwingungstisches </td><td></td><td> Technische Manufacturing Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> Um mechanische Geräusche zu minimieren </td></tr><tr><td> Luftkompressor Panther P 15TC </td><td></td><td> Werther International </td><td> P 15TC </td><td> An Antischwingungstisches </td></tr><tr><td> Stereomikroskop </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> Für Maus Auge Dissektion </td></tr><tr><td> Infrarot-Bildwandler </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> Gebunden an Stereomikroskop </td></tr><tr><td> Differenzverstärker DP-311 </td><td></td><td> Warner Instruments </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> Axon 1440A Digidata Digitizer </td><td>; </td><td> Molecular Devices </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> Dual Channel 8-Pol-Filter </td><td></td><td> Krohn-HITE GmbH </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> Keramische Widerstand </td><td></td><td> TE Connectivity </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> Für Wiedererhitzen des Perfusionslösung </td></tr><tr><td> Thermoelement </td><td> T </td><td> Physitemp Instruments </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> Temperaturwächter </td><td></td><td> Omega </td><td> DPi32 </td><td> Verbunden mit Thermoelement </td></tr><tr><td> LED 505 nm </td><td></td><td> TT Electronics / Optek Technology </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> Zum Test Blitze / Bleichen Licht gelten </td></tr><tr><td> Kautergriff Stift </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> Zur Markierung der dorsalen Teilder Maus Augapfels </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung und-analyse-Software </td><td></td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings aus maus-retina: stäbchen und zapfen photomorphosen

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik 1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten 3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation 6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung 8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout (- / - Tα) erhalten werden

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

In der Retina von Wirbeltieren gibt es zwei verschiedene Klassen bildgebender Photorezeptoren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Lichtphotonen zu detektieren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, transretinale Elektroretinogrammaufnahmen von isolierten, intakten Mausretinen durchzuführen, um lichtgesteuerte Antworten der Stäbchen und Zapfen zu erhalten. Zunächst werden Glas-Kapillaren und eine Perfusionskammer für die Aufnahmen vorbereitet. Beide Augenkämmerchen von einer dunkeladaptierten Maus werden halbiert.Unter Infrarotbeleuchtung werden Hornhautlinse und Glaskörper entfernt. Die Netzhaut wird vom Pigmentepithel abgelöst und mit der Photorezeptorseite nach oben auf das Filterpapier gelegt. Die Netzhaut auf dem Filterpapier wird in die Perfusionskammer auf dem Mikroskoptisch transferiert und zwischen zwei Elektroden platziert, die mit der Kopfstufe eines differentiellen Verstärkers verbunden sind.Schließlich werden von Stäbchen und Zapfen vermittelte Lichtantworten aus der flach montierten Mausretina aufgezeichnet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie klassischen Einzelzell-Aufzeichnungen liegt darin, dass sie langzeitige, pharmakologisch zugängliche Aufzeichnungen von Stäbchen- und Zapfenrezeptoren sowohl von Wildtyp- als auch von genetisch modifizierten Mäusen ermöglicht. Sie erweist

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Forschung

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Neurowissenschaften

Wir werden zeigen, wie man Flash-Antworten von einfachen Mausklick Kegel mit einem Saug-Elektrode aufnehmen.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Dieses Video zeigt die Aufnahme eines direkt gekoppelten Elektroretinogramms (DC-ERG) auf einem dunkeladaptierten, anästhesierten retinalen Pigmentepithel (RPE) der Maus. Nach dem Auftragen von dilatierenden Tropfen wird das Tier in eine Aufnahmeeinrichtung gebracht und die mit einem Salzpuffer gefüllte Kapillarelektrode auf die Hornhaut gelegt. Nach der Festlegung der Baseline wird DC-ERG aufgezeichnet.

Direkt gekoppeltes Elektroretinogramm Aufzeichnung des retinalen Pigmentepithels bei einer Maus

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander...

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

Wir werden zeigen, wie man Netzhautschnitte aus dem Mausauge präpariert und Lichtreaktionen in retinalen Neuronen aufzeichnet. Das gesamte Verfahren wird unter dunkeladaptierten Bedingungen durchgeführt.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

Wir beschreiben ein Protokoll, um Ca 2+ Dynamik in den Axonterminalen von Zapfen-Photorezeptoren mit einem ex-vivo Scheibe Vorbereitung der Maus Netzhaut zu überwachen. Dieses Protokoll ermöglicht umfassende Studien der Kegel Ca 2+ Signalisierung in einem wichtigen Säugetiermodellsystem der Maus.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Das Elektroretinogramm (ERG) ist ein elektrisches Potential, das von der Netzhaut als Reaktion auf Licht erzeugt wird. In dieser Arbeit wird beschrieben, wie das ERG zur Beurteilung der Netzhautfunktion bei dunkeladaptierten Ratten verwendet werden kann und wie es zur Beurteilung einer neuroprotektiven Intervention, im vorliegenden Fall der ischämischen Fernpräkonditionierung, verwendet werden kann.

Verwenden der Funktion zur Elektroretinogramm im Nager Retina und die schützende Wirkung des Fern Limb ischämischen Präkonditionierung bewerten

Ex vivo ERG kann verwendet werden, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen direkt von isolierten intakten Netzhäuten von Tieren oder Menschen aufzuzeichnen. Wir zeigen hier, wie gängige in vivo ERG-Systeme für ex vivo ERG-Aufzeichnungen adaptiert werden können, um die elektrische Aktivität von Netzhautzellen zu zerlegen.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Messung von Elektroretinogramm und visuell evozierten Potentialen bei anästhesierten Ratten.

Gleichzeitige Aufnahme von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen in narkotisierten Ratten

Wir zeigen eine chirurgische Implantation und Aufnahmeverfahren visuelle elektro Signale aus dem Auge (ERG) und Gehirn (visuell evozierte Potentiale) zu messen in der bewussten Ratten, die mehr analog zum menschlichen Zustand ist, wo Aufnahmen ohne Narkose verwechselt durchgeführt werden.

Implantations- und Aufzeichnung von Wireless-Elektroretinogramm und visuell evozierten Potenziale in wachen Ratten

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

Erfahren Sie die transretinale ERG-Aufzeichnung aus intakter Mäuseretina zur Isolierung von Stäbchen- und Zapfen-Photoresponsen. Diese Methode ermöglicht präzise elektrophysiologische Messungen für die Netzhautforschung.

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

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