Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, LAX Z-positive Zellen aus dem neonatalen Mauscochlea mithilfe der Durchflusszytometrie zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine große Anzahl von Mauscochlea in einem relativ kurzen Zeitraum isoliert wird, um die Zellen lebensfähig zu halten und ausreichend Ausgangsgewebe zu erhalten. Als zweiter Schritt werden die LAX Z-positiven Zellen dissoziiert und anschließend markiert, um das Gewebe für die Sortierung vorzubereiten.

Die Zellen werden anschließend per Durchflusszytometrie sortiert. Die resultierenden Populationen mit hohem LAX Z-Gehalt und niedrigem lax-Gehalt können dann für weitere Experimente verwendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ohrenforschung zu beantworten, beispielsweise welche Genprofile oder spezifischen Zellpopulationen im Innenohr vorkommen.

Den Ablauf wird Taha Gen, ein Medizinstudent aus unserem Labor, demonstrieren. Füllen Sie zunächst 35-Millimeter-Petri-Schalen mit HBSS und stellen Sie sie auf einen Eisblock. Danach, nachdem Sie mit Iris-Scheren 12 bis 15 euthanasierte, postnatale, null bis drei Tage alte Axon-, zwei-laxy-Reporter- und Wildtyp-Mäuse enthauptet haben.

Platzieren Sie die Köpfe auf eine 60 Millimeter große Petrischale, die auf einem Eisblock steht. Verwenden Sie anschließend Dumont-Forceps der Größe fünf und Iris-Scheren, um den Unterkiefer und die Zunge aus den Köpfen zu entfernen, und schneiden Sie dann durch die Schädelbasis auf Höhe des Gaumens. Entfernen Sie nun die überliegende Haut des Schädels und durchtrennen Sie die Schädelbasis, indem Sie die Schere am unteren Teil des Foramen magnum bis zur Mitte des Gaumens einführen.

Führen Sie mit der Schere auf beiden Seiten einen weiteren Schnitt vom geschnittenen Rand des Gaumens zur oberen Seite des Schädels durch, wobei Sie darauf achten müssen, die otische Kapsel nicht zu beschädigen. Vervollständigen Sie anschließend die Isolierung des Schläfenbeins, indem Sie zwei um 45 Grad geneigte Schnitte durchführen, die von der oberen Seite des Foramen magnum bis zum koronalen Schnitt am harten Gaumen verlaufen.

Danach die isolierten Schläfenbeine in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit HBSS auf den Eisblock geben und den Eisblock in eine sterile Sterilbank transferieren. Als Nächstes eine weitere 35-Millimeter-Petri-Schale diesmal mit PBS füllen und auf den Eisblock stellen. Mit zwei Pinzetten der Größe 55 arbeiten.

Beginnen Sie die Mikrodissektion, indem Sie vorsichtig die Großhirnrinde, die Hirnregionen Hirnstamm und Kleinhirn vom Schläfenbein über der Otokapsel entfernen. Danach entfernen Sie, ohne die Otokapsel zu lösen, Teile der Cochleakapsel beginnend am Eintritt des Nervus vestibulocochlearis und fortsetzend in Richtung Otokapsel. Nachdem die Basis der Cochlea freigelegt ist, ziehen Sie vorsichtig das Corti-Organ und das umgebende Gewebe heraus.

Danach beginnend an der Basis, entfernen Sie alle verbleibenden Spiralganglien und Stria-vascularis-Anteile und überführen Sie die Cochlea in die mit PBS gefüllte Petrischale. Pipettieren Sie zunächst 50 Mikroliter sterilem PBS in die Mitte von ein bis zwei Vertiefungen einer nicht beschichteten sechswelligen Kulturplatte. Überführen Sie danach nicht mehr als 20 Axine, zwei laxy Cochleae in jeden Tropfen PBS.

Vorher erwärmen Sie 50 µL-Aliquote von 0,125 % Trypsin etwa zwei Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad vor. Geben Sie anschließend den Trypsin hinzu zum Innenohr, wobei darauf geachtet werden muss, die Schale nicht zu schütteln.

Inkubieren Sie das Cochlea bei 37 Grad Celsius für acht Minuten. Beenden Sie die Trypsinierung, indem Sie 50 Mikroliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu jedem Tropfen hinzufügen, und geben Sie anschließend weitere 50 Mikroliter vollständiges Medium hinzu, nachdem Sie einen P-200-Pipettenmann auf 125 Mikroliter eingestellt haben. Verwenden Sie eine stumpfe Pipettenspitze mit 300 Mikroliter, um die Zellen vorsichtig 80 Mal umzusetzen, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen zu erzeugen.

Danach, nachdem jede Tröpfchenportion jeweils aufgebrochen wurde, weitere 200 Mikroliter Vollmedium zu jedem hinzufügen. Die Zellen nun durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb in eine neue Vertiefung desselben Sechswell-Platte überführen und anschließend die Zellen aus jeder Vertiefung in individuelle Standard-FACS-Röhrchen übertragen.

Fügen Sie anschließend 100 µL Wildtyp-Zellen in jeweils drei Reagenzgläser hinzu, gefolgt von einer Verdünnung mit 300 µL Vollmedium nur für die CUG. Verdünnen Sie als Kontrolle 10 µL Axon, zwei LAX Z-Zellen in 390 µL Vollmedium. Überführen Sie die verbleibenden Axon-Zwei-LAX-Z-Zellen in Fax-Röhrchen in 400 µL OTs.

Anschießend die Reagenzgläser 10 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C inkubieren, danach 200 µL verdünntes CUG jedem entsprechenden FACS-Röhrchen hinzufügen. Danach, unter Lichtschutz für alle Röhrchen, die Zellen 25 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C inkubieren. Während der Inkubation der Zellen für die Färbung 10 mL frisch zubereitete Heaps plus FBS in ein 15-mL-Röhrchen geben und das Röhrchen auf Eis stellen.

Anschließend 1,8 Milliliter der eiskalten Heap-Lösung unter der sterilen Haube bei ausgeschaltetem Licht zu jedem der Fax-Röhrchen hinzufügen, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Danach die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1200 U/min zentrifugieren. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Vollmedium.

Vereinigen Sie alle Aliquots der Sortierprobe und geben Sie Propidiumiodid in jedes geeignete Gefäß, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Schließlich, nachdem die Zellen erneut abgedeckt wurden, stellen Sie sie erneut auf Eis. Richten Sie die Sortiertore ein, indem Sie zunächst 1000 Ereignisse der nicht angefärbten Wildtyp-Zellen sammeln, um die Zellverteilung im Vorwärts- versus Seitenstreuplot zu bestimmen.

Passen Sie die Parameter für Streuung nach vorne und zur Seite nach Bedarf an. Kompensieren Sie anschließend mit der nicht angefärbten Wildtyp-, PI-gefärbten Wildtyp- und CUG-gefärbten Axonprobe. Zwei LAX Z-Zellen.

Füllen Sie zwei FACS-Röhrchen mit jeweils 500 Mikrolitern Vollmedium. Starten Sie dann die Analyse mit den mit PI gefärbten Wildtyp-Zellen und den mit Calcofluor White CUG gefärbten Axon-Zellen. Legen Sie das Tor zur Ausschluss von Trümmern anhand des Vorwärts-Scatter- versus Seiten-Scatter-Diagramms fest. Schließen Sie Doppelzellen und Zellklumpen mithilfe des Vorwärts-Scatter-Höhe- versus Vorwärts-Scatter-Fläche-Diagramms aus.

Schließen Sie dann die PI-positiven toten Zellen basierend auf dem Streulichtvorwärts-Areal im Vergleich zum PE-sci-fünf-Areal-Plot aus. Richten Sie für jede Gatterposition eine Darstellung des Streulichtvorwärts-Areals gegenüber dem Cascade- oder Pacific-Blau-Areal ein. Analysieren Sie 10.000 Ereignisse aus dem Sortierprobenröhrchen, das axon zwei laxy PI- und CUG-gefärbte Zellen enthält, unter Verwendung aller mit den Wildtyp-Zellen festgelegten Gatter und der Plots der Wildtyp-Zellen.

Erstellen Sie Tore für Cascade-Blau-hohe Zellen, die weniger als 1 % der Gesamtanzahl an Ereignissen ausmachen. Die Cascade-Blau-hohen Tore sollten nun etwa 15 bis 20 % der Zellen in der Axon-two-laxy-Probe enthalten. Erstellen Sie unter Verwendung dieser Axon-two-hohen Zellen und des Axon-two-laxy-Zellanalyse-Plots nun ein Tor für die am wenigsten fluoreszierenden 15 bis 20 % der Zellen, indem Sie die zuvor genannte Gating-Strategie anwenden.

Sortieren Sie die Zellen in die FACS-Röhrchen mit vollständigem Medium ein, wobei die Sammelröhrchen während des Sortierens in einer auf vier Grad Celsius gekühlten Kammer gehalten werden. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die vom Durchflusszytometer für jede Population in diesen beiden Abbildungen erfasst wurden. Die Seitenstreufläche im Vergleich zur Vorwärtsstreufläche der dissoziierten Wildtyp-Zellen auf der linken Seite und von axon zwei LA Z auf der rechten Seite.

Kochleazellen werden gezeigt. Beachten Sie die Gating-Abgrenzung der unterschiedlichen Ereignisgruppen, die deutlich größer sind als die Ereignisse näher an der Y-Achse, die als die Trümmer-negative Population gekennzeichnet sind. Typischerweise werden 40 bis 45 % trümmerfreie Zellen sowohl aus der Wildtyp- als auch aus der axin zwei LAX Z-Kochlea in diesen beiden Darstellungen gewonnen.

Die Höhe des Forward Scatter im Verhältnis zur Fläche des Forward Scatter wird verwendet, um Doppelereignisse aus dem zuvor selektierten Zelltrümmern auszuschließen. Negative Populationsevents, die von der erwarteten linearen Natur des Diagramms abweichen, werden ausgeschlossen. Diese Aufbereitung ergibt typischerweise 71,1 % der Ereignisse innerhalb des definierten Gates. Hier.

Propidiumiodid, detektiert über den PE SCI Fünfkanal, wird verwendet, um tote Zellen auszuschließen, wie in diesen Streudiagrammen beobachtet. Etwa 95 % der sortierten Zellen waren vital und nahmen in diesen Darstellungen kein PI auf. Der Cascade-Blau-Kanal wurde verwendet, um das fluoreszierende Substrat CUG nachzuweisen, wie in der Abbildung rechts zu sehen.

Im Durchschnitt sind die oberen etwa 20 % der CUG-positiven Zellen die laxy hohen Zellen, die etwa 15.000 Axone entsprechen, zwei hohe Zellen pro 10 bis 12 Tiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man laxy hohe Zellen mittels Durchflusszytometrie aus Innenohrgeweben isoliert und vorbereitet, sowohl für Zell-Turing-Experimente als auch für Experimente wie Genexpression-Analysen.