Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, laxe Z-positive Zellen aus der neonatalen Maus-Cochlea mittels Durchflusszytometrie zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine große Anzahl von Maus-Cochlea in einem relativ kurzen Zeitrahmen isoliert wird, um die Zellen lebensfähig zu halten und über ausreichend Ausgangsgewebe zu verfügen. In einem zweiten Schritt werden die LAX Z-positiven Zellen dissoziiert und anschließend markiert, um das Gewebe für die Sortierung vorzubereiten.

Anschließend werden die Zellen mittels Durchflusszytometrie sortiert. Die resultierenden LAX Z High- und lax Low-Populationen können dann für weitere Experimente verwendet werden. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Ohrforschung zu beantworten, z. B. welche Genprofile oder spezifischen Zellpopulationen im Innenohr vorhanden sind.

Das Verfahren wird von Taha Gen A Medizinstudent aus unserem Labor demonstriert. Füllen Sie zunächst 35 Millimeter große Petrischalen mit HBSS und legen Sie sie auf einen Eisblock. Dann, nachdem er 12 bis 15 postnatale, null bis drei Tage alte Axone mit einer Irisschere geköpft hatte, zwei laxe Reporter- und Wildtyp-Mäuse

Legen Sie die Köpfe auf eine 60 Millimeter große Petrischale auf einem Eisblock. Verwenden Sie als Nächstes eine Dumont-Zange Nummer fünf und eine Irisschere, um den Unterkiefer und die Zunge von den Köpfen zu entfernen, und schneiden Sie dann die Schädelbasis auf Höhe der Palette durch. Entfernen Sie nun die darüber liegende Haut des Kalbes und durchschneiden Sie die Schädelbasis, indem Sie die Schere am unteren Teil des Foramen magnum zur Mitte des Gaumens einführen.

Machen Sie mit der Schere einen weiteren Schnitt von der Schnittkante des Gaumens bis zur oberen Seite des Kalbes auf beiden Seiten. Achten Sie darauf, die Kapsel nicht zu beschädigen. Vervollständigen Sie dann die Isolierung des Schläfenbeins, indem Sie 2 45 Grad abgewinkelte Schnitte vornehmen, beginnend mit dem oberen Aspekt des Rahmens und der Magnum, die sich bis zum koronalen Schnitt am harten Gaumen erstrecken.

Legen Sie dann die isolierten Schläfenknochen in die 35 Millimeter großen Petrischalen mit HBSS auf dem Eisblock und geben Sie den Eisblock in eine sterile Präparierhaube. Füllen Sie als Nächstes eine weitere 35-Millimeter-Petrischale, diesmal mit PBS, und legen Sie sie auf den Eisblock. Mit zwei Pinzetten der Nummer 55.

Beginnen Sie die Mikrodissektion, indem Sie die Hirnrinde, den Hirnstamm und das Kleinhirn vorsichtig aus dem Schläfenbein entfernen, das über der Kapsel oticus liegt. Dann, ohne die Kapsel zu entfernen, schneiden Sie Teile der Cochlea-Kapsel ab, beginnend am Eingang des Nervus cochlearis vestibulär und weiter in die Kapsel oticus. Ziehen Sie nach der Freilegung der Cochlea-Basis vorsichtig das Corti-Organ und das umgebende Gewebe heraus.

Entfernen Sie dann, beginnend an der Basis, alle verbleibenden Spiralganglien und Stria-Ssis und übertragen Sie die Cochlea in die Petrischale, die mit der ersten PBS-Pipette gefüllt ist. 50 Mikroliter steriles PBS in die Mitte von ein bis zwei Vertiefungen einer unbeschichteten Kulturschale mit sechs Vertiefungen. Übertragen Sie dann nicht mehr als 20 Axin, zwei laxy Cochlea in jedes Tröpfchen PBS.

Anschließend 50 Mikroliter Aliquots mit 0,125 % Trypsin etwa zwei Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vorwärmen. Und dann fügen Sie das Trypsin zur Cochlea hinzu. Achten Sie darauf, das Gericht nicht zu schütteln.

Inkubieren Sie die Cochlea acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beenden Sie die Trypsinisierung, indem Sie jedem Tröpfchen 50 Mikroliter Sojabohnen-Tripsin-Inhibitor hinzufügen, und fügen Sie dann weitere 50 Mikroliter des vollen Mediums hinzu, nachdem Sie eine P 200-Pipette auf 125 Mikroliter eingestellt haben. Verwenden Sie eine stumpfe Pipettenspitze von 300 Mikrolitern, um die Zellen 80 Mal sanft zu tupfen, und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden.

Nachdem jedes Tröpfchen verreibt wurde, fügen Sie jedem weitere 200 Mikroliter des vollen Mediums hinzu. Nun geben Sie die Zellen durch ein 40 Mikron Zellsieb in eine neue Vertiefung. Innerhalb derselben Sechs-Well-Platte und übertragen Sie dann die Zellen aus jedem Well auf einzelne Standard-Faxröhren.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Wildtyp-Zellen in jedes der drei Röhrchen, gefolgt von einer Verdünnung mit 300 Mikrolitern vollem Medium nur für das CUG. Kontrollieren Sie die Verdünnung von 10 Mikrolitern Axon, zwei LAX Z-Zellen in 390 Mikrolitern vollem Medium. Übertragen Sie die verbleibenden Axon-, zwei laxen Z-Zellen in Faxröhren in 400-Mikroliter-OTs.

Nachdem Sie die Röhrchen 10 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator inkubiert haben, geben Sie 200 Mikroliter verdünntes CUG in jedes geeignete Faxrohr. Anschließend werden alle Röhrchen vor Licht geschützt und die Zellen 25 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator inkubiert. Für die Färbung während der Inkubation der Zellen geben Sie 10 Milliliter frisch vorbereitete Häufchen plus FBS in ein 15-Milliliter-Röhrchen und stellen das Röhrchen auf Eis.

Geben Sie dann bei ausgeschaltetem Licht 1,8 Milliliter der eiskalten Heap-Lösung in jedes der Faxschläuche unter der sterilen Haube, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 1200 U/min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern vollem Medium.

Alle Aliquote für die Sortierprobe werden zusammengefasst und dann Propidiumiodid in jedes geeignete Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter gegeben. Nachdem Sie die Zellen abgedeckt haben, legen Sie sie erneut auf Eis. Richten Sie die Sortiergatter ein, indem Sie zunächst 1000 Ereignisse der ungefärbten Wildtyp-Zellen sammeln, um die Zellverteilung im Vorwärts- und Seitenstreudiagramm zu bestimmen.

Passen Sie die Parameter für die Vorwärts- und Seitenstreuung nach Bedarf an. Kompensieren Sie dann mit dem ungefärbten Wildtyp PI, dem gefärbten Wildtyp und dem CUG-gefärbten Axon. Zwei LAX Z-Zellen.

Füllen Sie zwei Faxröhren mit 500 Mikrolitern vollem Medium. Starten Sie dann die Analyse mit dem Wildtyp-PI-gefärbten und Axon-Gatter mit zwei Lae CUG-gefärbten Zellen, um Trümmer basierend auf dem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm auszuschließen. Schließen Sie Dubletten und Klumpen mit dem Diagramm für die Höhe der Streufläche nach vorne im Vergleich zum Streubereich nach vorne aus.

Schließen Sie dann PI-positive tote Zellen basierend auf der Vorwärtsstreufläche im Vergleich zum PE-Sci-Fünf-Flächen-Diagramm aus. Erstellen Sie für jede Gangplatzierung ein Diagramm der Streufläche nach vorne im Vergleich zur Kaskade oder dem pazifischen blauen Bereich. Analysieren Sie 10.000 Ereignisse aus dem Sortierprobenröhrchen, das Axon, zwei laxy PI- und CUG-gefärbte Zellen enthält, unter Verwendung aller Gates, die mit den Wildtyp-Zellen gesetzt wurden, unter Verwendung von Plots aus den Wildtyp-Zellen.

Erstellen Sie Gates für kaskadierte blaue hohe Zellen, die weniger als 1 % der Gesamtzahl der Ereignisse ausmachen. Die Kaskade Blue High Gates sollte nun etwa 15 bis 20 % der Zellen in der laxen Probe von Axon Two enthalten. Wenn diese Axone mit dem Analysediagramm von Axon zwei laxy Zellen zwei hoch werden, entsteht nun ein Gate für die geringste Grippe, 15 bis 20 % der Zellen, die die oben erwähnte Gating-Strategie verwenden.

Sortieren Sie die Zellen in die Faxröhren mit den vollen Medien, und bewahren Sie die Sammelröhren während der Sortierung in einer Kammer auf, die auf vier Grad Celsius gekühlt ist. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die vom Durchflusszytometer für jede Population gezählt werden, in diesen beiden Zahlen. Die seitlichen Streuflächen im Vergleich zu den vorderen Streuflächen des dissoziierten Wildtyps auf der linken Seite und das Axon zwei LA Z auf der rechten Seite.

Dargestellt sind Cochlea-Zellen. Beachten Sie das Gating der unterschiedlichen Gruppen von Ereignissen, die viel größer sind als die Ereignisse, die näher an der Y-Achse liegen, die als negative Population bezeichnet wird. In der Regel werden 40 bis 45 % trümmerfreie Zellen sowohl aus dem Wildtyp als auch aus der Axin Two LAX Z Cochlea in diesen beiden Panels gewonnen.

Die Streuhöhe nach vorne im Vergleich zur Streufläche nach vorne wird verwendet, um Dubletten von den zuvor abgegrenzten Ablagerungen auszuschließen. Negative Populationsereignisse, die von der erwarteten linearen Natur des Diagramms abweichen, werden ausgeschlossen. Diese Vorbereitung führt in der Regel zu 71,1 %-Ereignissen innerhalb des angegebenen Gates. Hier.

Propidiumiodid, wie es mit dem PE-SCI-Fünfkanal nachgewiesen wird, wird verwendet, um tote Zellen auszuschließen, wie in diesen Streudiagrammen beobachtet. Etwa 95 % der sortierten Zellen waren lebensfähig und nahmen in diesen Panels kein PI PI auf. Der Cascade Blue Channel wurde verwendet, um das fluoreszierende Substrat CUG zu detektieren, wie in der Abbildung rechts zu sehen ist.

Im Durchschnitt sind die oberen etwa 20%CUG-positiven Zellen lae hohe Zellen, die mit etwa 15.000 Axone korrelieren, zwei hohe Zellen pro 10 bis 12 Tiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie laxy High-Zellen mittels Durchflusszytometrie aus Innenohrgewebe sowohl für Zell-Turing-Experimente als auch für Experimente wie Gen-Profiling vorbereiten und isolieren können.