Name: Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus dem Innenohr neugeborener Mäuse mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer Zellpopulationen für die Hörforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken S. Heller, K. Oshima, R. Nusse und Y. Zeng für fruchtbare Diskussionen sowie C. Tang, A. Lee, E. Liaw und dem Personal der Stanford Shared FACS Facility für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, das Stanford University Medical Scholars-Programm (beide an T.A.J.), ein Stanford University Dean's Fellowship (an R.C.), die American Otological Society, die Triological Society, den Percy Memorial Award, den Akiko Yamazaki und Jerry Yang Faculty Scholar Fund sowie durch NIDCD/NIH K08 DC011043 (alle an A.G.C.).

1. Mikrodissektion der Cochlea
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Dissektionsmikroskop unter der Haube vor, indem Sie die Oberflächen mit 70 %igem Ethanol abwischen und Eisblöcke bereitstellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 10–15 35-mm-Petri-Schalen unter sterilen Bedingungen vor und füllen Sie diese zur Hälfte (~2 ml) mit steriler Hank’s Balanced Salt Solution mit Calcium (HBSS).</li>
	<li>Bereiten Sie zwei 35-mm-Petri-Schalen unter sterilen Bedingungen vor und füllen Sie diese zur Hälfte (~2 ml) mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Mikrozange in einem 50-ml-kegelförmigen Falcon-Röhrchen mit 70 %igem Ethanol.</li>
	<li>Verwenden Sie in einem separaten Raum außerhalb der sterilen Haube Iris-Scheren, um 12–15 neugeborene (P) 0–3 Tage alte Axin2LacZ/+ Reporter-Mäuse zu enthaupten, und legen Sie die Köpfe auf eine 60-mm-Petri-Schale auf einen Eisblock.</li>
	<li>Entfernen Sie mit #5 Dumont-Zangen und Iris-Scheren das Unterkiefer- und Zungenstück und schneiden Sie durch die Schädelbasis auf Höhe des Gaumens.</li>
	<li>Entfernen Sie die darüberliegende Haut der Calvaria und durchtrennen Sie die Schädelbasis, indem Sie die Schere am unteren Teil des Foramen magnum ansetzen und bis zur Mitte des Gaumens schneiden.</li>
	<li>Führen Sie einen weiteren Schnitt mit der Iris-Schere von der Schnittkante des Gaumens bis zur oberen Seite der Calvaria auf beiden Seiten durch, wobei darauf zu achten ist, die otische Kapsel nicht zu beschädigen.</li>
	<li>Schließen Sie die Isolierung des Felsenbeins ab, indem Sie zwei 45-Grad-schräge Schnitte ausführend, die am oberen Teil des Foramen magnum beginnen und bis zum koronalen Schnitt am harten Gaumen reichen.</li>
	<li>Legen Sie die isolierten Felsenbeine in 35-mm-Petri-Schalen mit HBSS auf einen Eisblock.</li>
	<li>Sammeln Sie Felsenbeine von etwa 12–15 getöteten Tieren, insgesamt 24–30 Felsenbeine.</li>
	<li>Bringen Sie die Petri-Schale mit den isolierten Felsenbeinen in die zuvor vorbereitete sterile Dissektionshaube (1.1).</li>
	<li>Überführen Sie jeweils vier Felsenbeine in jede vorbereitete 35-mm-Petri-Schale mit HBSS (1.2) und stellen Sie sie auf einen Eisblock.</li>
	<li>Beginnen Sie die Mikrodissektion, indem Sie mit zwei #55-Zangen vorsichtig die Hirnrinde, den Hirnstamm und das Kleinhirn am Felsenbein über der otischen Kapsel entfernen.</li>
	<li>Ohne die otische Kapsel zu entfernen, entfernen Sie vorsichtig Teile der Cochleakapsel, beginnend am Eintritt des Nervus vestibulocochlearis in die otische Kapsel.</li>
	<li>Nach Freilegung der Cochleabasis ziehen Sie vorsichtig die Cochlea samt umgebendem Gewebe heraus. Entfernen Sie verbleibende Spiralganglien und die Stria vascularis beginnend an der Basis.</li>
	<li>Überführen Sie die Cochlea in eine 35-mm-Petri-Schale mit PBS auf einem Eisblock.</li>
	<li>Um eine optimale Gewebeviabilität zu gewährleisten, sollte die gesamte Dissektionsdauer unter 60 min liegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für 3–5 Wildtyp (WT) P0–P3-Mäuse als Kontrollen für die Axin2-LacZ-Mäuse.</li>
</ol>
2. Zell-Dissociation (modifiziert aus zuvor beschriebenen Methoden)2,10
<ol>
	<li>Platzieren Sie 50 μl sterile PBS in der Mitte einer Vertiefung einer 6-Loch-Kulturplatte ohne Beschichtung.</li>
	<li>Überführen Sie bis zu 20 Axin2LacZ/+ Cochleae in jeden 50-μl-Tropfen PBS. Für mehr als 20 Cochleae sollte ein neuer 50-μl-Tropfen PBS verwendet werden.</li>
	<li>Erwärmen Sie 50-μl-Aliquote von 0,125 % Trypsin etwa 2 Minuten lang im 37 °C-Wasserbad vor.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl vorgewärmtes 0,125 % Trypsin zu der PBS mit den Cochleae hinzu.</li>
	<li>Stellen Sie die 6-Loch-Platte 8 Minuten lang bei 37 °C, wobei darauf zu achten ist, die Platte nicht zu schütteln.</li>
	<li>Um die Trypsinisierung zu beenden, geben Sie 50 μl Sojabohnen-Trypsininhibitor zu jedem 100-μl-Tropfen hinzu.</li>
	<li>Geben Sie zusätzlich 50 μl Vollmedium (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, Ampicillin in DMEM/F12)2 hinzu.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Zellen vorsichtig 80-mal durch Auf- und Abpipettieren mit einer 300-μl-Stumpfspitze und einem P200-Pipettiergerät, das auf 125 μl eingestellt ist, wobei darauf zu achten ist, keine Blasen zu erzeugen.</li>
	<li>Nach der Homogenisierung jedes Tropfens geben Sie zusätzlich 200 μl FM zu jeder Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen durch einen blauen 40-μm-Falcon-Zellfilter in eine neue Vertiefung laufen.</li>
	<li>Überführen Sie die Zellen in Standard-Falcon-FACS-Röhrchen (etwa 300 μl verbleiben nach Homogenisierung und Filtration).
	<ol class="lalpha">
		<li>Teilen Sie die Zellen aus Wildtyp-Cochleae auf drei Röhrchen auf, wobei jeweils 100 μl mit 300 μl FM verdünnt werden. Ein Röhrchen dient als Blankokontrolle, ein weiteres wird nur mit Propidiumiodid (PI, 1 μg/ml) gefärbt (nicht in diesem Schritt hinzufügen), während das letzte mit 3-Carboxyumbelliferyl-β-D-galactopyranosid (CUG, siehe 2.15) gefärbt wird, um die Hintergrundfluoreszenz zu detektieren.</li>
		<li>Geben Sie 400 μl dissoziierte Zellen aus Axin2-LacZ-Cochleae in jedes FACS-Röhrchen. Als CUG-allein-Kontrolle verdünnen Sie 10 μl Zellen in 390 μl FM (siehe Röhrchen F in Schritt 2.15). Bringen Sie das Volumen der verbleibenden Röhrchen auf 400 μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Incubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie die CUG-Lösung vor:
	<ol class="lalpha">
		<li>Bereiten Sie für jedes FACS-Röhrchen, das gefärbt werden soll, jeweils 200 μl CUG vor.</li>
		<li>Verdünnen Sie CUG in FM im Verhältnis 1:50 in einer dunklen Abzugshaube mit minimalem Lichteinfall.</li>
		<li>Erwärmen Sie die verdünnte CUG-Lösung 3–5 Minuten lang bei 37 °C vor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Geben Sie anschließend 200 μl verdünnte CUG-Lösung in jedes entsprechende FACS-Röhrchen. Für Röhrchen, die nicht mit CUG behandelt werden sollen, geben Sie nur FM hinzu (siehe 2.15).</li>
	<li>Zu diesem Zeitpunkt sollten fünf Kategorien von Röhrchen mit folgenden Inhalten vorliegen (PI in diesem Schritt noch nicht hinzufügen):
	<ol class="ualpha">
		<li>Wildtyp – ohne CUG oder PI (für Kompensation, siehe Schritt 3.5–6)</li>
		<li>Wildtyp – nur mit PI (für Kompensation)</li>
		<li>Wildtyp – mit CUG und PI (als Kontrolle gegenüber Axin2-LacZ-Zellen)</li>
		<li>Axin2-LacZ – nur mit CUG (für Kompensation)</li>
		<li>Axin2-LacZ – mit CUG und PI (für die eigentliche Zellsortierung)</li>
		<li>Axin2-LacZ – mit CUG und PI (für die Ereignisanalyse)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schützen Sie alle Röhrchen vor Licht und inkubieren Sie sie 25 Minuten lang in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische HEPES + Fötales Rinderserum (FBS)-Lösung zur Reaktionsunterbrechung nach der Inkubation vor:
	<ol class="lalpha">
		<li>Verdünnen Sie 400 μl frisch aufgetauten FBS in 10 ml sterilem 10 mM HEPES (in PBS) in einem 15-ml-Falcon-Röhrchen.</li>
		<li>Stellen Sie das Röhrchen bis zum Abschluss von Schritt 2.16 auf Eis.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Geben Sie 1,8 ml eiskalte HEPES-Lösung unter steriler Bedingung in einem abgedunkelten Abzug zu jedem FACS-Röhrchen, um den Lichteinfall zu minimieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 1200 U/min.</li>
	<li>Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl FM; vereinigen Sie alle Aliquote für die Sortierprobe (Axin2-LacZ, gefärbt mit CUG und PI).</li>
	<li>Geben Sie PI zu jedem Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu erreichen.</li>
	<li>Stellen Sie die Zellen auf Eis und schützen Sie sie vor Licht.</li>
</ol>
3. Durchflusszytometrie
<ol>
	<li>Wir verwenden einen BD Aria II, der mit 488-nm-, 633-nm- und 407-nm-Lasern ausgestattet ist. Die Detektion von CUG erfolgte mittels des 407-nm-Violett-Lasers und die von PI mittels des 488-nm-Blau-Lasers am Stanford Shared FACS Facility.</li>
	<li>Ein geschulter Bediener eines Durchflusszytometers ist erforderlich. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, nachdem die Laser aufgewärmt, die Detektoren des Zytometers gemäß den Herstelleranweisungen kalibriert und die optimalen Sortierparameter eingestellt wurden. Nach unseren Erfahrungen ermöglicht die Verwendung einer 100-µm-Düse eine optimale Zellviabilität für nachfolgende Experimente.</li>
	<li>Folgende Parameter wurden verwendet: Schwellenwert bei 5.000 Ereignissen, Flussrate unter 3.000 Ereignissen/Sekunde, Vorwärtsstreuung (FSC) bei 125 Volt und Seitwärtsstreuung (SSC) bei 250 Volt, PE-Cy5-Kanal für PI und Cascade Blue für CUG.</li>
	<li>Spülen Sie die Zytometerkammer nacheinander jeweils zweimal mit 70 %igem Ethanol und PBS.</li>
	<li>Beginnen Sie die Analyse mit nicht angefärbten, Wildtyp-Zellen (Röhrchen A in Schritt 2.15). Sammeln Sie 1.000 Ereignisse, um die Zellverteilung im FSC- versus SSC-Diagramm zu bestimmen. Falls die Streuung nicht gewünscht ist, passen Sie die FSC- und SSC-Parameter entsprechend an.</li>
	<li>Führen Sie die Kompensation mit nicht angefärbten WT-Zellen (Röhrchen A), mit PI angefärbten WT-Zellen (Röhrchen B) und mit CUG angefärbten Axin2-LacZ-Zellen (Röhrchen D) durch. Die Kompensation ermöglicht eine genauere Unterscheidung der Signale zwischen den verschiedenen Laserwellenlängen.</li>
	<li>Beginnen Sie die Analyse mit den mit PI und CUG angefärbten Wildtyp-Zellen (Röhrchen C) und legen Sie die Gating-Parameter fest für:
	<ol class="lalpha">
		<li>Ausschluss von Trübstoffen basierend auf dem FSC- versus SSC-Diagramm.</li>
		<li>Ausschluss von Doubletts und Zellaggregaten mithilfe des FSC-Höhe- versus FSC-Fläche-Diagramms.</li>
		<li>Ausschluss von toten Zellen basierend auf dem FSC-Fläche- versus PE-Cy5-Fläche-Diagramm.</li>
		<li>Erstellen Sie ein Diagramm von FSC-Fläche versus Cascade Blue-Fläche mit beliebiger Gating-Platzierung.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analysieren Sie anschließend 10.000 Ereignisse aus dem Sortierprobenröhrchen, das Axin2-LacZ-Zellen enthält, die mit PI und CUG angefärbt wurden (Röhrchen F).
	<ol class="lalpha">
		<li>Alle mit Wildtyp-Zellen erstellten Gates sollten hier angewendet werden.</li>
		<li>Erstellen Sie anhand der Diagramme der Wildtyp-Zellen ein Gate für Cascade Blue-hohe Zellen, das weniger als 1 % der Gesamtanzahl der Ereignisse umfasst.</li>
		<li>Dieses gleiche Gate für Cascade Blue-hohe Zellen umfasst nun etwa 15–20 % der Zellen in der Axin2-LacZ-Probe, wodurch diese als Axin2-hohe Zellen definiert sind.</li>
		<li>Erstellen Sie anhand des Analyse-Diagramms der Axin2-LacZ-Zellen ein Gate für die am wenigsten fluorogenen 15–20 % der Zellen, im Folgenden als Axin2-niedrige Zellen bezeichnet.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sortieren Sie basierend auf der oben beschriebenen Gating-Strategie die Zellen in FACS-Röhrchen, die 500 µl FM enthalten – ein Röhrchen für Axin2-hohe und ein weiteres für Axin2-niedrige Zellen. Stellen Sie sicher, dass sich die Sammelröhrchen während des Sortiervorgangs in einer auf 4 °C gekühlten Kammer befinden.</li>
	<li>Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die vom Durchflusszytometer für jede Population gezählt wurden.</li>
</ol>
4. Repräsentative Ergebnisse (siehe Abbildung 2):
Mit dem oben beschriebenen Protokoll isolieren wir typischerweise 40–45 % zellfreier Präparate aus den Cochleae sowohl des Wildtyps als auch von Axin2LacZ/+ (Abbildungen 2A und B), wobei etwa 70 % davon frei von Doppelzellen sind (siehe Abbildungen 2A' und B'). Die meisten sortierten Zellen sind vital und haben kein PI aufgenommen (~95 %) (Abbildungen 2A'' und B''). Im Durchschnitt werden die oberen ~20 % der CUG-positiven Zellen als Axin2-LacZ-positive Zellen betrachtet (Abbildung 2B''') und entsprechen etwa 15.000 Axin2-LacZ-positiven Zellen pro 10–12 Tiere.
Die erneute Durchflusszytometrie-Analyse von Axin2-hoch-Zellen zeigte eine Reinheit von über 93 % im Cascade-Blau-Kanal. Um die Identität dieser Zellen weiter zu bestätigen, führten wir eine Immuncytologie nach dem Sortieren an sowohl Axin2-hoch- als auch Axin2-niedrig-Zellen mit Antikörpern gegen β-Galactosidase durch und fanden heraus, dass die Axin2-hoch-Zellen etwa 93,4 % β-Galactosidase-positive Zellen enthielten (mehr als 1.500 analysierte Zellen) und die Axin2-niedrig-Zellen etwa 4,8 % β-Galactosidase-positive Zellen enthielten.
Abbildungen und Tabellen:
<img alt="Isolierung des Gehörschnecken und LacZ-Markierung; Diagramm der Durchflusszytometrieanalyse" src="/files/ftp_upload/3432/3432fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Experimentelles Vorgehen. Die obige Abbildung zeigt die gesamte experimentelle Strategie und die verwendeten Techniken, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Gehörschnecken von Wildtyp- und Axin2LacZ/+-Mäusen werden entnommen und in Einzelzellen dissoziiert, die anschließend mit CUG, einem fluoreszierenden Substrat für β-Galactosidase, behandelt wurden. Anschließend wurden Axin2-LacZ-hohe und -niedrige Zellen mittels Durchflusszytometrie getrennt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig1large.jpg">Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieses Bildes anzusehen.</a>
<img alt="Durchflusszytometrie-Streudiagramme, Wildtyp vs. Axin2-lacZ, Trümmer, Doppelzellen, Vitalität, LacZ-Analyse." src="/files/ftp_upload/3432/3432fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Gating-Strategien. Diese Abbildung veranschaulicht die bei der Durchflusszytometrie verwendeten Gating-Strategien. A) Hier werden dissoziierte Zellen vom Wildtyp, die der gleichen Behandlung wie Axin2-LacZ-Zellen unterzogen wurden, anhand insgesamt 10.000 Ereignisse analysiert. Das erste Panel zeigt die Seitenstreufläche (SSC-A) gegenüber der Vorwärtstreufläche (FSC-A). Dabei ist eine deutliche Gruppe von Ereignissen deutlich größer als diejenigen, die näher an der y-Achse liegen. Diese Ereignisse werden als „Trümmer-negativ“ bezeichnet. Das nächste Gate, A', analysiert die „Trümmer-negativen“ Zellen aus Panel A, die 43,8 % der Gesamtanzahl der Ereignisse ausmachen (siehe Tabelle unten). In diesem Panel wird die Vorwärtstreuamplitude (FSC-H) gegenüber der FSC-A verwendet, um Doppelzellen auszuschließen. Ereignisse, die von der erwarteten linearen Natur des Diagramms abweichen, werden ausgeschlossen. Diese Aufbereitung führt typischerweise zu etwa 70 % der Ereignisse innerhalb des definierten Gates, die verbleibenden Zellen werden ausgeschlossen. Im Panel A'' wird Propidiumiodid (PI), detektiert über den PE-Cy5-Kanal, verwendet, um tote Zellen (5,3 %) zu markieren. Im nächsten Panel (A''') wird der Cascade-blue-Kanal verwendet, um das fluoreszierende Substrat CUG nachzuweisen. Hier umfassen die LacZ-hoch-Gates weniger als 1 % der Gesamtereignisse. B) Dissoziierte Zellen von Axin2-LacZ-Mäusen, die mit CUG und PI behandelt wurden, werden hier anhand insgesamt 10.000 Ereignisse analysiert. Die identischen Gates aus Panel A werden hier angewendet. B' zeigt, dass 29,5 % der Zellen als Doppelzellen ausgeschlossen werden, während B'' zeigt, dass 5,4 % nicht vital sind. Die anfänglichen Gates für LacZ-hoch- und -niedrig-Zellen werden mithilfe von Panel B''' festgelegt, wobei LacZ-hoch anfänglich auf 19,7 % und LacZ-niedrig auf 20,4 % festgelegt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3432/3432fig2large.jpg">Klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieses Bildes anzusehen.</a>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td> </td>
			<td>Ereignisnummer</td>
			<td>Prozentsatz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>Wildtyp-Analyse</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'</td>
			<td>Trümmer-negativ</td>
			<td>4,381</td>
			<td>43,80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A''</td>
			<td>Doppelzelle-negativ</td>
			<td>3,116</td>
			<td>71,10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A'''</td>
			<td>PI-negativ</td>
			<td>2,951</td>
			<td>94,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-hoch</td>
			<td>16</td>
			<td>0,54%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-niedrig</td>
			<td>2,790</td>
			<td>94,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>Axin2-LacZ-Analyse</td>
			<td>10,000</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'</td>
			<td>Trümmer-negativ</td>
			<td>4,218</td>
			<td>42,2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B''</td>
			<td>Doppelzelle-negativ</td>
			<td>2,973</td>
			<td>70,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B'''</td>
			<td>PI-negativ</td>
			<td>2,813</td>
			<td>94,6%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-hoch</td>
			<td>553</td>
			<td>19,70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>LacZ-niedrig</td>
			<td>573</td>
			<td>20,40%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. Quantitative Analysen der Gating-Strategien in Abbildung 2.

<ol><li>Li, H., Liu, H., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+from+the+adult+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med.%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear.</a> Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).</li>
<li>Oshima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+stem+cells+in+the+auditory+and+vestibular+organs+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 18-31 (2007).</li>
<li>Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Jaks, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+marks+cycling%2C+yet+long-lived%2C+hair+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.</a> Nat. Genet. 40, 1291-1299 (2008).</li>
<li>Kalani, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt-mediated+self-renewal+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Wnt-mediated self-renewal of neural stem/progenitor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16970-16975 (2008).</li>
<li>Willert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+lipid-modified+and+can+act+as+stem+cell+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors.</a> Nature. 423, 448-452 (2003).</li>
<li>Zeng, Y. A., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+proteins+are+self-renewal+factors+for+mammary+stem+cells+and+promote+their+long-term+expansion+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture.</a> Cell Stem Cell. 6, 568-577 Forthcoming.</li>
<li>Chai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+of+Lgr5%2C+a+Wnt+Target+Gene%2C+in+the+Developing+and+Mature+Mouse+Cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression of Lgr5, a Wnt Target Gene, in the Developing and Mature Mouse Cochlea.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. , Forthcoming.</li>
<li>Lustig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+loop+of+Wnt+signaling+through+upregulation+of+conductin%2Faxin2+in+colorectal+and+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative feedback loop of Wnt signaling through upregulation of conductin/axin2 in colorectal and liver tumors.</a> Mol. Cell Biol. 22, 1184-1193 (2002).</li>
<li>Diensthuber, M., Oshima, K., Heller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2Fprogenitor+cells+derived+from+the+cochlear+sensory+epithelium+give+rise+to+spheres+with+distinct+morphologies+and+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Stem/progenitor cells derived from the cochlear sensory epithelium give rise to spheres with distinct morphologies and features.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 173-190 (2009).</li>
<li>Savary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+stem%2Fprogenitor+cells+from+a+postnatal+cochlea+respond+to+Jagged1+and+demonstrate+that+notch+signaling+promotes+sphere+formation+and+sensory+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cochlear stem/progenitor cells from a postnatal cochlea respond to Jagged1 and demonstrate that notch signaling promotes sphere formation and sensory potential.</a> Mech. Dev. 125, 674-686 (2008).</li>
<li>White, P. M., Doetzlhofer, A., Lee, Y. S., Groves, A. K., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cochlear+supporting+cells+can+divide+and+trans-differentiate+into+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian cochlear supporting cells can divide and trans-differentiate into hair cells.</a> Nature. 441, 984-987 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> J. Neurosci. Methods. 164, 271-279 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Unabhängige Forschungsstudien haben eine begrenzte Regenerationskapazität in den neugeborenen Cochleae charakterisiert2,10,12,13. Mithilfe von GFP-Reporter-Mäusen und Durchflusszytometrie isolierten White und Kollegen spezifische cochleäre Stützzellen und fanden heraus, dass diese Eigenschaften von Vorläuferzellen aufweisen12.
Der kanonische Wnt-Weg wurde als Markierung für Stamm- bzw. Vorläuferzellpopulationen in mehreren Organsystemen nachgewiesen, darunter das Gehirn, ...

<table><tbody><tr><td>Petrischale, Polystyrol, steril Geriner Bio-one 35 x 10 mm &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-540 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Zellseiger, steril, BD Biosciences, blau, 40 &amp;mu;m &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>21008-949 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Puffergelösung mit ausgewogenem Salzgehalt (HBSS). Lösung mit Calcium, Magnesium und ohne Phenolrot, steril &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-456 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, Greiner Bio-One, 50 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-346 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, Greiner Bio-One, 15 ml &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-278 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serumfreies Supplement (50x), flüssig &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>N-2-Zusatz (100x), flüssig &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>bFGF, humanes basisches Fibroblastenwachstumsfaktor &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 aus Maus &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8779&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>EGF, humaner epidermaler Wachstumsfaktor &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644 &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiziertes Eagle&amp;rsquo;s Medium/Ham&amp;rsquo;s F-12 50/50 Mix: 1X, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>45000-350&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Rundbodenröhrchen, Einweg, Polystyrol, 12x75&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>60819-295&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0,25 % (1X) mit EDTA 4Na, flüssig&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>ep Dualfilter TIPS 300 µL, 960 TIPS&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Eppendorf</td><td>22491245&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor, Sojabohne, gereinigt&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003570&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 40 µm Zellseihen&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>21008-949&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Mehrfach-Platten, Polystyrol, Greiner Bio-One, unbehandelte Platten, 6 Vertiefungen&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>VWR international</td><td>82050-846&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Marker-Gen-FACS Blue Nachweiskit für LacZ-beta-Galactosidase&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td>Markergen-Technologien</td><td>M0255&lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating lacz-exprimierenden zellen aus maus innenohrgeweben mittels durchflusszytometrie

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Die Isolierung spezifischer Zelltypen ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen wie Stamm- oder Vorläuferzellen. Ein solcher Ansatz zur Untersuchung des Innenohrgewebes stellt aufgrund der geringen Anzahl der Zellen von Interesse und der wenigen transgener Reporter-Mausmodelle eine besondere Herausforderung dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, bei dem fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet werden, um LacZ-positive Zellen aus den cochleären Geweben neugeborener Mäuse gezielt zu markieren.
Die häufigste Ursache für eine sensorineurale Schwerhörigkeit ist die irreversible Schädigung und der Verlust cochleärer Sinneshaarsinneszellen, die erforderlich sind, um Schallwellen in neuronale Impulse umzuwandeln. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die auditorischen und vestibulären Organe der Maus Stamm- bzw. Vorläuferzellen enthalten, die regeneratives Potenzial besitzen könnten1,2. Diese Befunde erfordern weitere Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung spezifischer Zelltypen mit Eigenschaften von Stamm- oder Vorläuferzellen. Der Wnt-Signalweg hat sich als entscheidend für die Aufrechterhaltung von Populationen mit Stamm- bzw. Vorläuferzellcharakter in mehreren Organsystemen erwiesen3–7. Kürzlich haben wir Wnt-reaktive, Axin2-exprimierende Zellen in der neugeborenen Cochlea identifiziert, deren Funktion jedoch weitgehend unbekannt ist8.
Um das Verhalten dieser Wnt-reaktiven Zellen in vitro besser zu verstehen, haben wir eine Methode zur Isolierung von Axin2-exprimierenden Zellen aus den Cochleae von Axin2-LacZ-Reporter-Mäusen9 entwickelt. Mithilfe der Durchflusszytometrie zur Isolierung von Axin2-LacZ-positiven Zellen aus neonatalen Cochleae können wir anschließend eine Vielzahl von Experimenten an lebenden Zellen durchführen, um ihr Verhalten als Stamm- bzw. Vorläuferzellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir detailliert die Schritte zur Mikrodissektion der neonatalen Cochlea, zur Dissoziation dieses Gewebes, zur Markierung der LacZ-positiven Zellen mittels eines fluorogenen Substrats sowie zur Zellsortierung. Techniken zur Dissoziation der Cochlea in Einzelzellen und zur Isolierung cochleärer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurden bereits beschrieben2,10–12. Wir haben diese Techniken modifiziert, um einen neuartigen Protokollablauf zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus der neonatalen Cochlea zu etablieren.

Die Durchflusszytometrie ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das die Isolierung und Untersuchung spezifischer Zellpopulationen ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus cochleären Geweben neonataler transgener Mäuse. Dissociierte cochleäre Zellen wurden mithilfe fluoreszenzmarkierter Substrate der β-Galactosidase vor der Trennung mittels Durchflusszytometrie markiert.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Die Isolierung spezifischer Zelltypen ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen, wie beispielsweise Stamm- oder Vorläuferzellen. Ein solcher Ansatz zur Untersuchung von Geweben des Innenohrs ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, LAX Z-positive Zellen aus dem neonatalen Mauscochlea mithilfe der Durchflusszytometrie zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine große Anzahl von Mauscochlea in einem relativ kurzen Zeitraum isoliert wird, um die Zellen lebensfähig zu halten und ausreichend Ausgangsgewebe zu erhalten. Als zweiter Schritt werden die LAX Z-positiven Zellen dissoziiert und anschließend markiert, um das Gewebe für die Sortierung vorzubereiten.Die Zellen werden anschließend per Durchflusszytometrie sortiert. Die resultierenden Populationen mit hohem LAX Z-Gehalt und niedrigem lax-Gehalt können dann für weitere Experimente verwendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ohrenforschung zu beantworten, beispielsweise welche Genprofile oder spezifischen Zellpopulationen im Innenohr vorkommen.Den Ablauf wird Taha Gen, ein Medizinstudent aus unserem Labor, demonstrieren. Füllen Sie zunächst 35-Millimeter-Petri-Schalen mit HBSS und stellen Sie sie auf einen Eisblock. Danach, nachdem Sie mit Iris-Scheren 12 bis 15 euthanasierte, postnatale, null bis drei Tage alte Axon-, zwei-laxy-Reporter- und Wildtyp-Mäuse enthauptet haben.Platzieren Sie die Köpfe auf eine 60 Millimeter große Petrischale, die auf einem Eisblock steht. Verwenden Sie anschließend Dumont-Forceps der Größe fünf und Iris-Scheren, um den Unterkiefer und die Zunge aus den Köpfen zu entfernen, und schneiden Sie dann durch die Schädelbasis auf Höhe des Gaumens. Entfernen Sie nun die überliegende Haut des Schädels und durchtrennen Sie die Schädelbasis, indem Sie die Schere am unteren Teil des Foramen magnum bis zur Mitte des Gaumens einführen.Führen Sie mit der Schere auf beiden Seiten einen weiteren Schnitt vom geschnittenen Rand des Gaumens zur oberen Seite des Schädels durch, wobei Sie darauf achten müssen, die otische Kapsel nicht zu beschädigen. Vervollständigen Sie anschließend die Isolierung des Schläfenbeins, indem Sie zwei um 45 Grad geneigte Schnitte durchführen, die von der oberen Seite des Foramen magnum bis zum koronalen Schnitt am harten Gaumen verlaufen.Danach die isolierten Schläfenbeine in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit HBSS auf den Eisblock geben und den Eisblock in eine sterile Sterilbank transferieren. Als Nächstes eine weitere 35-Millimeter-Petri-Schale diesmal mit PBS füllen und auf den Eisblock stellen. Mit zwei Pinzetten der Größe 55 arbeiten.Beginnen Sie die Mikrodissektion, indem Sie vorsichtig die Großhirnrinde, die Hirnregionen Hirnstamm und Kleinhirn vom Schläfenbein über der Otokapsel entfernen. Danach entfernen Sie, ohne die Otokapsel zu lösen, Teile der Cochleakapsel beginnend am Eintritt des Nervus vestibulocochlearis und fortsetzend in Richtung Otokapsel. Nachdem die Basis der Cochlea freigelegt ist, ziehen Sie vorsichtig das Corti-Organ und das umgebende Gewebe heraus.Danach beginnend an der Basis, entfernen Sie alle verbleibenden Spiralganglien und Stria-vascularis-Anteile und überführen Sie die Cochlea in die mit PBS gefüllte Petrischale. Pipettieren Sie zunächst 50 Mikroliter sterilem PBS in die Mitte von ein bis zwei Vertiefungen einer nicht beschichteten sechswelligen Kulturplatte. Überführen Sie danach nicht mehr als 20 Axine, zwei laxy Cochleae in jeden Tropfen PBS.Vorher erwärmen Sie 50 µL-Aliquote von 0,125 % Trypsin etwa zwei Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad vor. Geben Sie anschließend den Trypsin hinzu zum Innenohr, wobei darauf geachtet werden muss, die Schale nicht zu schütteln.Inkubieren Sie das Cochlea bei 37 Grad Celsius für acht Minuten. Beenden Sie die Trypsinierung, indem Sie 50 Mikroliter Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zu jedem Tropfen hinzufügen, und geben Sie anschließend weitere 50 Mikroliter vollständiges Medium hinzu, nachdem Sie einen P-200-Pipettenmann auf 125 Mikroliter eingestellt haben. Verwenden Sie eine stumpfe Pipettenspitze mit 300 Mikroliter, um die Zellen vorsichtig 80 Mal umzusetzen, wobei darauf geachtet werden sollte, keine Blasen zu erzeugen.Danach, nachdem jede Tröpfchenportion jeweils aufgebrochen wurde, weitere 200 Mikroliter Vollmedium zu jedem hinzufügen. Die Zellen nun durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb in eine neue Vertiefung desselben Sechswell-Platte überführen und anschließend die Zellen aus jeder Vertiefung in individuelle Standard-FACS-Röhrchen übertragen.Fügen Sie anschließend 100 µL Wildtyp-Zellen in jeweils drei Reagenzgläser hinzu, gefolgt von einer Verdünnung mit 300 µL Vollmedium nur für die CUG. Verdünnen Sie als Kontrolle 10 µL Axon, zwei LAX Z-Zellen in 390 µL Vollmedium. Überführen Sie die verbleibenden Axon-Zwei-LAX-Z-Zellen in Fax-Röhrchen in 400 µL OTs.Anschießend die Reagenzgläser 10 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C inkubieren, danach 200 µL verdünntes CUG jedem entsprechenden FACS-Röhrchen hinzufügen. Danach, unter Lichtschutz für alle Röhrchen, die Zellen 25 Minuten lang in einem feuchten Inkubator bei 37 °C inkubieren. Während der Inkubation der Zellen für die Färbung 10 mL frisch zubereitete Heaps plus FBS in ein 15-mL-Röhrchen geben und das Röhrchen auf Eis stellen.Anschließend 1,8 Milliliter der eiskalten Heap-Lösung unter der sterilen Haube bei ausgeschaltetem Licht zu jedem der Fax-Röhrchen hinzufügen, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Danach die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1200 U/min zentrifugieren. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 300 Mikrolitern Vollmedium. Vereinigen Sie alle Aliquots der Sortierprobe und geben Sie Propidiumiodid in jedes geeignete Gefäß, um eine Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erreichen. Schließlich, nachdem die Zellen erneut abgedeckt wurden, stellen Sie sie erneut auf Eis. Richten Sie die Sortiertore ein, indem Sie zunächst 1000 Ereignisse der nicht angefärbten Wildtyp-Zellen sammeln, um die Zellverteilung im Vorwärts- versus Seitenstreuplot zu bestimmen.Passen Sie die Parameter für Streuung nach vorne und zur Seite nach Bedarf an. Kompensieren Sie anschließend mit der nicht angefärbten Wildtyp-, PI-gefärbten Wildtyp- und CUG-gefärbten Axonprobe. Zwei LAX Z-Zellen.Füllen Sie zwei FACS-Röhrchen mit jeweils 500 Mikrolitern Vollmedium. Starten Sie dann die Analyse mit den mit PI gefärbten Wildtyp-Zellen und den mit Calcofluor White CUG gefärbten Axon-Zellen. Legen Sie das Tor zur Ausschluss von Trümmern anhand des Vorwärts-Scatter- versus Seiten-Scatter-Diagramms fest. Schließen Sie Doppelzellen und Zellklumpen mithilfe des Vorwärts-Scatter-Höhe- versus Vorwärts-Scatter-Fläche-Diagramms aus.Schließen Sie dann die PI-positiven toten Zellen basierend auf dem Streulichtvorwärts-Areal im Vergleich zum PE-sci-fünf-Areal-Plot aus. Richten Sie für jede Gatterposition eine Darstellung des Streulichtvorwärts-Areals gegenüber dem Cascade- oder Pacific-Blau-Areal ein. Analysieren Sie 10.000 Ereignisse aus dem Sortierprobenröhrchen, das axon zwei laxy PI- und CUG-gefärbte Zellen enthält, unter Verwendung aller mit den Wildtyp-Zellen festgelegten Gatter und der Plots der Wildtyp-Zellen.Erstellen Sie Tore für Cascade-Blau-hohe Zellen, die weniger als 1 % der Gesamtanzahl an Ereignissen ausmachen. Die Cascade-Blau-hohen Tore sollten nun etwa 15 bis 20 % der Zellen in der Axon-two-laxy-Probe enthalten. Erstellen Sie unter Verwendung dieser Axon-two-hohen Zellen und des Axon-two-laxy-Zellanalyse-Plots nun ein Tor für die am wenigsten fluoreszierenden 15 bis 20 % der Zellen, indem Sie die zuvor genannte Gating-Strategie anwenden.Sortieren Sie die Zellen in die FACS-Röhrchen mit vollständigem Medium ein, wobei die Sammelröhrchen während des Sortierens in einer auf vier Grad Celsius gekühlten Kammer gehalten werden. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die vom Durchflusszytometer für jede Population in diesen beiden Abbildungen erfasst wurden. Die Seitenstreufläche im Vergleich zur Vorwärtsstreufläche der dissoziierten Wildtyp-Zellen auf der linken Seite und von axon zwei LA Z auf der rechten Seite.Kochleazellen werden gezeigt. Beachten Sie die Gating-Abgrenzung der unterschiedlichen Ereignisgruppen, die deutlich größer sind als die Ereignisse näher an der Y-Achse, die als die Trümmer-negative Population gekennzeichnet sind. Typischerweise werden 40 bis 45 % trümmerfreie Zellen sowohl aus der Wildtyp- als auch aus der axin zwei LAX Z-Kochlea in diesen beiden Darstellungen gewonnen.Die Höhe des Forward Scatter im Verhältnis zur Fläche des Forward Scatter wird verwendet, um Doppelereignisse aus dem zuvor selektierten Zelltrümmern auszuschließen. Negative Populationsevents, die von der erwarteten linearen Natur des Diagramms abweichen, werden ausgeschlossen. Diese Aufbereitung ergibt typischerweise 71,1 % der Ereignisse innerhalb des definierten Gates. Hier. Propidiumiodid, detektiert über den PE SCI Fünfkanal, wird verwendet, um tote Zellen auszuschließen, wie in diesen Streudiagrammen beobachtet. Etwa 95 % der sortierten Zellen waren vital und nahmen in diesen Darstellungen kein PI auf. Der Cascade-Blau-Kanal wurde verwendet, um das fluoreszierende Substrat CUG nachzuweisen, wie in der Abbildung rechts zu sehen.Im Durchschnitt sind die oberen etwa 20 % der CUG-positiven Zellen die laxy hohen Zellen, die etwa 15.000 Axone entsprechen, zwei hohe Zellen pro 10 bis 12 Tiere. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man laxy hohe Zellen mittels Durchflusszytometrie aus Innenohrgeweben isoliert und vorbereitet, sowohl für Zell-Turing-Experimente als auch für Experimente wie Genexpression-Analysen.

isolating-lacz-expressing-cells-from-mouse-inner-ear-tissues-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Entzündung spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass es wie ein zweischneidiges Schwert wirkt, das frühe Hirnverletzungen verschlimmert, aber auch zur späteren Reparatur beiträgt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn und ihre anschließende durchflusszytometrische Phänotypisierung.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Es besteht ein wachsendes Interesse an der quantitativen Charakterisierung von intestinalen Lymphozyten, da zunehmend erkannt wird, dass diese Zellen eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Darm- und systemischen Erkrankungen spielen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie einzelne Zellpopulationen aus verschiedenen Dünndarmkompartimenten für die anschließende durchflusszytometrische Charakterisierung isoliert werden können.

Isolierung und Durchflusszytometrie Charakterisierung von murinen Dünndarms Lymphozyten

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus die induktive Stätten wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe Peyer Patches und mesenterialen Lymphknoten und der Effektor-Websites einschließlich der Lamina Propria und der Darmepithel des kleinen intestinalen Immunsystems.

Isolieren von Lymphozyten aus der Maus kleinen intestinalen Immunsystems

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung globaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Hirnmikroglia. Die Arbeit enthält auch das Mikroglia-Isolationsprotokoll, das für die Datenerhebung verwendet wurde.

Quantifizierung globaler posttranslationaler Histonmodifikationen mittels intranukleärer Durchflusszytometrie in isolierten Mikroglia des Mausgehirns

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&amp;RUN) geeignet ist.

Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Lernen Sie die Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus dem Innenohr neugeborener Mäuse mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Analyse spezifischer Zellpopulationen für die Hörforschung.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Weitere Videos entdecken