Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

Hallo, ich bin Jersey. Hallo, mein Name ist Shabi und wir sind beide Postdoktoranden am Imperial College of London und arbeiten mit Professor Andrew Di Melo und Dr. Josh Del an mikrofluidischen Tröpfchenplattformen. Tröpfchenbasierte mikrofluidische Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für Experimente mit höherem Durchsatz, da sie bei sehr hohen, genau definierten Volumina erzeugt werden können und ihre Konkurrenz die Erzeugungsfrequenz bis zu mehreren Kilo pro Jahr betragen kann.

Da der interessierende Bereich bereits nach wenigen Litern in Kompartimenten eingekapselt werden kann, können sowohl Übersprechen als auch Dispersion eliminiert werden, und analytische Prozesse können mit größerer Genauigkeit geplant werden. In unserer Gruppe haben wir bereits erfolgreich Mikrotröpfchen-Plattformen in vielen Anwendungen implementiert. Zum Beispiel die Polymerase-Kettenreaktion, die Nanopartikelsynthese und der Einzelmolekularzell-Assay.

Die großen Mengen an Informationen, die in diesen Systemen generiert werden, müssen effizient extrahiert, genutzt und genutzt werden. In dieser Hinsicht sollte das Nachweisverfahren der Wahl richtig sein, eine hohe Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen bieten, auf eine Reihe von Molekülspezies anwendbar sein, zerstörungsfrei sein und in der Lage sein, auf einfache Weise in mikrofluidische Geräte integriert zu werden. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir eine Reihe von experimentellen Werkzeugen und Protokollen entwickelt, die die Extraktion großer Mengen physikalischer Informationen aus Umgebungen mit kleinen Volumina ermöglichen und für die Analyse einer Vielzahl von physikalischen, chemischen und biologischen Toren anwendbar sind.

In diesem Protokoll stellen wir Methoden vor, die auf die Detektion einzelner Zellen und die Abbildung von Mischprozessen in Dropbox angewendet werden. Mikrofluidische Chips werden traditionell in Polydimethyl-Sloane-PGMS mit Hilfe von Photolithographie-Methoden hergestellt. Dieser Prozess sollte in einer Reinraumanlage durchgeführt werden, um mikrofluidische Kanäle Spinco, SU 8 50 auf einem Siliziumwafer weiches Backen auf einer Heizplatte bei 65 Grad und 95 Grad zu erhalten, um das Lösungsmittel zu verdampfen und den Film nach dem Abkühlen zu verdichten, die SU acht zu belichten, mit UV-Strahlung unter der entsprechenden Maske zu widerstehen, Und dann die Waffel nach dem Abkühlen bei 65 Grad und 95 Grad backen.

Entwickeln Sie die nicht belichteten Bereiche mit der entsprechenden Entwicklungslösung unter Rühren. Verwenden Sie frisches EC-Lösungsmittel, um den Wafer zu spülen, und trocknen Sie ihn dann unter Gas, um eine saubere Oberfläche zu erzeugen. Behandeln Sie den Wafer mit Hexan- und Methanolwaschmitteln.

Um den Esat-Master-Herstellungsprozess abzuschließen, verdampfen Sie ein Festsetzungsmittel 40 Minuten lang in einem Trockenmittel auf die Oberfläche. Um strukturierte mikrofluidische Substrate zu bilden, mischen wir S guard 1 8 4 in einem Verhältnis von 10 zu eins aus Harzvernetzer und ziehen diesen über den Master. Entgasen Sie dieses in einem Trockenmittel und härten Sie das Gerät bei 65 Grad aus.

Schneiden Sie das ausgehärtete PDMS ab und ziehen Sie es vom Master ab. Erstellen Sie Zugangslöcher für Fluidikschläuche mit einem Biopsiestempel. Härten Sie eine weitere Schicht PDMS 20 Minuten lang bei 65 Grad aus.

Legen Sie die vorbereitete Deckschicht auf die untere Schicht und härten Sie sie über Nacht bei 65 Grad aus. Die Chips aus der Petrischale schälen und würfeln. Sobald die Chips hergestellt sind, können sie durch Aufgießen der gewünschten Lösungen verwendet werden.

Füllen Sie die Spritzen mit den erforderlichen Lösungen und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Teilen des Schlauchs verbleiben. Für die Tröpfchenerzeugung werden zwei Phasen verwendet. Die wässrige dispergierte Phase enthält die interessierenden Reagenzien.

Die Ölphase fungiert als kontinuierlicher Phasenpassschlauch mit dem gleichen Innendurchmesser wie die Spritzennadelspitzen an einem Ende der Nadeln, montieren Sie die Spritzen auf einer Spritzenpumpe und definieren Sie die gewünschte Infusionsflussrate. Für jede Phase wird ein Mindestverhältnis der ölwässrigen Durchflussraten von eins empfohlen, um eine Benetzung des PDMS durch die wässrige Phase zu vermeiden, die zu einer instabilen Tröpfchenbildung führen würde. Verbinden Sie die anderen Enden des Schlauchs direkt mit den Löchern, die in das PDMS-Substrat gestanzt sind.

Für komplexere Lösungen können auch Kieselsäuren, Kapillaranschlüsse oder Steckverbinder implementiert werden. Verbinden Sie den Auslassanschluss des Chips mit dem Schlauch und leiten Sie ihn direkt in einen Auffangbehälter für die Abfallsammlung oder die weitere Analyseverarbeitung. Sobald dies eingerichtet ist, gibt es zwei Hauptkonfigurationen von Mikrokanälen, um eine Tröpfchenströmungsfokussierung oder ein T-Übergangsformat zu erzeugen, als Ergebnis der schieren Kräfte, die sich aus der Verwendung dieser Geometrien ergeben, um die beiden zulässigen Flüssigkeiten zusammenzubringen, und der anschließenden Kapillaren, die sich in der Grenzfläche entwickeln.

Ein paar disperse Tröpfchen von nur wenigen Femtolitern werden spontan erzeugt. Sobald die Tröpfchen erzeugt sind, können sie mit einem optischen Aufbau untersucht werden. Das optische System ist nach folgendem Protokoll aufgebaut.

Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit automatisierter Submikrometer-Positionierungskapazität und einen Laser, der mit einer Wellenlänge arbeitet, die der Absorption der beteiligten Fluor-Tropfen entspricht. Um sie anzuregen, verwenden Sie einen Pulslaser, der mit Wiederholraten von mehreren Megahertz für die Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung arbeitet. Phlegm-Experimente verwenden Strahllenkungsspiegel und Optiken, um die Strahlhöhe sowie die Strahlrichtung zu steuern.

Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel, um den Laserstrahl in die Objektivlinse zu reflektieren. Werden zwei Laser gleichzeitig eingesetzt, kann ein Dualband-Diic-Spiegel installiert werden. Um die Reflexion der beiden Laserstrahlen zu ermöglichen, verwenden Sie ein unendlich korrigiertes NA-Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur, um das Laserlicht innerhalb eines mikrofluidischen Kanals auf einen engen Fokus zu bringen.

Sammeln Sie die von der Probe emittierte Fluoreszenz innerhalb des mikrofluidischen Kanals unter Verwendung desselben Objektivs mit hohem NA-Gehalt und übertragen durch denselben dichroitischen Spiegel. Entfernen Sie alle verbleibenden Anregungslichtreste mit einem Ein- oder Zweiband-Emissionsfilter. Fokussieren Sie die Fluoreszenzemission auf eine 75-Mikrometer-Lochblende.

Mit einer plankonvexen Linse. Positionieren Sie die Lochblende in der Konfokalebene des Mikroskopobjektivs. Verwenden Sie einen weiteren dichroitischen Spiegel, um das Fluoreszenzsignal auf zwei Detektoren aufzuteilen.

Filtern Sie die vom dichroitischen Spiegel reflektierte Fluoreszenz mit einem Emissionsfilter und fokussieren Sie sie mit einer konvexen Plaino-Linse auf den ersten Detektor. Bei Experimenten mit einem sekundären roten Fluor wird die vom diic-Spiegel übertragene Fluoreszenz mit einem anderen Emissionsfilter gefiltert und dann mit einer weiteren plankonvexen Linse auf den zweiten Detektor fokussiert. Verwenden Sie Avalanche-Photodioden zur Detektion von Fluoreszenzphotonen.

Für die Fluoreszenzdatenerfassung koppeln Sie das elektronische Signal vom Lawinen-Fotodiodendetektor an ein Multifunktions-Datenerfassungsgerät für die Datenaufzeichnung, das auf einem PC ausgeführt wird. Verwenden Sie für Schleimexperimente einen Pulslaser und schließen Sie die Detektoren an eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung TCS PC-Karte an, die auf einem separaten PC läuft. Mit dieser Karte können die Daten zur Lebensdauer der Fluoreszenz abgerufen werden.

Verwendung einer TCS-PC-Methodik. Jedes detektierte Fluoreszenzphoton wird mit einem einfallenden Laserpuls korreliert und daher jedem emittierten Fluoreszenzphoton eine Verzögerungszeit zugewiesen. Diese Daten können an eine einzelne oder mehrere exponentielle Zerfallskurven angepasst werden, um eine Abschätzung der Strahlungsrate der Fluorophore zu erhalten.

Wir wissen heute, dass Zellen sowohl aus biologischer, physikalischer als auch aus chemischer Sicht sehr heterogen sind. Daher sollten wir im Idealfall jede Zelle einzeln analysieren. Die Assays sollten jedoch mit einem höheren Durchsatz durchgeführt werden, damit wir genügend quantitative Informationen sammeln können, um zu einer zuverlässigen und aussagekräftigen Schlussfolgerung zu kommen.

Hier haben wir ein Beispiel für eine Verkapselung von E-Coli-Zellen in einem einzigen Tröpfchen, so dass wie es durchgeführt werden kann. Verwenden Sie einen E-Coli-Stamm der Top 10, der über Nacht kultiviert wurde. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erkennen, verwenden Sie Cytoneun und Propidiumiodid.

Bei beiden Farbstoffen handelt es sich um DNA-Interkollationsfarbstoffe, deren Fluoreszenzintensität um mehr als das 20-fache zunimmt. Bei der Bindung an die DNA ist Cyto Nine ein grüner Fluoreszenzfarbstoff, der membrandurchlässig und Propidiumiodid ist. Es handelt sich um einen rot fluoreszierenden Farbstoff, der membranundurchlässig ist.

So fluoreszieren lebende Zellen grün, während tote Zellen sowohl grüne als auch rote Emissionen aufweisen. Hier sehen wir die Tröpfchenerzeugung und eine Einzelzellverkapselung mit einem T-Übergang. Dieses Video wurde mit einer Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen, aber Tröpfchen können mit einer Geschwindigkeit von Tausenden pro Sekunde erzeugt werden.

Bei der Verkapselung von Zellen muss man darauf achten, dass die Kultur der Zellen so verdünnt wird, dass weniger Zellen als Tröpfchen entstehen, dass die Zellen nicht sedimentieren, was in der Spritze oder im Schlauch passieren kann. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab in der Spritze, um die Zellen gleichmäßig in der Lösung zu verteilen. Verwenden Sie einen sehr dünnen Schlauch von 50 Mikrometern, um die Spritze mit dem Mikrochip zu verbinden.

Dies sorgt für eine schnelle Durchflussrate im Inneren des Schlauchs und verhindert somit ein Sedimentieren der Zellen. Hier sind die typischen Beispiele für Fotozählungen als Funktion der Zeit für die zellbasierten Experimente. Zur Abbildung von Mischprozessen innerhalb von Tröpfchen.

Tröpfchen können mit zwei verschiedenen Fluorvieren mit unterschiedlicher Lebensdauer erzeugt werden. Innerhalb eines fließenden Tropfens wird ein Strömungsfeld erzeugt, das schließlich die beiden ursprünglich getrennten Lösungen vermischt, um den Mischprozess zu verbessern. Die Symmetrie des Strömungsfeldes kann durch den Einsatz von Wickelkanälen verändert werden.

Um die Tröpfchen zu untersuchen, fokussieren Sie das Volumen der optischen Sonde auf die halbe Höhe eines Mikrokanals, entlang dessen Tröpfchen fließen, beginnend von einer Seite des Kanals, und führen Sie jedes Experiment über die gesamte Breite des Kanals durch. In Abständen von einem Mikrometer. Implementieren Sie einen Algorithmus, um einzelne Bursts, die mit Tröpfchen verbunden sind, vom Rauschhintergrund der Ölphase zu unterscheiden und die Dauer der einzelnen Bursts zu bestimmen.

Implementieren Sie einen zweiten Algorithmus, um die Verzögerungszeit- und Intensitätswerte entlang der Länge jedes Tröpfchens bei der bestimmten Breite zu extrahieren, in der das Experiment durchgeführt wurde. Verwenden Sie dann einen MLE-Algorithmus mit Maximum-Likelihood-Schätzer, um die Fluoreszenzlebensdauer jedes Tröpfchens im Experiment zu bewerten. Durch die Mittelung der Lebensdauerwerte für alle Tröpfchen im Experiment wird der endgültige Fehler der MLE-Berechnung reduziert.

Je mehr Tröpfchen untersucht werden, desto kleiner ist der Fehler, sobald eine Lebensdauerkurve erhalten wurde. Kombinieren Sie für jede Breite alle Trajektorien in einer 2D-Map. Da jeder Lebenszeitwert mit einer bestimmten Mischung der beiden Flora Fours verbunden ist, kann so eine Konzentrations- bzw. Mischungskarte erhalten werden.

Wir haben die Herstellung eines Mikrobauelements und den experimentellen Aufbau und die zugehörigen Protokolle für die Bildung von Mikrotröpfchen und die Bereichsverkapselung und die optische Detektion des Prozesses, der Tröpfchen, beschrieben. Die beiden Beispiele wählten die Detektion für einzelne Zellen in Tröpfchen und die Abbildung der Mischprozesse. Im Inneren stellt das fließende Tröpfchen gängige Anwendungen dar, die derzeit mit der Tröpfchen-Mikrofluidik untersucht werden.

Wie die vorgestellten Experimente veranschaulichen, weist der Einsatz von Tröpfchen-Mikrofluidik-Plattformen bestimmte attraktive Eigenschaften auf, wie z.B. einen hohen Durchsatz, einen perfekten Einschluss und eine höhere Reproduzierbarkeit. Die große Menge an produzierten Informationen und die höchste Geschwindigkeit, mit der diese Informationen generiert werden. DU erforderte den Einsatz schneller Detektionsmethoden mit höchster räumlicher und zeitlicher Auflösung, wenn der volle Nutzen aus diesen miniaturisierten Plattformen gezogen werden soll.

In diesem Fall zeigen wir, dass dies mit hochpräzisen fluorspektroskopischen Techniken möglich ist.