Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Synthese von alkylatstabilisierten Goldnanopartikeln, die als Monolayer-geschützte Cluster oder MPCs bekannt sind, und die Montage dieser Materialien zu Dünnschichtanordnungen, die als Absorptionsgrenzfläche für die Elektrochemie von Azarin-Protein-Monolayern verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Goldkolloide mit organischen Liganden geschützt werden, um Goldnanopartikel zu erzeugen, die von einem Alcan-Phorat-Film umgeben sind. Anschließend werden die MPCs auf Gold- und Glassubstraten verankert und zu dünnen, mehrschichtigen, kovalent verknüpften Filmen vernetzt, deren Wachstum durch optische und elektrochemische Messungen sowie durch Querschnittsmikroskopie verfolgt wird.

Dann wird das Elektronentransferprotein Azarin an der Grenzfläche absorbiert und eine zyklische Vault-Telemetrie für die Protein-Monolayer-Elektrochemie durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die durch dieses Verfahren erzeugten MPC-Filmgrenzflächen eine optimierte elektrochemische Analyse von Adsorbproteinen auf Basis der MPC-Schicht ermöglichen, wodurch eine homogenere Adsorptionsgrenzfläche und eine schnelle Elektronentransferkinetik bereitgestellt werden, die keine traditionelle Abstandsabhängigkeit aufweist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen Proteinelektrochemie besteht darin, dass Elektroden, die bei Nanopartikelfilmen modifiziert werden, eine Absorptionsgrenzfläche bieten, die zu einem idealeren elektrochemischen Verhalten führt, wie es durch Zyklenphotometrie gemessen wird.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Synthese wichtige visuelle Hinweise enthält, während die Filmkonstruktion und -charakterisierung mehrere komplizierte Schritte und Analysetechniken umfasst. NPC-Folien können auf modifizierten Goldelektroden oder Glasobjektträgern montiert werden, indem ein Tauchzyklusverfahren verwendet wird, bei dem MPC-Schichten und dile linking Moleküle abwechselnd verwendet werden. Und so können diese Schichten elektrochemisch oder optisch auf eine gewünschte Schichtdicke verfolgt werden.

Um Goldcluster unter einem Abzug mit geeigneter Belüftung zu synthetisieren, lösen Sie zunächst 1,1 Gramm Tetraoxid-Ammoniumbromid in 30 Millilitern Toluol, lösen Sie 0,38 Gramm Natriumborahhydrid in etwa 20 Millilitern ultrareinem Wasser mit 18 Megaohm und lassen Sie es mindestens 30 Minuten lang auf Eis abkühlen. Als nächstes wird eine Lösung von Tetrachlorwasserstoff quantitativ in die Tetraid-Ammoniumbromid-Toluol-Lösung überführt, wobei weitere fünf Milliliter ultrareines Wasser verwendet werden. Um die wässrige Goldlösung phasenweise in die nichtwässrige Lösung zu überführen, verschließen Sie sie leicht und rühren Sie sie 30 Minuten lang streng um.

So sind die gebrannte orangefarbene wässrige und die klare nichtwässrige Phase gut vermischt. Sowohl die klare wässrige als auch die gebrannte orangefarbene nichtwässrige Phase werden in einen Scheidetrichter überführt. Die wässrige Schicht wird entsorgt und die nichtwässrige Schicht in einen sauberen Kolben umgefüllt.

C, sechs und ein Verhältnis von zwei zu eins zu dem Tetrachlorwasserstoff oder der Menge, die die nichtwässrige Lösung enthält, hinzufügen. 30 Minuten lang rühren, um ein goldenes Polymer zu bilden, das sich durch einen Farbwechsel von rötlich-orange zu einer blassgelben, fast farblosen Lösung bemerkbar macht. Das Reaktionsgemisch wird in ein isoliertes Eisbad überführt und unter quantitativem Rühren mindestens 30 Minuten lang auf null Grad Celsius abgekühlt und die gekühlte Natriumborhydridlösung schnell zum Reaktionsgemisch gegeben, um Gold eins in Gegenwart der Oberschenkel zu einem metallischen Gold zu reduzieren.

Nach der Zugabe bildet es sofort eine dicke schwarze Lösung aus monoschicht-geschützten Goldclustern oder MPCs. Rühren Sie die Reaktion am nächsten Tag über Nacht bei null Grad Celsius um. Das Reaktionsgemisch in einen Scheidetrichter überführen.

Die wässrige Schicht in ein Abfallbecherglas geben und drehen. Die nichtwässrige Toluolschicht wird nahezu vollständig trocken verdampft, wobei ein schwerer schwarzer Schlamm im Kolben verbleibt. Die MPCs werden durch Zugabe von Acetonitril ausgefällt und die Lösung über Nacht ziehen gelassen, wobei eine Glasfritte mittlerer Porosität mit Gummibeschlägen und ein Seitenarmkolben mit einem Aspirator

Sammeln Sie MPCs durch Vakuumfiltration und spülen Sie mit einer großen Menge Acetonitril. Nach dem elektrochemischen Zusammenbau der Sandwichzelle reinigen Sie das Goldsubstrat, indem Sie in den Potentialfenstern von 0,2 bis 0,9 Volt, 0,2 bis 1,2 Volt und 0,2 bis 1,35 Volt 100 Millivolt pro Sekunde in einer Lösung aus 0,1 molar Schwefelsäure und 0,01 molar Kaliumchlorid zyklische Telemetrie oder CV durchführen. Messen Sie den Doppelschicht-Ladestrom des gereinigten blanken Goldsubstrats, indem Sie CV unter Standardbedingungen durchführen, einschließlich eines Potentialfensters von 0,1 bis 0,4 Volt im Vergleich zu Silbercychlorid, das mit 100 Millivolt pro Sekunde in Kaliumphosphatpuffer oder KPB gescannt wird.

Entsorgen Sie den Puffer und spülen Sie ihn zweimal übermäßig mit ultrareinem Wasser und Ethanol aus. Setzen Sie das gereinigte Goldsubstrat etwa 300 Mikrolitern fünf Millimolar C sechs Lösung in Ethanol aus und lassen Sie es über Nacht einwirken, um ein geordnetes C sechs Sam zu bilden. Entsorgen Sie die C 6-Lösung aus der Zelle und spülen Sie sie zweimal übermäßig mit Ethanol und ultrareinem Wasser aus.

Messen Sie den Ladestrom des SAM unter Standardbedingungen. Entsorgen Sie den KPB und spülen Sie ihn zweimal übermäßig mit ultrareinem Wasser und Ethanol aus. Der Ladestrom sollte deutlich verringert werden.

Ausgehend von den Messungen des blanken Goldes wird das SAM-modifizierte Goldsubstrat etwa 300 Mikrolitern einer Fünf-Millimol-ZfP-Lösung in Ethanol ausgesetzt und eine Stunde lang ruhen gelassen, um die ZfP-Verknüpfungsmoleküle innerhalb des C sechs Sam zu dispergieren. Entsorgen Sie die ZfP-Lösung und spülen Sie zweimal übermäßig und gründlich mit Ethanol und ultrareinem Wasser als einmal mit Diam-Methan. Das Goldsubstrat wird einer MPC-Lösung aus DIAM-Methan unter Rühren ausgesetzt, indem es eine Stunde lang langsam mit Stickstoffgas gefüllt wird.

Dies ist die verankernde MPC-Schicht der Folienbaugruppe. Die MPC-Lösung verwerfen und nacheinander erneut mit Dichlormethan, ultrareinem Wasser und KPB spülen. Messen Sie den Ladestrom der MPC-Schicht unter Standardbedingungen.

Entsorgen Sie das KPB und spülen Sie es übermäßig mit ultrareinem Wasser und DIAM-Methan aus. Setzen Sie das Goldsubstrat etwa 300 Mikrolitern einer fünf millimolaren ZfP-Lösung in DIAM-Methan unter Rühren aus, indem Sie es 20 Minuten lang langsam mit Stickstoffgas blasen. Entsorgen Sie die zerstörungsfreie Prüfung und spülen Sie sie gründlich mit DIAM-Methan, um die zweite MPC-Schicht abzuscheiden.

Tauchen Sie die Folienbaugruppe wieder in die MPC-Lösung von DIAM-Methan und lassen Sie sie unter Rühren ruhen, indem Sie sie eine Stunde lang langsam mit Stickstoffgas sprudeln, bevor Sie sie spülen. Messen Sie dann den Ladestrom der MPC-Schicht erneut unter Standardbedingungen und spülen Sie erneut mit dem gleichen Verfahren. Bei Bedarf können Sie weitere MPC-Schichten ablegen.

Nachdem die vernetzte MPC-Folie fertig ist, spülen Sie das filmmodifizierte Substrat mit KPB, um das AZ-Protein auf der MPC-Filmanordnung zu absorbieren. Injizieren Sie etwa 150 Mikroliter fünf- bis 10-mikromolare AZ-Lösung in KPB in die E-Chem-Sandwichzelle und lassen Sie sie mindestens eine Stunde lang verschlossen und gekühlt ruhen. Nachdem die ECM-Zelle wieder Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie sie gründlich mit KPB aus, füllen Sie die ECM-Zelle wieder mit KPB und blasen Sie die KPB 10 Minuten lang mit Stickstoffgas auf.

Führen Sie elektrochemische Monolayer-Studien wie CV im Potentialfenster von minus 0,25 Volt bis 0,25 Volt durch. Mit 100 Millivolt pro Sekunde in KPB Rinse A 3M PT MS modifizierter Objektträger mit DIAM-Methan gescannt und eine Stunde lang in eine MPC-Lösung aus DIAM-Methan gelegt, während er auf einem Shaker bei niedriger Geschwindigkeit gerührt wird. Dies vervollständigt die erste MPC-Schicht der Folienanordnung, indem MPCs an den ME-Captan-Endgruppen des Sand verankert werden.

Spülen Sie den Objektträger gründlich mit Dior-Methan ab, trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas und nehmen Sie ein UV-Vis-Spektrum des Objektträgers nach dem Einweichen des Objektträgers in ZfP-Lösung in Diam-Methan auf. Legen Sie den Objektträger eine Stunde lang in MPC-Lösung, während Sie auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit gerührt werden. Damit ist die zweite MPC-Schicht der Folienanordnung abgeschlossen.

Spülen Sie den Objektträger gründlich mit DIAM-Methan, trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas ab und nehmen Sie ein UV-Vis-Spektrum des Objektträgers. Die Absorption über das gesamte Spektrum sollte zunehmen, wenn zusätzliche MPC-Schichten von der Folienanordnung absorbiert werden. Zum Anbringen einer MPC-Folie, die auf einem 3M PT MS modifizierten Glasobjektträger montiert ist, auf einem Standard-Objektträger.

Bereiten Sie das eingebettete Epoxidharz 12 vor und lassen Sie es mindestens 12 Stunden lang eindicken. Füllen Sie eine Strahlkapsel mit Epoxidharz und invertieren Sie sie auf die MPC-Filmprobe. Üben Sie Druck auf die Kapsel aus, so dass eine Blase an die Oberseite der Kapsel aufsteigt und eine Abdichtung zwischen dem Epoxidharz und der MPC-Filmprobe entsteht.

Lassen Sie es mindestens 18 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren und kühlen Sie dann die montierten Objektträger auf Raumtemperatur ab. Erhitzen Sie die montierten Dias 20 Sekunden lang auf einer Heizplatte aus Aluminiumguss bei 200 Grad Celsius, um die Entnahme des Blocks mit der beigefügten MPC auf Schnellfolie zu erleichtern. Schneiden Sie die Probe mit dem Film mit einer Juweliersäge vom Strahlkapselblock ab, indem Sie den entfernten Teil in einer Silikon-Flachform mit der MPC-Folie nach oben zum Inneren des Siliziums abschneiden.

Füllen Sie das Silikon bei Raumtemperatur gut mit Epoxidharz und lassen Sie es mindestens 18 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren. Rufen Sie die Probe dann auf Raumtemperatur auf. Schneiden Sie dünne Probenabschnitte von 60 bis 80 Nanometern auf einem Leica UCT Ultramikrotom, indem Sie mit einem Diamantmesser Abschnitte senkrecht zur Messerkante schneiden, platzieren Sie geschnittene Abschnitte auf einer Form VAR-Carbon-Trägerfolie auf 400-Mesh-Kupfergittern und nehmen Sie TEM-Bilder von den Querschnitten der gezeigten MPC-Folienbaugruppen auf.

Hier sind die Ergebnisse der Doppelschicht-Ladestromüberwachung des MPC-Folienwachstums für insgesamt fünf Tauchzyklen, bei denen MPC- und NDT-Lösungen abwechselnd ausgesetzt wurden. Die Ladeströme steigen mit jedem Tauchzyklus systematisch an. Hinzufügen von MPC-Schichten zum Film.

Hier ist ein typischer zyklischer Volta Graham für AZ Add Absorb zu einer MPC-Filmanordnung, die unter Verwendung eines Potentialfensters von minus 0,25 bis plus 0,25 Volt gesammelt und mit 100 Millivolt pro Sekunde in 4,4 Millimolar Kaliumphosphatpuffer gescannt wurde. Eine repräsentative spektrale UV-Vis-Überwachung des Wachstums einer diolgebundenen MPC-Schicht auf einem 3M PT MS modifizierten Objektträger ist hier dargestellt. Ein Tauchzyklus besteht aus der Belichtung des Objektträgers mit ZfP-Linkerlösung, gefolgt von der Exposition mit MPC-Lösung.

Jeder weitere Einbruch führt zu einer Zunahme der Schichtdicke und einer gleichzeitigen Erhöhung der Absorption. Diese Abbildung zeigt eine transmissionselektronenmikroskopische Querschnittsbildanalyse einer DIA-verknüpften MPC-Filmanordnung. Der Einschub zeigt ein typisches TEM-Bild von Hexamethol-funktionalisierten MPCs, die in der TEM-Analyse der Filmmontage verwendet werden.

Mit Hilfe von Bild J wurde der durchschnittliche Goldkerndurchmesser der MPCs auf etwa zwei Nanometer bestimmt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MPC Golden Narrow Par von Filmen synthetisiert, charakterisiert und zusammensetzt, die als Schnittstelle für die Absorption und anschließende elektrochemische Analyse von Redoxproteinen dienen. Der Prozess der Filmassemblierung lässt sich leicht anpassen, indem das MPC-Syntheseverfahren sowie der Mechanismus der inneren Partikelbindung manipuliert werden, um die Absorption einer Vielzahl von Proteinen zu ermöglichen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Elektrochemie der Proteinabsorption auf modifizierten synthetischen Plattformen geben kann, kann sie auch auf die Entwicklung von Elektronentransfer-Modellierungssystemen, Biosensorsystemen und synthetischen biokompatiblen Materialien angewendet werden.