Synthesis, Assembly und Charakterisierung von Monolayer Protected Gold-Nanopartikeln Films für die Protein-Monoschicht Elektrochemie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, alkylierte, stabilisierte Goldnanopartikel herzustellen, die als einlagig geschützte Cluster oder MPCs bekannt sind, und diese Materialien in dünne Schichtstrukturen zu integrieren, die als Absorptionsinterface für die Elektrochemie von Azarin-Einzelmembranen verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Goldkolloide mit organischen Liganden geschützt werden, um Goldnanopartikel zu erzeugen, die von einem Alkanthiolat-Film umgeben sind. Anschließend werden die MPCs auf Gold- und Glasuntergründen verankert und zu dünnen, mehrschichtigen, kovalent vernetzten Filmen verbunden, deren Wachstum mittels optischer und elektrochemischer Messungen sowie querschnittlicher Mikroskopie verfolgt wird.

Dann wird das Elektronentransferprotein Azurin an der Grenzfläche adsorbiert, und die zyklische Voltammetrie wird zur Elektrochemie der Proteinmonoschicht durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die durch dieses Verfahren erzeugten MPC-Schichtgrenzflächen eine optimiertere elektrochemische Analyse des adsorbierten Proteins auf Basis des MPC-Films ermöglichen und eine homogenere Adsorptionsgrenzfläche sowie schnelle Elektronentransferkinetik bieten, die nicht von der traditionellen Distanzabhängigkeit beeinträchtigt ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen Proteinelektrochemie liegt darin, dass Elektroden, die mit Nanopartikelfilmen modifiziert sind, eine Adsorptionsgrenzfläche bereitstellen, die zu einem idealeren elektrochemischen Verhalten führt, wie durch zyklische Voltammetrie gemessen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Synthese wichtige visuelle Hinweise enthält, während die Filmherstellung und Charakterisierung mehrere komplexe Schritte und analytische Techniken umfasst. NPC-Filme können durch eine Tauchzyklus-Methode mit abwechselnden MPC-Schichten und Dile-Verbindungsmolekülen auf modifizierten Goldelektroden oder Glasobjektträgern aufgebaut werden. Anschließend können diese Schichten elektrochemisch oder optisch bis zu einer gewünschten Filmdicke verfolgt werden.

Zur Synthese von Goldclustern unter einem Abzug mit geeigneter Belüftung zunächst 1,1 Gramm Tetrabutylammoniumbromid in 30 Milliliter Toluol lösen, dann 0,38 Gramm Natriumborhydrid in etwa 20 Milliliter 18-Megaohm-ultrareinem Wasser lösen und mindestens 30 Minuten auf Eis abkühlen lassen. Anschließend eine Lösung von wässrigem Tetrachloroaurat quantitativ unter Verwendung von zusätzlichen fünf Milliliter ultrareinem Wasser in die Tetrabutylammoniumbromid-Toluollösung überführen. Um den Phasentransfer der wässrigen Goldlösung in die nichtwässrige Lösung zu ermöglichen, leicht verschließen und 30 Minuten lang kräftig rühren.

So werden die bräunlich-orangefarbenen wässrigen und die klaren nichtwässrigen Phasen gut vermischt. Überführen Sie beide Phasen – die klare wässrige und die bräunlich-orangefarbene nichtwässrige – in einen Trenntrichter. Entsorgen Sie die wässrige Schicht und dekantieren Sie die nichtwässrige Schicht in einen sauberen Kolben.

Gebe C6 und ein Verhältnis von zwei zu eins zur wasserfreien Lösung mit Tetra-chloro-wasserstoff oder enthaltendem Ratenanteil hinzu. Rühre 30 Minuten lang um, um ein Gold(I)-Polymer zu bilden, das durch eine Farbänderung von rötlich-orange zu einer blassgelben, nahezu farblosen Lösung nachgewiesen wird. Überführe das Reaktionsgemisch in ein isoliertes Eisbad und kühle es unter Rühren mindestens 30 Minuten lang auf null Grad Celsius. Füge anschließend die gekühlte Natriumborhydrid-Lösung quantitativ und schnell dem Reaktionsgemisch hinzu, um Gold(I) in Gegenwart von Oberschenkeln zu metallischem Gold zu reduzieren.

Nach der Zugabe bildet sich sofort eine dicke, schwarze Lösung einkerngeschützter Goldcluster oder MPCs. Rühren Sie die Reaktion am folgenden Tag über Nacht bei null Grad Celsius. Überführen Sie das Reaktionsgemisch in einen Trenntrichter.

Entfernen Sie die wässrige Phase in einen Abfallbecher und drehverdampfen Sie die nichtwässrige Toluol-Phase bis nahezu zur Trockene, wobei ein dichter schwarzer Schlamm im Kolben zurückbleibt. Fällen Sie die MPCs durch Zugabe von Acetonitril aus und lassen Sie die Lösung über Nacht stehen, wobei Sie einen Glasfritte mit mittlerer Porosität mit Gummiverbindungen und einen Seitenarmkolben mit Wasserstrahlpumpe verwenden.

Sammeln Sie die MPCs durch Vakuumfiltration und spülen Sie sie mit einer großen Menge Acetonitril ab. Reinigen Sie das Goldsubstrat, nachdem die Sandwichzelle elektrochemisch montiert wurde, durch zyklische Voltammetrie oder CV in den Potentialfenstern von 0,2 bis 0,9 Volt, 0,2 bis 1,2 Volt und 0,2 bis 1,35 Volt mit einer Scanrate von 100 Millivolt pro Sekunde in einer Lösung aus 0,1 molarer Schwefelsäure und 0,01 molarer Kaliumchloridlösung. Messen Sie den Doppelschicht-Ladestrom des gereinigten blanken Goldsubstrats durch Durchführung einer CV unter Standardbedingungen, die ein Potentialfenster von 0,1 bis 0,4 Volt gegen Silber/Chlorid beinhalten, gescannt mit 100 Millivolt pro Sekunde in Kaliumphosphatpuffer oder KPB.

Entfernen Sie den Puffer und spülen Sie zweimal gründlich mit ultrareinem Wasser und Ethanol. Geben Sie etwa 300 Mikroliter einer fünf Millimolar C6-Lösung in Ethanol auf das gereinigte Goldsubstrat und lassen Sie es über Nacht stehen, um einen geordneten C6-SAM zu bilden. Entfernen Sie die C6-Lösung aus der Zelle und spülen Sie sie zweimal gründlich mit Ethanol und ultrareinem Wasser ab.

Messen Sie den Lade-Strom des SAM unter Standardbedingungen. Entsorgen Sie das KPB und spülen Sie zweimal gründlich mit ultrareinem Wasser und Ethanol aus. Der Lade-Strom sollte deutlich abgenommen haben.

Im Vergleich zu den Messungen an blankem Gold wird das SAM-modifizierte Goldsubstrat etwa 300 Mikroliter einer fünf Millimol-Lösung von NDT in Ethanol ausgesetzt, und man lässt es eine Stunde lang stehen, um die Verteilung der NDT-Verbindungsmoleküle innerhalb des C6-SAM zu ermöglichen. Entsorgen Sie die NDT-Lösung und spülen Sie das Substrat gründlich zweimal übermäßig mit Ethanol und ultrareinem Wasser, danach einmal mit Diammethan. Setzen Sie das Goldsubstrat einer MPC-Lösung in Diammethan unter Rühren aus, indem Sie eine Stunde lang langsam Stickstoffgas durchbläuen.

Dies ist die verankernde MPC-Schicht der Filmbaueinheit. Entsorgen Sie die MPC-Lösung und spülen Sie erneut nacheinander mit Dichlormethan, ultrareinem Wasser und KPB. Messen Sie den Ladestrom der MPC-Schicht unter Standardbedingungen.

Entsorgen Sie das KPB und spülen Sie es großzügig mit ultrareinem Wasser und DIAM-Methan. Setzen Sie das Goldsubstrat etwa 300 Mikrolitern einer fünf Millimolar-NDT-Lösung in DIAM-Methan unter Rühren durch langsames Blasen von Stickstoffgas für 20 Minuten aus. Entsorgen Sie das NDT und spülen Sie gründlich mit DIAM-Methan, um die zweite MPC-Schicht abzuscheiden.

Bringen Sie die Film-Anordnung erneut in die MPC-Lösung aus DIAM-Methan ein und lassen Sie sie unter Rühren durch langsames Durchblubbern mit Stickstoffgas eine Stunde lang stehen, vorherige Spülungen. Messen Sie dann erneut den Ladestrom der MPC-Schicht unter Standardbedingungen und spülen Sie erneut mit dem gleichen Verfahren. Tragen Sie gegebenenfalls zusätzliche MPC-Schichten auf.

Nachdem der vernetzte MPC-Film vollständig ist, spülen Sie das modifizierte Substrat mit KPB, um das AZ-Protein auf der MPC-Film-Struktur zu adsorbieren. Injizieren Sie etwa 150 Mikroliter einer fünf bis zehn Mikromolar AZ-Lösung in KPB in die E-Chem-Sandwichzelle und lassen Sie diese mindestens eine Stunde verschlossen und gekühlt stehen. Nachdem die ECM-Zelle Raumtemperatur erreicht hat, spülen Sie sie gründlich mit KPB aus, füllen die ECM-Zelle erneut mit KPB und spülen das KPB zehn Minuten lang mit Stickstoffgas durch.

Führen Sie monolagige elektrochemische Untersuchungen wie CV im Potentialbereich von minus 0,25 Volt bis 0,25 Volt durch. Scannen Sie mit 100 Millivolt pro Sekunde in KPB. Spülen Sie einen mit 3M PT MS modifizierten Objektträger mit DIAM-Methan und geben Sie ihn für eine Stunde in eine MPC-Lösung aus DIAM-Methan, während er auf einem Schüttler mit niedriger Geschwindigkeit agitiert wird. Damit ist die erste MPC-Schicht der Filmbildung abgeschlossen, indem MPCs an die ME-Captan-Endgruppen des Substrats gebunden werden.

Spülen Sie den Objektträger gründlich mit Dior-Methan, trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas ab und nehmen Sie ein UV/Vis-Spektrum des Objektträgers auf, nachdem Sie den Objektträger in NDT-Lösung in Diam-Methan getaucht haben. Geben Sie den Objektträger eine Stunde lang in MPC-Lösung und schütteln Sie ihn dabei bei niedriger Geschwindigkeit. Damit ist die zweite MPC-Schicht der Filmbildung abgeschlossen.

Spülen Sie den Objektträger gründlich mit DIAM-Methan, trocknen Sie ihn mit Stickstoffgas und nehmen Sie ein UV/Vis-Spektrum des Objektträgers auf. Die Absorption über das gesamte Spektrum sollte ansteigen, wenn zusätzliche MPC-Schichten auf der Filmbeschichtung adsorbiert werden. Um einen auf einem mit 3M PT MS modifizierten Glasobjektträger aufgebauten MPC-Film auf einen Standardmikroskopobjektträger aufzubringen.

Stellen Sie das Einbettungsharz aus 12 Epoxydharz her und lassen Sie es mindestens 12 Stunden lang andicken. Füllen Sie eine Kapsel mit dem Epoxidharz und stülpen Sie diese auf die MPC-Folienprobe umgekehrt auf. Üben Sie Druck auf die Kapsel aus, sodass eine Blase an die Oberseite der Kapsel aufsteigt und eine Abdichtung zwischen dem Epoxidharz und der MPC-Folienprobe entsteht.

Lassen Sie es mindestens 18 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren und kühlen Sie die eingebetteten Objektträger anschließend auf Raumtemperatur ab. Erhitzen Sie die eingebetteten Objektträger 20 Sekunden lang auf einer aus Gusstaluminium bestehenden Heizplatte bei 200 Grad Celsius, um das Entfernen des Blocks mit dem befestigten MPC auf dem Schnellfilm zu erleichtern. Schneiden Sie die Probe, die den Film enthält, vom Strahlkapselblock mit einer Feinsäge ab und gießen Sie den entfernten Teil in eine flache Silikonform, wobei die Seite des MPC-Films nach oben zeigt und der Innenseite der Form zugewandt ist.

Füllen Sie die Silikonmulde bei Raumtemperatur mit Epoxidharz und lassen Sie es mindestens 18 Stunden bei 60 Grad Celsius polymerisieren. Danach bringen Sie die Probe wieder auf Raumtemperatur. Schneiden Sie dünne Probenschnitte von 60 bis 80 Nanometern an einem Leica-UCT-Ultramikrotom unter Verwendung eines Diamantschneidmessers, wobei die Schnitte senkrecht zur Schneidkante erfolgen. Legen Sie die geschnittenen Abschnitte auf eine Formvar-Kohlenstoff-Trägerfolie auf Kupfergittern mit 400 Maschen und nehmen Sie TEM-Aufnahmen der Querschnitte der MPC-Schichtsysteme auf, wie gezeigt.

Hier sind die Ergebnisse der Überwachung des Doppelschicht-Ladestroms beim Wachstum des MPC-Films über insgesamt fünf Tauchzyklen, die abwechselnde Exposition gegenüber MPC- und NDT-Lösungen beinhalten. Die Ladeströme nehmen mit jedem Tauchzyklus systematisch zu. Es werden weitere MPC-Schichten auf den Film aufgebracht.

Hier ist ein typisches zyklische Volta-Graham für AZ, bei dem Absorptionsmittel zu einer MPC-Schichtanordnung hinzugefügt wird, die unter Verwendung eines Potentialbereichs von minus 0,25 bis plus 0,25 Volt, mit 100 Millivolt pro Sekunde gescannt, in 4,4 Millimolar Kaliumphosphatpuffer gesammelt wurde. Eine repräsentative UV-Vis-Spektrenüberwachung des Wachstums einer diolverknüpften MPC-Schicht auf einem mit 3M PT MS modifizierten Objektträger wird hier gezeigt. Ein Tauchzyklus besteht aus der Exposition des Objektträgers gegenüber einer NDT-Verknüpfungslösung, gefolgt von der Exposition gegenüber einer MPC-Lösung.

Jeder nachfolgende Tauchvorgang führt zu einem Anstieg der Schichtdicke und einer gleichzeitigen Zunahme der Absorption. Diese Abbildung zeigt eine Analyse des Querschnitts einer mittels DIA verknüpften MPC-Schichtanordnung mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Die Einlage zeigt ein typisches TEM-Bild von hexamethol-funktionalisierten MPCs, die in der TEM-Analyse der Schichtanordnung verwendet wurden.

Unter Verwendung von ImageJ wurde der durchschnittliche Goldkern-Durchmesser der MPCs auf etwa zwei Nanometer bestimmt. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man MPC-Goldfilmbeschichtungen synthetisieren, charakterisieren und zusammenbauen kann, die als Grenzfläche für die Absorption und anschließende elektrochemische Analyse von Redoxproteinen dienen. Der Filmherstellungsprozess lässt sich leicht anpassen, indem man das MPC-Syntheseverfahren sowie den Mechanismus der inneren Partikelvernetzung variiert, um die Absorption einer breiten Palette von Proteinen zu ermöglichen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Elektrochemie der Proteinadsorption an modifizierten synthetischen Plattformen ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf die Entwicklung von Modellierungssystemen für den Elektronentransfer, Biosensorsysteme und synthetische biokompatible Materialien anwenden.