Name: Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Lernen Sie quantitative RNAi-Screens in C. elegans für genomweite Genfunktionsanalysen. Diese automatisierte Methode identifiziert Gene der angeborenen Immunität gegen Pilzinfektionen.

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Wir danken D. Braendle, CL Kurz und F. Montañana-Sanchis für ihre Beiträge. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse aus dem ANR und dem Conseil Regional PACA und institutionelle Förderung von INSERM und CNRS unterstützt.

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<li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, e1000105-e1000105 (2008).</li>
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<li>Morton, E., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+MATLAB-based+computational+tools+for+automated+analysis+of+COPAS+Biosort+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A suite of MATLAB-based computational tools for automated analysis of COPAS Biosort data.</a> Biotechniques. 48, xxv-xxx (2010).</li>
<li>Rohlfing, A. K., Miteva, Y., Hannenhalli, S., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+activation+of+osmosensitive+gene+expression+mimics+transcriptional+signatures+of+pathogen+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological activation of osmosensitive gene expression mimics transcriptional signatures of pathogen infection in C. elegans.</a> PLoS One. 5, e9010-e9010 (2010).</li>
<li>Lee, K. Z., Kniazeva, M., Han, M., Pujol, N., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fatty+acid+synthase+fasn-1+acts+upstream+of+WNK+and+Ste20%2FGCK-VI+kinases+to+modulate+antimicrobial+peptide+expression+in+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The fatty acid synthase fasn-1 acts upstream of WNK and Ste20/GCK-VI kinases to modulate antimicrobial peptide expression in C. elegans epidermis.</a> Virulence. 1, 113-122 (2010).</li>
<li>Duverger, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-automated+high-throughput+approach+to+the+generation+of+transposon+insertion+mutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A semi-automated high-throughput approach to the generation of transposon insertion mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 35, e11-e11 (2007).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Ruzanov, P., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+SAGE+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deep SAGE analysis of the Caenorhabditis elegans transcriptome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3252-3262 (2010).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+a+dish%3A+high-throughput+analyses+of+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Infection in a dish: high-throughput analyses of bacterial pathogenesis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 10-16 (2007).</li>
<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 10414-10419 (2006).</li>
<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Das Labor arbeitet mit Ewbank Union Biometrica und Modul-Bio.

<p class="jove_content"&gt; Das aktuelle Protokoll ermöglicht großflächige RNAi-Screening in<em&gt; C elegans</em&gt; Auf festen Medien, unter Verwendung des Niveaus der Expression von einem fluoreszierenden Reporter-Gen als ein Auslesen. Es wurde mit automatisierten Tools optimiert worden, um Hochdurchsatz-Assays ermöglichen, was eine einfache und schnelle Handhabung einer großen Zahl von Proben, in einer effizienten, zuverlässigen und reproduzierbaren Art und Weise. Andere Methoden sind beschrieben worden, dass nicht so stark auf automatisierte Handhabung flüssige Probe<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein wichtiger organisatorischer Aspekt des Protokolls war die Entwicklung einer robusten Methode der Probe-Tracking durch die Anpassung der kommerziellen MBioLIMS Software zur RNAi-Screen Verfahren in Zusammenarbeit mit der Firma ModulBio. In jedem Stadium des Verfahrens werden die Platten nun von Barcodes innerhalb des LIMS generiert identifiziert. Da die LIMS zeichnet auch die Identität der Klone in jeder Vertiefung auf jeder Platte, und zwar von gut putativen Gens ist einfach. Und darüber hinaus, so dass die LIMS-Anbindung an die Datenbank der Gemeinschaft WormBase, direkter Zugang zum molekularen und funktionellen Daten über ein bestimmtes Gen. Das LIMS ermöglicht auch Analysen auf der Platte oder sogar Chromosom und des gesamten Genoms Ebene geführt werden. Für diese Analysen werden die Daten in einer Weise, die vollständig kompatibel mit zuvor beschriebenen Instrumente wie COPAmulti ist gespeicherten<sup&gt; 16</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein kritischer Punkt in der experimentellen Verfahren ist die Einstellung der Menge des Lebensmittels relativ zu der Anzahl von Würmern. Für viele Tests ist es wichtig, dass Würmer nicht am Ende des Experiments verhungern aber es ist auch wichtig, nicht zu viel zu essen zu Beginn haben. Wir haben beobachtet, dass eine hohe Dichte von Lebensmitteln Fluoreszenzinduktion abnimmt in dem Protokoll mit Schnecken tragenden p<em&gt; NLP-29</em&gt; :: GFP-Reporter. Dies könnte auf eine verminderte Effizienz Infektion, wenn Würmer in zu viel Bakterien kultiviert werden (BS, unveröffentlichte Ergebnisse). Gleichzeitig ist die Kulturbedingungen der RNAi-Bakterien auch wichtig, da sie bestimmt, ob dsRNA auf einem optimalen Niveau erzeugt wird. Einige Protokolle für eine groß angelegte RNAi erfordern Kultur der RNAi-Klone auf Agarplatten vor Aussaat Flüssigkulturen<sup&gt; 8</sup&gt;. Wir erhalten robuste Gen-Silencing Weglassen diesen Schritt. Wir entschieden uns für den Anbau eines Überschusses von jeder Kultur, um eine homogene Ergebnisse zu gewährleisten. Das in der Tat beschrieben wird, liefert genügend Material Anspruch 2 oder 3 Bildschirme parallel durchzuführen. Im Interesse der Erlangung der robustesten Ergebnisse bevorzugen wir jedoch, die Durchführung von Bildschirmen in zweifacher Ausfertigung mit unabhängigen Kulturen von Würmern, RNAi-Bakterien und Pilzsporen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein weiterer kritischer Schritt ist die Verwendung von Medium, das weder zu feucht noch zu trocken ist, verwandt. Wenn die Platten nicht trocken genug sind, wird die RNAi-Bakterien nicht richtig trocknen und Würmer werden während des Tests zu schwimmen. Dies kann Probleme verursachen. Zum Beispiel werden Würmer nicht effizient infiziert<em&gt; D. coniospora</em&gt; In Flüssigkeit (C Couillault, unveröffentlichte Ergebnisse). Auf der anderen Seite, auf trockener Platten, die Osmolarität der Kulturmedium erhöht. Dies hat direkte Auswirkungen auf Wurm Physiologie<sup&gt; 17</sup&gt;, Einschließlich der Induktion von einigen antimikrobiellen Peptid-Gene, wie z. B.<em&gt; NLP 29</em&gt;<sup&gt; 18</sup&gt;. Das Volumen verwendet, um Würmer und Sporen zu verzichten ist entscheidend für die effektive und schnelle Trocknung zu ermöglichen. Wenn mehr als 10 l Flüssigkeit auf frische Platten hinzugefügt wird, können die Brunnen viele Stunden dauern, um zu trocknen. Dies kann bedeuten, dass es schwierig, Roboter-Methoden verwenden, um Würmer zu den Platten hinzuzufügen ist. Zum Beispiel wird jeder Wurm durch die Biosort in der Umgebung von 1 ul Flüssigkeit abgegeben. Aktuell vertreiben wir die Würmer manuell als dass erlaubt uns auch, die Tendenz von Würmern in der Lösung in das Sediment zu überwinden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Wir zuvor berichtet eine Anpassung der Biosort das erlaubt eine 96-Well-Platte auf in 36 Minuten analysiert werden<sup&gt; 19</sup&gt;. Die Maschinenhersteller UBI nun eine Änderung der Biosort zur weiteren Verringerung der Messzeit. Mit dem &quot;FastReFlex&quot;, werden die Proben direkt durch die Flußzelle zur Analyse weitergeleitet, unter Umgehung des Bubble-Sperrfilter. Dies führt zu einer erheblichen Verringerung der Zeit für die Datenerfassung, eine gesamte Platte kann in 22 min ermöglicht etwa 20 Platten pro Tag behandelt werden analysiert werden. Wenn die Platten nicht eingefroren wurden, jedoch würde es eine 8-Stunden-Intervall zwischen dem ersten und letzten sein. Angesichts der relativ kurzen Dauer des Experiments, mit der Infektion dauert nur 18 Stunden, wäre dies eine unzulässige Variable über Platten einzuführen. Nicht nur, dass das Einfrieren Platten vor der Analyse dieses Problem lösen, aber es ist auch wichtig, im Rahmen der High-Throughput-Analysen, mit dem aktuellen Protokoll und Standard-Liquid-Handling-Roboter, 2 Personen problemlos verarbeiten kann bis zu 50 Platten pro Woche. Derzeit haben wir routinemäßig Bildschirm 30 Platten der Woche, die einen gesamten Genoms Bildschirm ermöglichtauf einmal in weniger als 2 Monate durchgeführt werden.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Ein interessantes Merkmal dieses Protokolls ist die Tatsache, dass es feste Agar verwendet, so dass Tests, die nicht in flüssiger Kultur durchgeführt werden können. Als Wurm Physiologie unterscheidet sich in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen<sup&gt; 20,21</sup&gt;, Leistung bringen zu können Assays, die auf einem festen Medium kann auch ergänzen üblichen Flüssig-Bildschirme. Für bestimmte Phänotypen (zB Bewegung), kann die Analyse dann direkt mit 96-Well-Platten festen Medium durchgeführt. Für den aktuellen Bildschirm jedoch als Biosort kann nicht von einem festen Medium Platten Probe werden Würmer erste Flüssigkeit vor dem Einfrieren zu übertragen. Auf der anderen Seite ermöglicht die COPAS Biosort eine Multiparameter quantitative Analyse mit der Messung der Vielzahl von Phänotypen. Es ist wahrscheinlich, dass für einen bestimmten Bildschirm nicht alle gemessenen Parameter wird die primäre Auslesen sein. Dennoch können diese Messungen aus verschiedenen Gründen nützlich. Sie ermöglichen, zu bestimmen, ob der Assay richtig ausgeführt. Zum Beispiel kann man auf der Anzahl und Größe von Würmern in jeder Vertiefung zu überprüfen. Nur dort, wo ein RNAi-Klon soll Wachstum oder Fortpflanzung blockieren sollte es eine Abweichung von den erwarteten Werten sein. Wells mit weniger als 20 Würmer oder / und Tiere 30% kleiner (TOF) mit einem Standard verglichendard Kontrolle ohne Auswirkungen auf das Wachstum (<em&gt; ZB GFP (RNAi</em&gt;)) Kann von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Die Funktion dieser Klone können adressiert mit einer alternativen Protokoll, wobei Würmer zur RNAi-Bakterien ausgesetzt sind, werden nach ihrer Entwicklung ist weit fortgeschritten<sup&gt; 15</sup&gt;. Die verschiedenen Parameter können auch verwendet werden, um Kandidaten-Gen (HIT) Auswahl, zum Beispiel zu verfeinern, die Begrenzung Treffern nur jenen, die grüne Fluoreszenz, aber nicht rot zu beeinflussen. Die genaue Methode zur Auswahl gewählt wird, gespielt von der Art des Bildschirms und sein genaue Auslesen ab. Angesichts der Komplexität der Daten aus einer quantitativen genomweiten Screen erzeugt, kann die Zusammenarbeit mit einem Statistiker erforderlich sein.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Das Protokoll beschreiben wir können leicht auf andere Arten von Tests angepasst werden. Zum Beispiel, an der Infektionsstelle Schritt<em&gt; D. coniospora</em&gt; Konnte von keinem anderen Erreger in der Lage, auf festen Medien infizieren ersetzt werden. Dies ist möglicherweise sinnvoll, da wir festgestellt, dass viele der Virulenzfaktoren wichtig für Serratia marcescens-Infektion in flüssiger Kultur spielen keine Rolle bei der Infektion auf festem Medium (E. Pradel, persönliche Mitteilung) haben. Das Protokoll ist auch vollständig kompatibel mit Tests von Chemikalien Verbindungen<sup&gt; 22-24</sup&gt;, Oder um Verbindungen mit Bioaktivität mit verschiedenen Bibliotheken von Bakterien identifizieren<sup&gt; 25</sup&gt;, So sollten Sie einen allgemeinen Nutzen in der<em&gt; C elegans</em&gt; Forschungs-Community.</p

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9518 </td><td></td></tr><tr><td> Bactopepton </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 211677 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AeraSeal Klebefolie </td><td> Dutscher </td><td> 760214 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0481 </td><td></td></tr><tr><td> K 2 HPO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 96-well-Platte </td><td> Thermo Scientific </td><td> AB-0932 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-Platte flach </td><td> FALCON </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Loch-Runde Platte </td><td> FALCON </td><td> 353077 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8032 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Jeder Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TECAN Roboter </td><td> TECAN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Liquidator96 TM </td><td> RAININ </td><td></td><td></td></tr><tr><td> COPAS Biosort </td><td> Union Biometrica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LIMS </td><td> Modul-Bio </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative und automatisierte hochdurchsatz-genomweiten rnai-screens in c elegans</em

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA-Interferenz ist eine leistungsfähige Methode, um Genfunktionen zu verstehen, besonders wenn bei einer gesamten Genoms Maßstab und in einem quantitativen Rahmen durchgeführt. In C. elegans kann Genfunktion sich einfach und effizient durch Zuführen Würmer mit Bakterien Expression eines dsRNA entsprechend einer spezifischen Gen-1 geklopft. Während die Erstellung von Bibliotheken von RNAi-Klone für die meisten der C. elegans Genom 2,3 öffnete den Weg für echte funktionelle Genom-Studien (siehe z. B. 4-7), sind die meisten etablierten Methoden mühsam. Moy und Kollegen haben halbautomatische Protokolle, die Genom-weiten Screens erleichtern 8 entwickelt. Der Ansatz stützt sich auf mikroskopische Bildgebung und Bildanalyse. Hier beschreiben wir ein alternatives Protokoll für eine Hochdurchsatz-Genom-weite Bildschirm auf Roboter-Handhabung von bakteriellen RNAi Klone, die quantitative Analyse unter Verwendung COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)) auf, und einintegrierte Software: Die MBioLIMS (Laboratory Information Management System von Modul-Bio) eine Technologie, die einen erhöhten Durchsatz für Datenmanagement und Sample Tracking bietet. Das Verfahren ermöglicht Bildschirme auf festem Medium-Platten durchgeführt werden. Dies ist besonders wichtig für einige Studien, wie jene Adressierung Wirt-Pathogen-Interaktionen in C. elegans, da bestimmte Mikroben nicht effizient infizieren sich Würmer in flüssiger Kultur. Wir zeigen, wie das Verfahren verwendet werden, um die Bedeutung von Genen in Anti-Pilz-angeborenen Immunität bei C zu quantifizieren elegans. In diesem Fall setzt der Ansatz auf der Verwendung eines transgenen Stamm, der eine epidermale Infektion-induzierbaren fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem GFP unter der Kontrolle des Promotors des antimikrobiellen Peptid-Gen nlp 29 und einem roten fluoreszierenden Reporter, die konstitutiv in das exprimierte Epidermis. Letzteres bietet ein internes Kontrollsystem für die funktionelle Integrität der Epidermisund unspezifische Transgen-Silencing 9. Als Kontrolle Würmer durch den Pilz infiziert sind sie fluoreszieren grün. Der Zuschlag von RNAi ein Gen für NLP-29 führt zu einer verminderten Expression Fluoreszenz nach der Infektion erforderlich. Derzeit können dieses Protokoll mehr als 3.000 RNAi Klone getestet und pro Woche analysiert werden, die Möglichkeit eröffnet, zum Screenen das gesamte Genom in weniger als 2 Monate.

Wir beschreiben ein Protokoll mit<em&gt; C elegans</em&gt; Und RNAi Fütterung Bibliotheken, die eine automatisierte Messung mehrerer Parameter, wie Fluoreszenz, Größe und die Trübung der einzelnen Würmern in einer Population erlaubt. Wir geben ein Beispiel eines Bildschirms, um Gene in Anti-Pilz-angeborenen Immunität beteiligt sind<em&gt; C elegans</em&gt;.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

Die RNA-Interferenz ist eine leistungsstarke Methode zum Verständnis der Genfunktion, insbesondere wenn sie auf einer genomweiten Ebene und in einem quantitativen Kontext durchgeführt wird. In C. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion quantitativ zu untersuchen und Eleganz auf genomweiter Ebene zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression jedes Gens mittels RNAi herunterreguliert wird. In 96-Well-Platten.Als Nächstes wird der entsprechende Test zur Genfunktion durchgeführt. In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von *Sea elegance* beurteilt, normal auf eine Pilzinfektion zu reagieren, indem die Expression eines induzierbaren fluoreszenten Reporters analysiert wird. Anschließend erfolgt eine automatisierte, quantitative Analyse mittels des Coss Bio Sort. Letztendlich zeigen die Analysen quantifizierbarer Merkmale, wie beispielsweise der Expression eines fluoreszenten Reportergens, Teilmengen von Genen auf, die für die Modulation bestimmter Signalwege sowie für die Steuerung von Entwicklung, Verhalten oder Physiologie erforderlich sind.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen zu beantworten, in denen Sie Eleganz erkennen, wie beispielsweise Entwicklung, Neurobiologie sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als die ersten groß angelegten RNA-Interferenz-Screens am Auge von der Oranger-Gruppe veröffentlicht wurden. Es erforderte erheblichen Aufwand, die benötigten Werkzeuge zu entwickeln und die Automatisierung zu perfektionieren.Ich werde die Prozedur gemeinsam mit Olivia Ti, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin und einer wissenschaftlichen Hilfskraft aus dem Labor von Jonathan Eubanks, demonstrieren. Um 10 bis 1296-Well-Platten herzustellen, bereiten Sie zunächst 100 Milliliter Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM in deionisiertem Wasser vor. Weitere Anweisungen finden Sie im schriftlichen Protokoll.Während das Medium noch warm ist, 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin und vier Millimolar IPTG hinzufügen und schnell 75 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Loch-Flachbodenplatte verteilen. Sofort nach Luftblasen in den Vertiefungen suchen und diese entfernen. Die Platten in einer feuchten Kammer bei vier Grad Celsius lagern.Bereiten Sie anschließend 96er-Tieflochplatten vor, indem Sie 1,5 Milliliter LB unter Zusatz von Ampicillin und Tetracyclin hinzufügen. Geben Sie in jedes Loch eine eindeutige Kennzeichnung oder eine Barcode-Aufklebeetikette. Decken Sie jede Platte ab und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, falls sie im Voraus vorbereitet wird; schütteln Sie die 96er-LB-Basalplatte, die das RNAI enthält.Bakterielle Klone mit Ampicillin, Tetracyclin und Glycerin versetzen und jeweils drei µL jeder bakteriellen Klonprobe in das entsprechende Loch einer zuvor vorbereiteten 96er-Tieflochplatte übertragen. Leere Löcher als Kontrollen verwenden, die 96er-Tieflochplatten mit einem Haftfolie abdecken und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubieren. Die verwendete 96er-Abbildungsplatte am Morgen nach der Übernachtkultur bei −80 °C lagern.Überführen Sie die 96-Loch-NGM-Platten von vier Grad Celsius in einen sterilen Flusskabinettschrank und lassen Sie sie fünf bis 15 Minuten lang erwärmen und trocknen. Anschließend beschriften Sie jede Platte mit dem entsprechenden Etikett oder Barcode. Entnehmen Sie die 96-Loch-Tiefkulturplatten mit den Übernachtkulturen aus dem Inkubator.Beobachten Sie die erfolgreiche Zentrifugation der wachsenden Bakterienkulturen. Die 96-Tiefbrunnenplatten fünf Minuten bei 4.000 U/min. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte scharf auf den Kopf drehen, und trocknen Sie sie anschließend schnell ab.Die Ränder der Platte auf einem Papiertuch lösen das bakterielle Pellet in der Restflüssigkeit durch Vortexen auf. Idealweise unter Verwendung eines dedizierten Agitators, sodass jede Platte exakt die gleiche Behandlung erhält. Übertragen Sie fünf Mikroliter der resuspendierten Bakterien mit einer acht- oder zwölfkanaligen Mehrkanalpipette auf die 96-Well-NGM-Platten.Vermeiden Sie es, das NGM zu berühren. Lassen Sie die Bakterien etwa zwei Stunden lang unter einem sterilen Flusskasten trocknen. Überprüfen Sie regelmäßig, um zu verhindern, dass das NGM zu trocken wird; inkubieren Sie die 96-Well-R-N-A-I-N-G-M-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer.Beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll zur Herstellung einer synchronisierten Wurm-Population, nachdem die 96-Well-R-N-A-I-N-G-M-Platten auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. Geben Sie etwa 100 bis 200 Würmer in zwei Mikroliter M-nine zu jedem hinzu. Überprüfen Sie, dass sich in jedem Well Würmer befinden.Die Würmer sollten schwimmen. Lassen Sie die Platten maximal eine Stunde lang unter einer sterilen laminaren Luftabsaugung trocknen. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig.Die Würmer sollten kriechen, nicht schwimmen. Stellen Sie die Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius. Nachdem Sie eine stark infektiöse Charge Judge Miria-Sporen ausgewählt haben.Verwenden Sie M-neun-Puffer, um die Sporen von einer neun Zentimeter großen Platte zu sammeln. Geben Sie vier Mikroliter Sporen in jedes Brunnenloch und überprüfen Sie jedes Loch auf Sporen. Die Würmer sollten schwimmen.Die Platten etwa eine Stunde lang unter einem sterilen Flusskabinett trocknen lassen. Die Platten regelmäßig überprüfen, bis die Würmer zu kriechen beginnen. Anschließend die infizierten Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius stellen.Überprüfen Sie die Würmer vor der Analyse, indem Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop schnell auf eine erfolgreiche Entwicklung, eine gute GFP-Induktion in den Negativkontrollen und eine verminderte GFP-Fluoreszenz in den Positivkontrollbrunnen beobachten. Falls die Induktion gut ist, übertragen Sie die Würmer mit einem 8- oder 12-Kanal-Multikanalpipettiergerät zusammen mit 100 Mikrolitern 50 Millimolar NACL und 0,05 % Triton in eine neue, beschriftete oder mit Barcode versehene 96-Well-Rundbodenplatte.Gefrieren Sie die Platten bei minus 80 Grad Celsius ein, bis zur Analyse. Am Tag der Analyse tauen Sie die gefrorenen Platten bei Raumtemperatur auf. Sobald die Platten aufgetaut sind, führen Sie die automatisierte Analyse mit dem COPA bios durch.Die Sortt-Maschine behandelt die Platte wohldefiniert pro Mulde und analysiert die Parameter jedes Wurms, beispielsweise deren Fluoreszenz. Übertragen Sie die aus dem COPA-Bios-Sortt gewonnenen Informationen in eine Excel-Datei, um die Datenqualität zu überprüfen. Speichern Sie anschließend die Rohdaten, einschließlich optischer Dichte, axialer Länge und fluoreszierender Emissionen, in einem LIMBS-Paket für nachfolgende detaillierte quantitative Analysen.In diesem Experiment exprimierten transgene Würmer konstitutiv einen P call 12 ds red-Reporter und ein induzierbares PNLP 29 GFP. Die Reporterwürmer wurden 48 Stunden lang einer Kontrolle oder einem A-G-F-P-R-N-A eye-Klon ausgesetzt. Die Felder auf der linken Seite zeigen nicht infizierte Würmer, diejenigen auf der rechten Seite Würmer 18 Stunden nach Infektion mit D spora.Wenn der Phänotyp von Interesse die Expression eines GFP-Reporters ist, bieten Wells mit dem GFP-RNAi-Klon eine robuste Kontrolle. COPA bios SORTT erzeugt numerische Daten für jeden analysierten Wurm. Diese Diagramme zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung für jedes Well transgener Würmer an.Konstitutiv exprimierende p call 12 DS rot-Reporter und ein induzierbarer PNLP 29 GFP-Reporter nach RNAI und Infektion mit Diaspora. Der Sortierer analysiert die Flugzeit (TOF), die der Größe der Würmer entspricht, die rote Fluoreszenz sowie das Verhältnis der grünen Fluoreszenz zur TOF. Bestimmte Klone rufen Wachstumsdefekte hervor und/oder beeinflussen die Expression von P 12 DS rot.Andere beeinflussen spezifisch die FP-Expression. Zum Beispiel zielt dieser bestimmte Klon auf das Gen NS Y ab, das zuvor als wichtig für die Regulation von NLP 29 identifiziert wurde. Grüne und rote Fluoreszenz sowie TOF werden in willkürlichen, aber konstanten Einheiten gemessen.Eine der Neuerungen dieses Protokolls ist die Verwendung von gefrorenen Platten, um deren Analyse zu verschieben. Das Einfrieren ermöglicht es, die Platten bis zu zwei Wochen lang zu lagern, ohne die Ergebnisse wesentlich zu verändern, wie hier gezeigt. Obwohl sich die absoluten Werte der gemessenen Fluoreszenz ändern können, bleiben ihre relativen Verhältnisse ähnlich. Vier Würmer, die die Transgene PNLP-29-GFP und P-call-12-dsRed tragen, wurden entweder mit Diaspora infiziert oder nicht. Nach 18 Stunden wurde jede Platte grob in zwei Hälften geteilt; eine Hälfte wurde sofort analysiert, die andere Hälfte wurde 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius eingefroren und anschließend aufgetaut. Für jede Probe wurden Analysewerte für die durchschnittliche Größe, Trübung sowie grüne und rote Fluoreszenz berechnet.Der Graph zeigt das Verhältnis des Mittelwerts der infizierten zu den nicht infizierten Proben für die hier gezeigten gefrorenen und lebenden Proben. Aus Duplikatanalysen einer repräsentativen Platte ergeben sich die normalisierten Fluoreszenzverhältnisse für jede Vertiefung, wobei es sich um den Fluoreszenzmittelwert einer Vertiefung dividiert durch den gestutzten Mittelwert der Platte handelt. Sobald der Protokollablauf beherrscht ist, kann eine Gruppe von zwei bis drei Personen innerhalb von zwei bis drei Monaten einen genomweiten Screen durchführen.Die erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls erfordert viel gute Teamarbeit. Die Mitglieder meiner Gruppe haben einen enormen Aufwand betrieben, um ein effizientes und relativ einfach durchzuführendes Protokoll zu erstellen.

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