Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genfunktion quantitativ zu testen und Eleganz auf einer genomweiten Skala zu sehen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression jedes Gens durch das RNA-Auge heruntergefahren wird. In 96-Well-Platten.

Als nächstes wird der entsprechende Test auf die Genfunktion durchgeführt. In diesem Beispiel wird die Fähigkeit der Meereselesie, normal auf Pilzinfektionen zu reagieren, durch die Analyse der Expression eines induzierbaren fluoreszierenden Reporters bewertet. Dann wird eine automatisierte quantitative Analyse unter Verwendung des Coss-Biosortts durchgeführt, letztendlich zeigt die Analyse quantifizierbarer Merkmale wie die Expression eines fluoreszierenden Reportergens Untergruppen von Genen, die für die Modulation bestimmter Signalwege, die Steuerung der Entwicklung, des Verhaltens oder der Physiologie erforderlich sind.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen zu beantworten, die Sie als elegant ansehen, wie z. B. Entwicklung, Neurobiologie sowie Wechselwirkungen zwischen Wirtskrankheiten und Krankheitserregern. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als die ersten großflächigen RNA-Augenscreenings vom Oranger-Labor veröffentlicht wurden. Es war ein erheblicher Aufwand, die erforderlichen Werkzeuge zu entwickeln und die Automatisierung zu perfektionieren.

Ich werde das Verfahren zusammen mit Olivia Ti, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin und einer Forschungsassistentin aus dem Labor von Jonathan Eubanks, demonstrieren, um 10 bis 1296 zu machen. Die Well-Platten beginnen mit der Vorbereitung von 100 Millilitern Nematodenwachstum, Medium oder NGM in deionisiertem Wasser. Bitte beachten Sie das schriftliche Protokoll für Anweisungen.

Während das Medium noch warm ist, fügen Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin und vier Millimolar IPTG hinzu und verteilen Sie schnell 75 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Überprüfen Sie, ob sich in den Vertiefungen Luftblasen befinden, und entfernen Sie sie sofort. Lagern Sie die Platten in einer feuchten Kammer bei vier Grad Celsius.

Bereiten Sie als Nächstes 96 Deep-Well-Platten vor, indem Sie 1,5 Milliliter LB hinzufügen, das Ampicillin und Tetracyclin enthält. Fügen Sie jeder Vertiefung ein eindeutiges Etikett oder einen Barcode hinzu. Decken Sie jede Platte ab und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, wenn sie im Voraus zubereitet wurde, rühren Sie die 96-Well-LB-Vorratsplatte mit der RNAI um.

Bakterielle Klone mit Ampicillin, Tetracyclin und Glycerin und verteilen Sie drei Mikroliter jedes bakteriellen Klons in die entsprechende Vertiefung einer zuvor vorbereiteten 96-Deep-Well-Platte. Verwenden Sie leere Vertiefungen für Kontrollen: Decken Sie die 96 Vertiefungsplatten mit einer Klebefolie ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Rühren. Platzieren Sie die gebrauchte 96-Well-Replikplatte am Morgen nach der Nachtkultur bei minus 80 Grad Celsius.

Übertragen Sie die 96-Well-NGM-Platten von vier Grad Celsius in einen sterilen Laminar-Flow-Schrank und lassen Sie sie fünf bis 15 Minuten lang erwärmen und trocknen. Füge dann das entsprechende Etikett oder den Barcode auf jeder Platte hinzu. Entnehmen Sie die 96 Tiefbrunnen-Kulturplatten über Nacht aus dem Inkubator.

Beobachten Sie die erfolgreich wachsende Bakterienkultur-Zentrifuge. Die 96 Deep-Well-Platten für fünf Minuten bei 4.000 U/min. Lassen Sie den Überstand abtropfen, indem Sie die Platte scharf auf den Kopf stellen und schnell trocknen.

Die Ränder der Platte auf einem Papiertuch suspendieren das Bakterienpellet in der Restflüssigkeit durch Vortexen. Idealerweise mit einem speziellen Rührwerk, damit jede Platte genau die gleiche Behandlung erhält. Übertragen Sie fünf Mikroliter der suspendierten Resus-Bakterien mit einer Acht- oder 12-Kanal-Multipipette auf die 96-Well-NGM-Platten.

Vermeiden Sie es, das NGM zu berühren. Lassen Sie die Bakterien etwa zwei Stunden lang unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank trocknen. Bei regelmäßiger Kontrolle, um zu vermeiden, dass das NGM zu zwei trockenen Inkubationen wird, werden die 96 Well R-N-A-I-N-G-M-Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht in einer Feuchtkammer inkubiert.

Siehe das schriftliche Protokoll zur Vorbereitung einer synchronisierten Population von Würmern nach dem Abkühlen der 96-Well-R-N-A-I-N-G-M-Platten bei Raumtemperatur. Fügen Sie jeweils etwa 100 bis 200 Würmer in zwei Mikrolitern M neun hinzu. Nun, überprüfen Sie, ob jede Vertiefung Würmer enthält.

Die Würmer sollten schwimmen. Lassen Sie die Platten maximal eine Stunde lang unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank trocknen. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig.

Die Würmer sollten eher krabbeln als schwimmen. Stelle die Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius. Nachdem sie eine hochinfektiöse Charge von Richterin Miria spora ausgewählt hatte.

Verwenden Sie M nine Buffer, um die Sporen von einer neun Zentimeter großen Platte zu sammeln. Verteilen Sie vier Mikroliter Sporen auf jede Vertiefung und überprüfen Sie jede Vertiefung auf Sporen. Die Würmer sollten schwimmen.

Lassen Sie die Platten etwa eine Stunde lang unter einem sterilen Laminar-Flow-Schrank trocknen. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig, bis die Würmer anfangen zu kriechen. Stellen Sie dann die infizierten Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius.

Überprüfen Sie die Würmer vor der Analyse, indem Sie sie schnell unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachten, um eine erfolgreiche Entwicklung, eine gute GFP-Induktion bei Negativkontrollen und eine reduzierte GFP-Fluoreszenz bei Positivkontrollvertiefungen zu gewährleisten. Wenn die Induktion gut ist, werden die Würmer mit einer Acht- oder 12-Kanal-Multipipette mit 100 Mikrolitern 50 millimolaren NACL und 0,05 % Triton auf ein neues etikettiertes oder mit Barcode versehenes Würmer übertragen. 96 Well runde Bodenplatte.

Frieren Sie die Platten bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius ein Tauen Sie die gefrorenen Platten am Tag der Analyse bei Raumtemperatur auf. Sobald die Platten aufgetaut sind. Fahren Sie mit der automatisierten Analyse mit dem COPA-Bios fort.

Die Maschine behandelt die Platte gut für gut und analysiert die Parameter jedes Wurms, wie z. B. ihre Fluoreszenz. Transkribieren Sie die aus dem COPA-Bios Sort erhaltenen Informationen in eine Excel-Datei, um die Datenqualität zu überprüfen. Speichern Sie dann die Rohdaten, einschließlich optischer Dichte, axialer Länge und Fluoreszenzemissionen, in einem Wurfarmgehäuse für spätere detaillierte quantitative Analysen.

In diesem Experiment exprimierten transgene Würmer konstitutiv einen P-Ruf 12 ds roten Reporter und einen induzierbaren PNLP 29 GFP. Reporterwürmer wurden 48 Stunden lang einem Kontroll- oder A-G-F-P-R-N-A-Augenklon ausgesetzt. Die Felder auf der linken Seite sind nicht infizierte Würmer, und die auf der rechten Seite sind Würmer, die 18 Stunden nach der Infektion mit D-Spora aufgetreten sind.

Wenn der interessierende Phänotyp die Expression eines A-GFP-Reporters ist, bieten Gen-Wells mit dem GFP-RNAi-Klon eine robuste Kontrolle. Das COPA bios SORTT generiert numerische Daten für jeden analysierten Wurm. Diese Diagramme zeigen den Durchschnitt und die Standardabweichung für jede Vertiefung transgener Würmer.

Konstitutiv exprimierend ein p-Ruf 12 DS roter Reporter und ein induzierbarer PNLP 29 GFP-Reporter nach RNAI und Infektion mit Diaspora. Der Sortierer analysiert die Laufzeit oder TOF, die der Größe der Würmer, der roten Fluoreszenz und dem Verhältnis von grüner Fluoreszenz zu TOF entspricht. Bestimmte Klone provozieren Wachstumsdefekte und/oder beeinflussen die Expression von P 12 DS-Rot.

Andere betreffen speziell die FP-Expression. Zum Beispiel zielt dieser spezielle Klon auf das Gen NS Y ab, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es für die Regulation von NLP 29 wichtig ist. Die grüne und rote Fluoreszenz und die TOF werden in beliebigen, aber konstanten Einheiten gemessen.

Eine der Neuerungen dieses Protokolls ist die Verwendung von Gefrierplatten, um ihre Analyse zu verschieben. Durch das Einfrieren können die Platten bis zu zwei Wochen gelagert werden, ohne dass sich die Ergebnisse, wie hier gezeigt, wesentlich verändern. Obwohl die absoluten Werte der gemessenen Fluoreszenz geändert werden können, bleiben ihre relativen Verhältnisse ähnlich.

L vier Würmer, die PNLP 29 GFP und P nennen 12 ds rote Transgene trugen, waren entweder mit Diaspora infiziert oder nicht. Nach 18 Stunden wurde jede Platte grob in zwei Teile geteilt, die Hälfte wurde sofort analysiert und die andere Hälfte wurde 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius eingefroren, bevor sie aufgetaut wurde. Für jede Probe wurden Analysewerte für die durchschnittliche Größentrübung sowie die grüne und rote Fluoreszenz berechnet.

Die Grafik zeigt das Verhältnis des Durchschnitts für Infizierte dividiert durch die nicht infizierten Proben für die hier gezeigten gefrorenen und lebenden Proben. Aus doppelten Analysen einer repräsentativen Platte ergeben sich die normierten Fluoreszenzverhältnisse für jede Vertiefung, d. h. das Fluoreszenzmittel einer Vertiefung dividiert durch das getrimmte Mittel der Platte. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll es einer Gruppe von zwei bis drei Personen ermöglichen, in zwei bis drei Monaten ein genombreites Screening durchzuführen.

Die erfolgreiche Ausführung dieses Protokolls erfordert viel gute Teamarbeit. Die Mitglieder meiner Fraktion haben enorme Anstrengungen unternommen, um ein Protokoll zu erstellen, das effizient und relativ einfach durchzuführen ist.