Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion quantitativ zu untersuchen und Eleganz auf genomweiter Ebene zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Expression jedes Gens mittels RNAi herunterreguliert wird. In 96-Well-Platten.

Als Nächstes wird der entsprechende Test zur Genfunktion durchgeführt. In diesem Beispiel wird die Fähigkeit von *Sea elegance* beurteilt, normal auf eine Pilzinfektion zu reagieren, indem die Expression eines induzierbaren fluoreszenten Reporters analysiert wird. Anschließend erfolgt eine automatisierte, quantitative Analyse mittels des Coss Bio Sort. Letztendlich zeigen die Analysen quantifizierbarer Merkmale, wie beispielsweise der Expression eines fluoreszenten Reportergens, Teilmengen von Genen auf, die für die Modulation bestimmter Signalwege sowie für die Steuerung von Entwicklung, Verhalten oder Physiologie erforderlich sind.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen zu beantworten, in denen Sie Eleganz erkennen, wie beispielsweise Entwicklung, Neurobiologie sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als die ersten groß angelegten RNA-Interferenz-Screens am Auge von der Oranger-Gruppe veröffentlicht wurden. Es erforderte erheblichen Aufwand, die benötigten Werkzeuge zu entwickeln und die Automatisierung zu perfektionieren.

Ich werde die Prozedur gemeinsam mit Olivia Ti, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin und einer wissenschaftlichen Hilfskraft aus dem Labor von Jonathan Eubanks, demonstrieren. Um 10 bis 1296-Well-Platten herzustellen, bereiten Sie zunächst 100 Milliliter Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM in deionisiertem Wasser vor. Weitere Anweisungen finden Sie im schriftlichen Protokoll.

Während das Medium noch warm ist, 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, 12,5 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin und vier Millimolar IPTG hinzufügen und schnell 75 Mikroliter in jede Vertiefung einer 96-Loch-Flachbodenplatte verteilen. Sofort nach Luftblasen in den Vertiefungen suchen und diese entfernen. Die Platten in einer feuchten Kammer bei vier Grad Celsius lagern.

Bereiten Sie anschließend 96er-Tieflochplatten vor, indem Sie 1,5 Milliliter LB unter Zusatz von Ampicillin und Tetracyclin hinzufügen. Geben Sie in jedes Loch eine eindeutige Kennzeichnung oder eine Barcode-Aufklebeetikette. Decken Sie jede Platte ab und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, falls sie im Voraus vorbereitet wird; schütteln Sie die 96er-LB-Basalplatte, die das RNAI enthält.

Bakterielle Klone mit Ampicillin, Tetracyclin und Glycerin versetzen und jeweils drei µL jeder bakteriellen Klonprobe in das entsprechende Loch einer zuvor vorbereiteten 96er-Tieflochplatte übertragen. Leere Löcher als Kontrollen verwenden, die 96er-Tieflochplatten mit einem Haftfolie abdecken und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubieren. Die verwendete 96er-Abbildungsplatte am Morgen nach der Übernachtkultur bei −80 °C lagern.

Überführen Sie die 96-Loch-NGM-Platten von vier Grad Celsius in einen sterilen Flusskabinettschrank und lassen Sie sie fünf bis 15 Minuten lang erwärmen und trocknen. Anschließend beschriften Sie jede Platte mit dem entsprechenden Etikett oder Barcode. Entnehmen Sie die 96-Loch-Tiefkulturplatten mit den Übernachtkulturen aus dem Inkubator.

Beobachten Sie die erfolgreiche Zentrifugation der wachsenden Bakterienkulturen. Die 96-Tiefbrunnenplatten fünf Minuten bei 4.000 U/min. Entfernen Sie den Überstand, indem Sie die Platte scharf auf den Kopf drehen, und trocknen Sie sie anschließend schnell ab.

Die Ränder der Platte auf einem Papiertuch lösen das bakterielle Pellet in der Restflüssigkeit durch Vortexen auf. Idealweise unter Verwendung eines dedizierten Agitators, sodass jede Platte exakt die gleiche Behandlung erhält. Übertragen Sie fünf Mikroliter der resuspendierten Bakterien mit einer acht- oder zwölfkanaligen Mehrkanalpipette auf die 96-Well-NGM-Platten.

Vermeiden Sie es, das NGM zu berühren. Lassen Sie die Bakterien etwa zwei Stunden lang unter einem sterilen Flusskasten trocknen. Überprüfen Sie regelmäßig, um zu verhindern, dass das NGM zu trocken wird; inkubieren Sie die 96-Well-R-N-A-I-N-G-M-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer.

Beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll zur Herstellung einer synchronisierten Wurm-Population, nachdem die 96-Well-R-N-A-I-N-G-M-Platten auf Raumtemperatur abgekühlt wurden. Geben Sie etwa 100 bis 200 Würmer in zwei Mikroliter M-nine zu jedem hinzu. Überprüfen Sie, dass sich in jedem Well Würmer befinden.

Die Würmer sollten schwimmen. Lassen Sie die Platten maximal eine Stunde lang unter einer sterilen laminaren Luftabsaugung trocknen. Überprüfen Sie die Platten regelmäßig.

Die Würmer sollten kriechen, nicht schwimmen. Stellen Sie die Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius. Nachdem Sie eine stark infektiöse Charge Judge Miria-Sporen ausgewählt haben.

Verwenden Sie M-neun-Puffer, um die Sporen von einer neun Zentimeter großen Platte zu sammeln. Geben Sie vier Mikroliter Sporen in jedes Brunnenloch und überprüfen Sie jedes Loch auf Sporen. Die Würmer sollten schwimmen.

Die Platten etwa eine Stunde lang unter einem sterilen Flusskabinett trocknen lassen. Die Platten regelmäßig überprüfen, bis die Würmer zu kriechen beginnen. Anschließend die infizierten Platten über Nacht in eine feuchte Kammer bei 25 Grad Celsius stellen.

Überprüfen Sie die Würmer vor der Analyse, indem Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop schnell auf eine erfolgreiche Entwicklung, eine gute GFP-Induktion in den Negativkontrollen und eine verminderte GFP-Fluoreszenz in den Positivkontrollbrunnen beobachten. Falls die Induktion gut ist, übertragen Sie die Würmer mit einem 8- oder 12-Kanal-Multikanalpipettiergerät zusammen mit 100 Mikrolitern 50 Millimolar NACL und 0,05 % Triton in eine neue, beschriftete oder mit Barcode versehene 96-Well-Rundbodenplatte.

Gefrieren Sie die Platten bei minus 80 Grad Celsius ein, bis zur Analyse. Am Tag der Analyse tauen Sie die gefrorenen Platten bei Raumtemperatur auf. Sobald die Platten aufgetaut sind, führen Sie die automatisierte Analyse mit dem COPA bios durch.

Die Sortt-Maschine behandelt die Platte wohldefiniert pro Mulde und analysiert die Parameter jedes Wurms, beispielsweise deren Fluoreszenz. Übertragen Sie die aus dem COPA-Bios-Sortt gewonnenen Informationen in eine Excel-Datei, um die Datenqualität zu überprüfen. Speichern Sie anschließend die Rohdaten, einschließlich optischer Dichte, axialer Länge und fluoreszierender Emissionen, in einem LIMBS-Paket für nachfolgende detaillierte quantitative Analysen.

In diesem Experiment exprimierten transgene Würmer konstitutiv einen P call 12 ds red-Reporter und ein induzierbares PNLP 29 GFP. Die Reporterwürmer wurden 48 Stunden lang einer Kontrolle oder einem A-G-F-P-R-N-A eye-Klon ausgesetzt. Die Felder auf der linken Seite zeigen nicht infizierte Würmer, diejenigen auf der rechten Seite Würmer 18 Stunden nach Infektion mit D spora.

Wenn der Phänotyp von Interesse die Expression eines GFP-Reporters ist, bieten Wells mit dem GFP-RNAi-Klon eine robuste Kontrolle. COPA bios SORTT erzeugt numerische Daten für jeden analysierten Wurm. Diese Diagramme zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung für jedes Well transgener Würmer an.

Konstitutiv exprimierende p call 12 DS rot-Reporter und ein induzierbarer PNLP 29 GFP-Reporter nach RNAI und Infektion mit Diaspora. Der Sortierer analysiert die Flugzeit (TOF), die der Größe der Würmer entspricht, die rote Fluoreszenz sowie das Verhältnis der grünen Fluoreszenz zur TOF. Bestimmte Klone rufen Wachstumsdefekte hervor und/oder beeinflussen die Expression von P 12 DS rot.

Andere beeinflussen spezifisch die FP-Expression. Zum Beispiel zielt dieser bestimmte Klon auf das Gen NS Y ab, das zuvor als wichtig für die Regulation von NLP 29 identifiziert wurde. Grüne und rote Fluoreszenz sowie TOF werden in willkürlichen, aber konstanten Einheiten gemessen.

Eine der Neuerungen dieses Protokolls ist die Verwendung von gefrorenen Platten, um deren Analyse zu verschieben. Das Einfrieren ermöglicht es, die Platten bis zu zwei Wochen lang zu lagern, ohne die Ergebnisse wesentlich zu verändern, wie hier gezeigt. Obwohl sich die absoluten Werte der gemessenen Fluoreszenz ändern können, bleiben ihre relativen Verhältnisse ähnlich.

Vier Würmer, die die Transgene PNLP-29-GFP und P-call-12-dsRed tragen, wurden entweder mit Diaspora infiziert oder nicht. Nach 18 Stunden wurde jede Platte grob in zwei Hälften geteilt; eine Hälfte wurde sofort analysiert, die andere Hälfte wurde 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius eingefroren und anschließend aufgetaut. Für jede Probe wurden Analysewerte für die durchschnittliche Größe, Trübung sowie grüne und rote Fluoreszenz berechnet.

Der Graph zeigt das Verhältnis des Mittelwerts der infizierten zu den nicht infizierten Proben für die hier gezeigten gefrorenen und lebenden Proben. Aus Duplikatanalysen einer repräsentativen Platte ergeben sich die normalisierten Fluoreszenzverhältnisse für jede Vertiefung, wobei es sich um den Fluoreszenzmittelwert einer Vertiefung dividiert durch den gestutzten Mittelwert der Platte handelt. Sobald der Protokollablauf beherrscht ist, kann eine Gruppe von zwei bis drei Personen innerhalb von zwei bis drei Monaten einen genomweiten Screen durchführen.

Die erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls erfordert viel gute Teamarbeit. Die Mitglieder meiner Gruppe haben einen enormen Aufwand betrieben, um ein effizientes und relativ einfach durchzuführendes Protokoll zu erstellen.