High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Hochdurchsatzanalysen in zellulären Krankheitsmodellen zu nutzen, um die bei neurodegenerativen Erkrankungen beeinflussten Signalwege zu quantifizieren. Dazu wird ein zelluläres Modell des Krankheitsphänotyps in das automatisierte Zellkultursystem eingegeben, und die Zellen werden solange inkubiert, bis die erforderliche Zellanzahl erreicht ist. Anschließend werden die Zellen geteilt, gezählt und in 96-Loch-Platten pipettiert, die Lentiviren enthalten, die verschiedene SH-RNAs exprimieren.

Nach sechs Tagen zellulärer Differenzierung werden die Zellen aus dem System entnommen, um sie immunhistochemisch zu färben und mittels hochauflösender Bildgebung zu analysieren. Abschließend werden die Bilder mithilfe verschiedener Analysealgorithmen ausgewertet, um Merkmale in Bezug auf die Zellgesundheit, neuronales Wachstum und mitochondriale Funktion zu quantifizieren.

Die Ergebnisse werden außerdem mittels zweifaktorieller Varianzanalyse in Novas analysiert, um signifikante Interaktionseffekte zu identifizieren. Diese Methode kann die Beantwortung zentraler Fragen zur Funktion krankheitsbezogener Gene und der Signalwege, in denen sie insgesamt wirken, beschleunigen. Dies führt anschließend zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind.

Um den Zellkultivierungsprozess zu beginnen, bereiten Sie das automatisierte Zellkultivierungssystem für die Eingabe von Zellkulturplatten vor. Laden Sie Verbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen, Zellkulturplatten und Assayplatten in das System ein. Stellen Sie außerdem manuell sicher, dass ausreichend Zellkulturmedien, PBS und Trypsin im System vorhanden sind.

Besäen Sie zwei Omni-Tray-Platten mit jeweils zwei mal 10 hoch sechs Zellen der SH-SY5Y-Neuroblastomzelllinie. Kultivieren Sie die Zellen in optimalem Medium mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und stellen Sie die Platten in das Eingabefach des Zellkulturroboters. Wählen Sie über die grafische Benutzeroberfläche (GUI) das Protokoll für die adhärente Zellkultur (A adherent cell culture) aus und passen Sie die zelllinienspezifischen Parameterdateien für adhärente Zellen so an, dass die Konfluenzschwelle bei 70 % liegt.

Gesamtinkubationszeit auf zwei Minuten einstellen. Das System anweisen, neue Omni-Tray-Platten mit einer Zellanzahl von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Platte vorzubereiten. Das System anweisen, pro Omni-Tray-Platte Assay-Platten mit insgesamt 5.000 Zellen pro Vertiefung vorzubereiten und die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 zu inkubieren.

Die folgenden Schritte sind Teil dieses Zellkulturprotokolls zur Adhärenz. Die Platten werden inkubiert und abgebildet, bis die Zellen die vordefinierte Konfluenzschwelle erreichen. Falls die Zellen die Konfluenzschwelle innerhalb von fünf Messungen nicht erreichen, werden die Platten aus dem System entfernt.

Nach Erreichen der benutzerdefinierten Konfluenzschwelle werden die Zellen gewaschen, trypsiniert und gezählt. Eine vordefinierte Anzahl von Zellen wird neuen Omni-Trait-Platten hinzugefügt, und falls eine ausreichende Anzahl von Zellen vorhanden ist, werden eine festgelegte Anzahl von Testplatten auf das Deck transportiert und eine definierte Anzahl von Zellen in jedes Loch übertragen. Abschließend können die Testplatten entweder direkt mit dem integrierten Mikroskop abgebildet oder aus dem System entnommen werden, um weitere Schritte zur Virusproduktion einzuleiten.

Inokulieren Sie LB-Medium, das Ampicillin enthält, mit bakteriellen Glycerin-Stämmen, die die HRNA-Vektoren enthalten, und lassen Sie die Kulturen über Nacht wachsen. Am folgenden Tag zentrifugieren Sie die Zellen, entfernen den Überstand und extrahieren die Plasmide mithilfe des Wizard Magnus Cell Plasmid Purification Systems. Die endgültige, E EIT enthaltende Plasmid-DNA wird in 96-Loch-Platten gesammelt. Das S-H-R-N-A-Lentivirus wird unter Verwendung des RNAi-Konsortiums hergestellt, wobei die Lentivirus-Produktion in 96-Loch-Platten erfolgt. Alle Experimente müssen in einem ML-2- oder BSL-2-LA-Sicherheitslabor durchgeführt werden, und alle verwendeten Reagenzien und Verbrauchsmaterialien müssen nach Gebrauch mit 30 % Chlor deskontaminiert werden.

Das Verfahren zur Lentivirus-Produktion wird in diesem Video nicht demonstriert, dauert jedoch vier Tage und besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst werden die Verpackungszellen am Tag null am folgenden Nachmittag ausgesät. Am Tag eins werden die Verpackungszellen 18 Stunden nach der Transfektion mit drei Lentivirus-Plasmiden transfiziert.

Tag zwei: Das Medium wird durch frisches Medium mit hohem BSA- oder hohem Serumgehalt ersetzt. 24 Stunden nach dem Mediumwechsel. Tag drei: Das Virus wird geerntet und das Medium erneut durch frisches Medium mit hohem BSA- oder hohem Serumgehalt ersetzt.

Schließlich wird 24 Stunden nach der ersten Virusgewinnung, am vierten Tag, das Virus erneut geerntet und die Verpackungszellen verworfen, um die Multiplizität der Infektion oder MOI des Lentivirus zu berechnen. Transduzieren Sie SHSY5Y-Zellen mit seriellen Verdünnungen des Virus und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Visualisieren Sie die GFP-Expression 72 Stunden nach der Transduktion unter dem Mikroskop und bestimmen Sie den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen. Säen Sie das shRNA-Lentivirus mit einem MOI von drei in Assayplatten aus. Nachdem das shRNA-Lentivirus auf die Assayplatten aufgebracht wurde, laden Sie die Platten in das automatisierte Zellkultursystem für die lentivirale Transduktion.

Nach 24 Stunden wird das Medium in den Assayplatten gewechselt zu Optimum mit 0,5 % FBS und 0,1 µM Retinsäure. Um den Differenzierungsprozess zu beginnen, wird die Inkubation der Assayplatten in dem Differenzierungsmedium für fünf Tage fortgesetzt, um eine maximale Herunterregulation der Zielgenexpression am fünften Tag sicherzustellen. Am sechsten Tag wird H2O zwei auf die Hälfte der Assayplatten für 24 Stunden zugegeben, um die Translokation des DJ1-Proteins in die Mitochondrien zu stimulieren. Anschließend wird MIT-Tracker in eine Endkonzentration von 200 nmol pro Bohrung zugegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert.

Danach können die Platten zum Hochdurchsatz- oder HC-Imager zur Bildaufnahme transportiert werden. Alternativ können die Platten aus dem System entnommen und einer weiteren Verarbeitung, beispielsweise einer Immunfärbung, zugeführt werden. Für die Hochdurchsatz-Bildgebung werden insgesamt 30 Felder pro Mulde mit dem 20x-Objektiv aufgenommen: DJ eins mit dem Fitzy-Filterset, Mitochondrien mit dem Trixy-Filterset, Beta-drei-Tubulin mit dem S-fünf-Filterset und Zellkerne mit dem UV-Filterset.

Dies ist ein Beispiel für zusammengesetzte Bilder von Zellen, die mittels hochauflösender Bildgebung gewonnen wurden. In Abbildung drei sind unbehandelte Zellen im Panel A und mit H2O zwei behandelte Zellen im Panel B dargestellt. DJ eins ist grün markiert, Mitochondrien rot und Kerne blau. Um den durchschnittlichen Überlappungskoeffizienten zwischen DJ eins und den Mitochondrien zu bestimmen, analysieren Sie die Bilder mithilfe der Bioanwendung zur Kolokalisation.

Definieren Sie die Regionen von Interesse. ROI wie folgt: ROIA – Kern, Abbildung vier A und E; und ROIB – Mitochondrien, Abbildung vier B und F. Schließen Sie ROIA von ROIB aus. Um sicherzustellen, dass nur das Zytoplasma analysiert wird, definieren Sie die Mitochondrien als Zielregion eins und DJ eins als Zielregion zwei, Abbildung vier C und G. Analysieren Sie die Bilder mithilfe der Com-Compartmental-Analyse-Bio-Anwendung, um die durchschnittliche Intensität des MIT-Tracker-Signals innerhalb der Mitochondrien zu bestimmen.

Abbildung vier B und F, um die durchschnittliche Länge der Neuriten aus der Beta-drei-Tubulin-Färbung zu verfolgen. Analysieren Sie die Bilder mithilfe der neuronalen Profilierungs-Bioanwendung, Abbildung vier D und H, sowie der folgenden Bildplatten mit dem Opera LX, einem automatisierten konfokalen Lesegerät.

Visualisieren Sie Mitochondrien mit dem 561 Nanometer Laser und Kerne mit UV-Anregungsbildgebung. Erfassen Sie insgesamt 30 Felder pro Vertiefung unter Verwendung des 60x-Objektivs mit Wasserimmersion. Analysieren Sie die Bilder abschließend mit dem Spot-Edge-Ridge- oder SER-Texturmerkmals-Algorithmus.

Der SER-Ridge-Filter überträgt die Intensität in Pixeln, die rückenartige Muster bilden. Je fragmentierter die Mitochondrien sind, desto höher ist der SER-Ridge-Score. In diesem Video wurden Hochdurchsatz- oder HC-Assays verwendet, um Modulatoren des DJ1A-Proteins zu identifizieren, dessen Verlust autosomal-rezessive Parkinson-Erkrankungen verursacht.

Dieses erste repräsentative Ergebnis veranschaulicht eine epistatische Interaktion mit DJ1. Das Balkendiagramm auf der linken Seite zeigt normalisierte Fluoreszenzeinheiten, und die Bilder auf der rechten Seite zeigen SH-SY5Y-Zellen, die mit MitoTracker rot markiert sind, zur Quantifizierung der Zellviabilität.

Es wurde beobachtet, dass die Herunterregulation von DJ one in Zellen, die einem Toxin ausgesetzt waren, zu einem stärkeren Verlust der Zellviabilität führte als bei Zellen, die mit einem „scrambled“ Lentivirus infiziert wurden. Die Herunterregulation des Zielgens A hatte einen ähnlichen Effekt wie die Herunterregulation von DJ one in Zellen. Die gleichzeitige Herunterregulation von DJ one und Zielgen A führte jedoch zu einem signifikant stärkeren Verlust der Zellviabilität als der Verlust jedes einzelnen Gens allein, was auf eine epistatische Interaktion zwischen DJ one und Zielgen A hindeutet. Dieses nächste Beispiel zeigt ein Gen, das die Translokation von DJ one reguliert.

Das Balkendiagramm zeigt den normalisierten Überlappungskoeffizienten zwischen DJ1 und den Mitochondrien, der die Translokation von DJ1 aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien widerspiegelt. Die Abbildungen A bis D zeigen Bilder von SH-SY5Y-Zellen, die grün für DJ1, rot für Mitochondrien und blau für Kerne markiert sind. Wenn die Zellen einem Toxin ausgesetzt werden, transloziert DJ1 aus dem Zytoplasma in die Mitochondrien, was durch einen höheren Überlappungskoeffizienten zwischen DJ1 und den Mitochondrien quantifiziert wird.

In Zellen, in denen das Zielgen B stillgelegt wurde, transloziert sich weniger DJ-1 in die Mitochondrien, wenn die Zellen dem Toxin ausgesetzt werden. Dies legt nahe, dass das Zielgen B an dem Transport von DJ-1 in die Mitochondrien beteiligt ist. Ein Beispiel für ein Gen, das an der neuronalen Auswuchsformation beteiligt ist, wird hier gezeigt. Normalisierte Neuritenlängen sind im Balkendiagramm dargestellt, und die zur Quantifizierung der Neuritenlängen verwendeten Zellen sind in den Abbildungen mit Beta-3-Tubulin in Grün und Kernen in Blau zu sehen.

Die Herunterregulation des Zielgens C in Wildtyp-SHSY5Y-Zellen führt im Vergleich zu Zellen, die mit Lentivirus exprimierendem scrambeltem shRNA infiziert wurden, zu einer signifikanten Zunahme der Neuritenlänge. Dieser Effekt geht in Zellen, die mit Toxin inkubiert wurden, verloren. Schließlich zeigen diese Ergebnisse ein Beispiel für ein Gen, das an der mitochondrialen Morphologie beteiligt ist.

Die durchschnittlichen Werte für die Segmentierung der mitochondrialen SER-Rücken in SHSY-5Y-Zellen, die mit einer unspezifischen HRNA oder einer A-S-H-R-N-A, die das Gen D targetiert, infiziert wurden, sind im Diagramm dargestellt. Abbildung A und Abbildung C zeigen jeweils Zusammenschnittbilder von SHSY-5Y-Zellen, die mit einer unspezifischen HRNA beziehungsweise einer A-H-R-N-A, die das Gen D targetiert, infiziert wurden. Die Mitochondrien sind rot, die Kerne blau gefärbt.

Bild B und D zeigen Visualisierungen der SER-Graten-Quantifizierung, wie hier beobachtet. Die Infektion von Wildtyp-SHSY-5Y-Zellen mit einem HRNA, das das Gen D gezielt anspricht, führt im Vergleich zu Zellen, die mit einem zufällig sortierten Lentivirus infiziert wurden, zu einem Anstieg des mitochondrialen SER-Graten-Segmentierungswerts. Dieser Ansatz kann Forschern auf dem Gebiet der Neurodegeneration den Weg ebnen, um die an der Krankheitspathogenese beteiligten Signalwege zeitnah zu untersuchen und zu annotieren.

Dies wird anschließend zu besseren Zielstrukturen für die therapeutische Entwicklung führen.