Name: Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die Ableitung von Gliazellen eingeschränkten Vorstufen aus E13-Mäusen für Neurobiologie und Transplantationsforschung. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung und Langzeitlagerung von GRP-Zellen.

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Wir danken Dr. Devin Gary für seine Einsicht und Feedback danken für die Verwendung von GFK-Zellen.

Einführung In diesem Protokoll zeigen wir, wie zu extrahieren, wählen und Glia-Platte eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind frühe Vorläufer innerhalb der oligodendrocytic und astrozytären Zelllinien und zeichnen sich durch ihre Expression von A2B5 definiert. In der GFK-Medium mit FGF-2 ergänzt, werden die A2B5 + GRPs beginnen Ausdruck der frühen oligodendrocytic Linie Marker PDGFαR und NG2 1,2. Diese Linie Oligodendrozyten Zellen durchlaufen eine Reihe von unterschiedlichen phänotypischen Stufen, jede von ihnen durch morphologische Veränderungen, sowie Expression von Markern für bestimmte Entwicklungsstadien gekennzeichnet. Diese Vorläuferzellen werden derzeit als potentielle Quelle für Zell-basierte Therapieansätze bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems weißen Substanz, einschließlich Multiple Sklerose, Leukodystrophien und periventrikuläre Leukomalazie (PVL) 3,4,5,6 studierte 6,7,8,9 berichtet. Diese glialen Vorläuferzellen wurden auch in anderen Studien Erkrankung der weißen Substanz Modelle wie Rückenmarksverletzungen und amyotrophe Lateralsklerose 10,11,12,13 verwendet. Unser Labor hat einen frühen postnatalen Hypoxie-Ischämie Mausmodell, mit denen wir zur Beurteilung der Wirksamkeit dieser Rückenmark abgeleitet GFK-Zellen als eine restaurative Ansatz in PVL, die häufigste Ursache der Zerebralparese 14,15,16 entwickelt werden. Es gibt auch ein Nagetier Gehirn stammenden OPC-Modell, das in großem Maße für das Studium der weißen Substanz Verletzungen verwendet werden, da die GFK-Zellen eine Tendenz, in die Astrozyten-Weg 17 zu differenzieren. Die OPC-Phänotyp hat bereits die Oligodendrozyten Linie Weg, ein Phänomen, das irreve scheint eingegebenenrsible. Wir sind jedoch daran interessiert, die Beurteilung der Reaktion eines breiteren Spektrums von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen einschließlich GRPs und möglicherweise sogar den NEPs bei E10.5 abgeleitet. Aus diesem Grund haben wir das Rückenmark abgeleitet GFK-Modell für unsere Arbeit angenommen. Neben der Verwendung von GFK zur Zellersatztherapie, erlaubt die Ableitung dieser Zellen von Wildtyp und transgenen Nagetier-Modellen der weißen Substanz Krankheiten weitere Studie glialen Differenzierung unter normalen oder Krankheitszuständen in einem in vitro-Einstellung. Frühere Veröffentlichungen zeigen Beweise für selektive Anfälligkeit von oligodendrocytic Abstammung Vorläuferzellen zu verschiedenen externen Stressoren wie Reifung abhängig Glutamatexzitotoxizität, oxidativer Stress, und wählen Faktoren in Neuroinflammation 18,19 verwickelt. Unsere Studien haben auf das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen hinter der Entwicklung dieser weißen Substanz Verletzungen konzentriert, die Bewertung der Anfälligkeit von Zellen inder Oligodendrozyten-Linie Spektrum zu beleidigen sowie die Analyse putative therapeutische Ansätze. Materialien Alle Verfahren, die Tiere entsprechen den PHS-Politik und der JHU IACUC. Alle Verfahren sollte in einem Abzug mit laminarer Strömung durchgeführt werden, um sterilem Zustand zu halten. Üblicherweise Sektionen in einer horizontalen Werkbank und in vitro Arbeit in einer vertikalen Strömung Abzug durchgeführt. Alle verwendeten Medien bei Dissektionen kalt. Die Mäuse in unserer Studie verwendeten sind ein Wildtyp-CD-1-Stamm und ein transgener GFP in einem C57/BL6 Hintergrund. Eine CD-1 Maus Staudamm liefert typischerweise 10 + Föten, die genug, um Samen 1-2 T25-Flaschen sind. Typischerweise werden zwei Dämme zu einer Zeit und fetalen Rückenmark gebündelt und in ein T25-Flasche pro Muttertier überzogen geopfert. Sobald Zellen abgeleitet wurden sie erweitert werden können und dadurch in vitro für nachfolgende Studien. 1. Vorbereitung der Medien und Flaschen <ul type="disc"><li> GFK-Lager; N2 (100x; Invitrogen) Ergänzungen und Rinderserumalbumin (BSA; 0,5% w / v) DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): Medium wird als die Dissektion Medium verwendet. </li><li> Dissoziation Medium: wie Dissektion Medium. </li><li> Kulturmedium: GFK-Aktie mittel + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) und Heparin (1 pg / ml, Sigma). </li><li> PLL / Laminin-beschichtete 75 cm 2 oder 25 cm 2-Kolben (T75 oder T25). </li><li> In destilliertem H 2 O bei 37 ° C für 1 Stunde inkubiert und dann aspiriert; Zellkulturflaschen (75 cm 2, Falcon) mit 15-20μg/ml Poly-L-Lysin (Sigma PLL) beschichtet ist. Die Kolben werden mit PBS 1X dann mit 15-20 ug / ml Laminin (Sigma) in PBS bei 37 ° C für 1 Stunde beschichtet, dann abgesaugt und frisches PBS oder Medium zugegeben, bis die Zellen bereit zu plattierenden sind gewaschen. Nach Beschichtung, sollten Flaschen nie trocknen gelassen werden, sondern kann in PBS oder Medium bei 4 ° C aufbewahrt werden für kurze Zeit vor dem Gebrauch. </li></ul> 2. Instrumente und Other Material <ul type="disc"><li> Petrischalen: 4 pro Muttertier: 3 Petrischalen für die Dissektion (75 mm), eine 20 mm-Schale zum Auffangen der geernteten Rückenmark. </li><li> Große Schere (43 mm Betriebstemperatur Schere, Roboz) und chirurgische Pinzette zum Öffnen der Damm s Bauch. </li><li> Kleinen Schere zum Präparieren der Gebärmutter und das Entfernen der Föten (15 mm Micro Präparierschere, Roboz). </li><li> Micro Dissecting Frühjahr Schere (6 mm) zu sezieren das Rückenmark der Feten. </li><li> Micro Dissecting abgewinkelte Pinzetten für die Verankerung des Damms und fetalen Körpers während der Operation und später das Entfernen des Rückenmarks einmal ausgesetzt. </li><li> 40 oder 70 Mikrometer Zellsieb zur Entfernung von Zelltrümmern vor dem Beschichten. </li><li> 0,05% Trypsin vorgewärmt auf 37 ° C </li><li> 10 mg / ml DNAse 1 (Sigma), als 100x Stocklösung hergestellt (1 g / ml). </li><li> Bio-Hazard-Tasche für Tierkadaver. </li><li> 15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen für die Verarbeitung extrahiert Rückenmark. </li></ul> 3. Bestimmen Timed Pregnancy Schwangere Maus Dämme sind entweder aus kommerziellen Quellen angeben Lieferung am embryonalen Tag E12 oder E13 der Entwicklung des Fötus oder der Schwangerschaft im Haus bestimmt bestellt. Kurz gesagt, werden zwei Weibchen zusammen mit einem Männchen in den späten Nachmittag gelegt und über Nacht zusammen. Am nächsten Tag die Weibchen werden auf das Vorhandensein des vaginal entfernt Schleim Plug beobachtet. Der Schleim-Stecker ist nur ein Indiz dafür, dass so Paarung Tiere werden gewogen, anschließend täglich zu Rate der Gewichtszunahme überwachen aufgetreten. Der Tag der Schleim Plug beobachtet wird, wird als embryonaler Tag eins (E1) definiert. 4. Tissue Ableitung <ol><li> Die Arbeiten im Rahmen einer horizontalen Strömung Haube zu aseptischen Bedingungen aufrecht zu erhalten. </li><li> Sprühen Sie die Haube und Arbeitsbereich mit 70% Ethanol. </li><li> Autoklav Instrumente oder Spray großzügig mit 70% Ethanol. </li><li> Bereiten Sie Instrumente, Medien und Mikroskop zum Einsatz. </li><li> Gießen Sie 20 ml kaltem Dissektion Medium in sterile Petri-dish. </li><li> Tier betäuben mit Chloralhydrat (500 mg / kg) intraperitoneal (IP) durch Genickbruch oder Enthauptung folgten. </li><li> Sprühen Sie den Bauchbereich des Dammes mit 70-90% Ethanol (Desinfektion) </li><li> Öffnen Bauch mit großen Scheren und Pinzetten. <ol type="a"><li> In CD1 und C57/BL6 Stämme: In der Regel 8 bis 14 Föten wird in der Gebärmutter sein. Die Zahl der Föten ist Belastung abhängig. </li></ol></li><li> Entpacken Sie die Maus Gebärmutter einschließlich der Welpen und in frischem, kaltem Dissektion Medium in einem sauberen Petrischale, um Blut und Gewebereste von Fötus zu waschen. </li><li> Extrahieren Sie jede Fötus aus dem Uterus-Horn und trennen sie von der embryonalen SAC und der Plazenta über die kleine Schere. Übertragen Sie die extrahierten Föten an die frische Dissektion Medium in eine neue Petrischale. <ol type="a"><li> Dissection Medium sollte bei niedriger Temperatur zu senken und metabolische Aktivität zu bewahren Lebensfähigkeit der Zellen abgeleitet sein. </li><li> Arbeiten Sie ab jetzt mit zwei Zangen undMikro Sezieren Feder-Schere. </li></ol></li><li> Das Arbeiten unter Dissektionsmikroskop, schneiden Sie die Haut entlang des Rückenmarks mit den Mikro-chirurgische Scheren und schälen Haut zurück, um das Rückenmark freizulegen. </li><li> Durchschneiden die mit dem Rückenmark mikrochirurgischen Schere zu C1 und zu Beginn des Schwanzes. </li><li> Entfernen Sie das Rückenmark mit stumpfen Pinzette, sicherzustellen, dass alle Knochen und Knorpel entfernt werden und Transfer zum 3 rd Petrischale zu sezieren Medium. </li><li> Um übermäßiges Wachstum von meningealen Gewebe in den folgenden Zellkulturen zu verhindern versuchen, so viel von den Hirnhäuten wie möglich aus dem Rückenmark zu entfernen. Aufgrund der im Entstehen begriffenen überstehenden peripheren Nerven ist dies schwieriger als das Entfernen meningealen Gewebe extrahiert aus Großhirn. </li><li> Sobald Hirnhäute entfernt worden sind, übertragen Rückenmark bis 20 mm Petrischale </li><li> Clean up durch gründliches Besprühen Sie den Bereich mit 70-90% Ethanol. </li><li> Die folgenden Schritte für die Dissoziation sollte schnell erfolgen, um zu halteneine hohe Rentabilität der abgeleiteten Gewebe des Rückenmarks. </li></ol> 5. Kultur Establishment <ol><li> Trypsin sollte für mindestens 30 min in einem 37 ° CH 2 O-Bad vorgewärmt werden. Ein geeignetes Aliquot sollte aus dem Bestand entfernt werden, um die Exposition der Lager gegenüber Temperaturschwankungen zu reduzieren. </li><li> Übertragen Sie die geernteten Rückenmark zu einem 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 10 ml vorgewärmter Trypsin (0,05%; Qualität Biologicals) und 100 ul DNAse (10 mg / ml) und kurz verreiben. </li><li> Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten. </li><li> Verreiben und inkubieren Sie für weitere 10 min. </li><li> 5 ml Medium GFK (oben definiert) und Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPM. </li><li> Absaugen des Überstandes und Pellet erneut mit 10 ml Medium GFK und fügen DNAse-1 (10 mg / ml, Sigma). </li><li> Inkubieren bei 37 ° CH 2 O-Bad für 10 Minuten. </li><li> Zentrifugieren 5 min bei 1000 RPM und Absaugen des Überstandes. </li><li> Pellet mit fresh GFK-Medium dann Filter Trümmer mit einem 40 - 70 um Zellsieb. </li><li> Plate auf PLL / Laminin beschichtete 25 cm 2-Kolben (T25) und Inkubation bei 37 ° C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2. </li><li> 100% ändern Medien auf folgenden Tages. </li><li> An dieser Stelle haben GRPs befestigt und begann sich Prozesse. </li></ol> 6. Immunopanning die GFK Bevölkerung <ol><li> Platte Rückenmark in PLL / Laminin beschichtete Kolben, bis Kolben ist 85-90% konfluent oder etwa eine Woche. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-oder Polizist mit 0,05% Trypsin, gründlich, aber sanft verreiben, bei 1000 rpm für 5 min und gründlich Pellet mit 3 ml Medium GFK zentrifugieren. </li><li> Übertragen Sie jeweils 1 ml bis 3 T25-Flaschen oder 3 ml bis 1 T75-Flasche hinzu entsprechende Volumen des Mediums vollständig zu bedecken Zellen und ermöglichen Flaschen auf 80-90% Konfluenz erreichen. </li><li> Ändern Medien jeden zweiten Tag, früher, wenn Medium erschöpft schnell. </li><li> Coat Bakteriologische PeTri Gerichte (75 mm) über Nacht bei 4 ° C mit einem Anti-Maus-IgM-Antikörper (Southern Biotech), 10 pg / ml in PBS. </li><li> Absaugen des überschüssigen Puffer und waschen Sie die Petrischalen 3x mit PBS. </li><li> In A2B5-Antikörper (Millipore) bei einer Konzentration von 5 mg / ml in PBS und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (RT) verdünnt. </li><li> Waschen Sie Platten erneut 3x mit PBS fügen Sie dann 8 ml GFK Medium zu verhindern Austrocknen der Platte. </li><li> Übertragen Sie 5 ml Medium aus GFK Petrischalen und Ernte GFK-Zellen durch Abschaben Kolben mit einem Gummi-Polizist, um alle Zellen zu lösen </li><li> Man reibt Zellsuspension kurz zu brechen Klumpen und übertragen 5ml Zellsuspension zu den A2B5 beschichteten bakteriologischen Petrischalen. </li><li> Inkubieren 1 Stunde bei Raumtemperatur ohne Schütteln. </li><li> Nach 1 Stunde absaugen Medien und Wäsche Platte 8x mit PBS. </li><li> Vorsichtig kratzen Zellen mit einem Gummiwischer in 2 ml GFK Medien dann auf PLL / Laminin beschichteten Platten oder Kolben übertragen mit entsprechenden Volumen von GFK-Medium. </li> 7. Einfrieren und Lagern von abgeleiteten Zellen <ol><li> Die Zellen werden aus einer 85-90% konfluent T25 oder T75-Kolben mit 2 ml 0,05% Trypsin geerntet. </li><li> Trypsin wird verdünnt und mit 8 ml GFK Lager Medium inaktiviert und zentrifugiert bei 1000 UpM für 5 min. </li><li> Pellets aus T25-Flaschen werden in 1 ml GFK Einfriermedium, (GFK Lager-Medium mit 10% (v / v) DMSO und gegebenenfalls, 20% FBS), resuspendiert. Die größeren Pellets aus T75-Flaschen werden verdünnt zweifach. </li><li> Zellsuspensionen von 1,5 - 3 × 10 10,11,12,13 Zellen werden Kryoröhrchen (Nalgene) überführt und über Nacht in einem kryogenen Behälter (Nalgene), das Isopropanol bei -80 ° C bis langsam einfrieren über Nacht gelagert. </li><li> Nach über Nacht Einfrieren Zellen werden zu Tiefkühlboxen übertragen und dort gespeichert 6 Monate bis 1 Jahr bei -80 ° C oder längerfristig in N (l). Aufgetauten Zellen sind typischerweise 60-80% lebensfähig ist weitgehend abhängig von der Qualität des PLL / Laminin beschichtet. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse CO 2 ist nicht für die Betäubung des Tieres wegen der möglichen nachgelagerten Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Föten und letztlich der abgeleiteten Zellen verwendet. Darüber hinaus wird es sehr schwierig sein, völlig entfernen Sie die Meningen aus dem Rückenmark bei der Ableitung Prozedur aber die Kombination von GfK mittel-und Immunopanning wird diese schnell wachsende Zellen zu eliminieren. In ähnlicher Weise wird die gesamte Wirbelsäule trotz einer größeren Konzentration des ventralen GFK Bevölkerung aufgrund seiner Ursprung in der ventralen Rückenmark und Migration dorsal 20 geerntet. Aber das GFK-Medium wählt für die GFK-Phänotyp und dass die Bevölkerung wird durch A2B5 Immunopanning maximiert. Nach dem Ausplattieren Rückenmarkgewebes, werden die in vitro-Kulturen für zwei Kanäle oder über eine Woche inkubiert. Nach 2 Tagen in Kultur, kann Zellen unterschiedlicher Morphologien in den Gewebekulturflaschen Angabe der Heteroatome beachtenHomogenität der Bevölkerung, sondern der GFK Medium wählt für die GFK-Phänotyp. Diese Zellen sind eine Kombination von A2B5 + GFK, E-NCAM + neuronalen eingeschränkten Vorstufen (NRP) und Nestin +, A2B5-Neuroepithelzellen und möglicherweise Fibronectin + meningealen Zellen. Darüber hinaus reiferen Phänotypen vorliegen können auszudrücken Marker einschließlich Doublecortin und Tuj1 für die neuronale Linie, GFAP für Astrozyten und PDGFaR und GalC für Oligo-Linie Um eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung aus dem Ausgangsmaterial heterogener Pool (Abbildung 1A) zu maximieren, können Zellen sein Doppel-immunopanned zu wählen und die Beseitigung der E-NCAM +-Zellen durch Selektion auf dem A2B5 gefolgt + GFK Bevölkerung einmal Zelldichte zu etwa 85-90% Konfluenz in T75-Flaschen erhöht hat. Diese GFK Zellen ihre Fähigkeit, Astrozyten werden, obwohl er in einem Medium, das für die Oligodendrozyten Phänotyp selektiert so dass nachfolgende A2B5 Immunopanning kann notwendig sein, eine hoch angereichertes GFK Bevölkerung zu erhalten. Immunopanning GenerVerbündeter Ausbeuten von bis zu 95% A2B5 +-Zellen, jedoch für eine noch größere Ausbeute A2B5 konjugierten magnetische Kügelchen (Miltenyi Biotec GmbH) verwendet werden, um eine Ausbeute von bis zu 97% bereitzustellen. Wachsamkeit bei der Wartung GRP Kulturen wie zum Beispiel regelmäßige Medien-Änderungen werden minimiert die Verbreitung von nicht-GFK Zelltypen. Selbst in Abwesenheit von BMP-4 Astrozyten noch gefunden und erschöpft Medien Insbesondere scheint Differenzierung zu Astrozyten Phänotyp zu induzieren. Obwohl die B27 Ergänzung enthält Triiodthyronin Hormon (T3), gab es keine beobachteten Tendenz, in Oligodendrozyten im GFK Bevölkerung zu unterscheiden, nur dann, wenn höhere Konzentrationen von T3 zu dem Medium zugegeben dieses Phänomen auftritt. Jedoch kann ein T3 freien B27 Ergänzung substituiert, wenn es ein Problem für Kontamination durch reife Oligodendrozyten (1B) werden. Diese GFK-Zellen können leicht durch ihre Morphologie der kleinen Soma mit 2 oder 3 kurze Prozesse, sondern auf dem Bildschirm für andere Zelltypen, die vorhanden sein können, im identifiziert werdenmunocytochemistry kann zu dem zuvor benannten gemeinsamen Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Marker durchgeführt werden. Es wird üblicherweise eine kleine Population von persistenten A2B5-Zellen, die neuro-(NEP) und in der Lage zu entweder GFK oder NRP sind. Glücklicherweise sind die Zellen länger in der GFK-Medium, desto wahrscheinlicher, dass Medium wird für die GFK-Phänotyp wählen gepflegt. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1."> Abbildung 1. A) Plated Rückenmark Zellen der heterogenen Morphologie sind nach 2 Tagen in Kultur beobachtet. B) Immunopanning eine hoch angereicherte GFK Bevölkerung maximiert vom Ausgangspunkt heterogenen Pool. </ol>

<ol><li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord%3A+isolation%2C+characterization%2C+and+clonal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Ernst+Schering+Research+Foundation+workshop%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li>
<li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li>
<li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li>
<li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+glial-restricted+progenitors+survive%2C+proliferate%2C+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li>
<li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li>
<li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li>
<li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li>
<li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li>
<li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li>
<li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+glia+biology%22%5BJournal%5D)">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li>
<li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li>
<li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+cerebral+palsy%3A+which+ones+are+best%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+child+neurology%22%5BJournal%5D)">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variability%2C+injury+distribution%2C+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li>
<li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+neurology%22%5BJournal%5D)">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li>
<li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+A2B5%2B+glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li>
<li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li>
<li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li>
<li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li>
<li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-permeable+AMPA%2Fkainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li>
<li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+white+matter%3A+clinical+and+pathophysiological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Mental+retardation+and+developmental+disabilities+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li>
<li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tripotential+glial-restricted+precursor+%28GRP%29+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord%3A+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li>
<li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li>
<li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li>
<li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li>
<li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li>
<li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li>
<li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li>
</ol>

Diese Studie wurde vom National Institute of Health [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF), und R01NS028208 (MVJ)] und der Kinderneurologie Foundation finanziert. Der Inhalt dieses Berichts sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Health, DHHS. Die Autoren haben keine Interessenkonflikte relevant zu dieser Studie.

<p class="jove_content"&gt; Erkrankungen des zentralen Nervensystems weißen Substanz enthalten eine große Anzahl von Ursachen, darunter genetische, entzündliche, ischämische und toxische Ursachen<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Während Multiple Sklerose und Gefäßerkrankungen die häufigste Ursache für Erkrankung der weißen Substanz bei Erwachsenen sind, ist periventrikuläre Leukomalazie mit Frühgeburt verbundenen die häufigste Ursache von Verletzungen der weißen Substanz in der Kindheit Bevölkerung. Um weiter abzugrenzen Krankheitsmechanismen weitere Studie von Zellen ofoligodendrocytic Linie, die stark durch die perinatale Beleidigung betroffen sind, ist nicht erforderlich. GFK wurden aus dem Nagetier embryonalen Rückenmark isoliert und gezeigt, dass tripotential in der Natur, was zu Oligodendrozyten und Astrozyten zwei verschiedene Populationen, aber nicht in Neuronen differenzieren<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Ebenso sind die Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) aus Ratte Sehnerv und späten embryonalen und frühen postnatalen Rattenhirn abgeleitet nachgewiesen, dass sie in funktionierende Oligodendrozyten in den entsprechenden Medien Bedingungen reifen<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Zusätzlich haben fetalen oder adulten menschlichen OPC abgeleitet wurde weiter in reiferen Oligodendrozyten-Phänotypen manipuliert<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GFK-Zellen haben sowohl das Rückenmark von E13.5 Ratten und E12-13.5 in Mäusen isoliert worden. In den Ratten Unterschiede zwischen dorsal-und ventral-abgeleiteten Zellen GFK wurde in ihrer Reaktion auf Bedingungen, die Generierung von Oligodendrozyten, Astrozyten oder mit ventral-derived GRPs zeigt eine größere Neigung, in den reiferen Phänotypen differenzieren fördern berichtet<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Dies ist möglicherweise auf die ventral nach dorsal Migration der entstehenden GFK-Zellen, die weniger empfänglich für die Differenzierung Signale könnten. Immunopanning ermöglicht die Subpopulation, die A2B5 Ausdruck zu isoliert und gesammelt werden für die Wartung in der Kultur.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Unsere Maus GFK Kulturen wurden, werden vom Gewebe des Rückenmarks, die eine heterogene, Gesamtgruppe von Zellen, aus denen Zellen durch chemische GFK (mittel) und auf Antikörpern basierende Techniken ausgewählt werden ergibt abgeleitet. Während unsere Untersuchungen des Rückenmarks abgeleitet Maus GFK-Zellen genutzt haben, hat es in jüngerer Zeit wurde die Ableitung des Gehirns abgeleitet Maus Oligodendrozyten-Progenitorzellen, die auch fähig sind, die Entwicklung zu reifen Oligodendrozyten berichtet<sup&gt; 31</sup&gt;. Hier werden die abgeleiteten Zellen werden zunächst als oligospheres, dass unter Verwendung des geeigneten Kulturmedium in eine angereicherte PDGFαR +, OPC Bevölkerung manipuliert kultiviert<sup&gt; 31</sup&gt;. Unsere Studien haben auf die Wirkung von unserem Modell der hypoxisch-ischämischen Insult auf Zellen in der Oligodendrozyten-Linie Spektrum von A2B5 +, PDGFαR GFK-Vorstufen zu der Myelin basisches Protein exprimieren (MBP +) reifen Oligodendrozyten konzentriert. In der Tat unsere<em&gt; In-vitro-</em&gt; Charakterisierung hat gezeigt, dieser unreifen Zellen reifen zu GFK-MBP exprimierende Zellen entweder in Monokulturen oder in Co-Kulturen mit kortikalen Neuronen. Diese Zellen können in Kultur in spezifische Differenzierung Wege für die Erforschung der Mechanismen in der weißen Substanz perinatalen Verletzungen beteiligt manipuliert werden. Es gibt mehrere Mausmodelle von Erkrankungen der weißen Substanz mit Zellen der Oligodendrozyten-Linie und der Verfügbarkeit dieser Population ermöglicht gründliche Untersuchung der Mechanismen, die Verletzungen als auch um den Nutzen von möglichen Zelltherapie Möglichkeiten zu erkunden, zu verursachen.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> DMEM / F12 1.01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-basic </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Trypsin (0,05%) EDTA </td><td> Quality Biological, Inc. </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

ableitung von gliazellen eingeschränkte vorstufen aus e13-mäusen

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Dies ist ein Protokoll für die Ableitung von Gliazellen eingeschränkten Vorläufer (GFK) Zellen aus dem Rückenmark von E13 Maus-Föten. Diese Zellen sind in der frühen Vorläufer oligodendrocytic Zelllinie. In jüngster Zeit wurden diese Zellen als potentielle Quelle für die restaurative Therapien in der weißen Substanz Krankheiten untersucht worden. Periventrikuläre Leukomalazie (PVL) ist die führende Ursache für nicht-genetische Erkrankung der weißen Substanz in der Kindheit und betrifft bis zu 50% der extrem unreifen Frühgeborenen. Die Daten deuten auf eine erhöhte Anfälligkeit des sich entwickelnden Gehirns zu Hypoxie-Ischämie, oxidativen Stress und Exzitotoxizität, der selektiv auf entstehende weiße Substanz. Glial eingeschränkten Vorläufer (GFK), Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC) und unreifen Oligodendrozyten (preOL) scheinen wichtige Akteure bei der Entwicklung von PVL sein und sind Gegenstand weiterer Untersuchungen. Darüber hinaus haben jüngste Untersuchungen eine Teilmenge von ZNS-Gewebe, die Empfindlichkeit erhöht hat, um Exzitotoxizität als Glutamat identifiziertsowie ein Entwicklungsmuster zu dieser Anfälligkeit. Unser Labor untersucht derzeit die Rolle der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen in PVL und Nutzung Zellen an der GFK-Stadium der Entwicklung. Wir verwenden diese abgeleitet GFK-Zellen in verschiedenen experimentellen Paradigmen, um ihre Reaktion auf Belastungen im Einklang mit PVL wählen zu testen. GFK-Zellen können in vitro in OPCs und preOL werden für die Transplantation Experimenten mit Maus PVL-Modelle und in vitro-Modelle von PVL-ähnliche Beleidigungen einschließlich Hypoxie-Ischämie manipuliert. Durch die Verwendung von kultivierten Zellen und in vitro Studien gäbe Variabilität zwischen Experimenten, die Interpretation der Daten erleichtert reduziert werden. Kultivierte Zellen ermöglicht auch für die Anreicherung des GRP Bevölkerung bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen von kontaminierenden Zellen von nicht-GFK-Phänotyp.

Dieses Protokoll beschreibt die Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus fötalem Rückenmark und gehalten in vitro entweder für die Transplantation oder für die Untersuchung von oligodendrocytic Linie.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

Dies ist ein Protokoll zur Ableitung von glia-restringierten Vorläuferzellen (GRP-Zellen) aus dem Rückenmark von E13-Mausembryonen. Diese Zellen sind frühe Vorläufer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, auf Gliazellen beschränkte Vorläuferzellen oder GRP-Zellen aus fetalen Rückenmarksgeweben zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem die Rückenmarksgewebe von E-13-Feten entnommen und in Kulturplatten mit GRP-selektivem Medium überführt werden. Anschließend wird mittels Immuno-Panning die GRP-Zellpopulation angereichert und die nicht zur GRP-Linie gehörenden Zellen entfernt.Die gereinigten GRP-Zellen können eingefroren und langfristig gelagert werden. Die gereinigten GRP-Zellen können aufgetaut und für zukünftige Experimente verwendet werden, beispielsweise um die Migration transplantierten GRP-Zellen durch eine nur eine Zelle breite Passage zu zeigen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die chirurgischen Schritte schwer zu erlernen sein können, insbesondere für ungeübte Betrachter.Heute demonstrieren Roche De Silva und Joel Marx, die Studenten in unserem Labor sind. Beziehen Sie trächtige Mäusestämme am embryonalen Tag E 12 oder E 13 der fetalen Entwicklung von einem kommerziellen Anbieter oder stellen Sie sie intern her. Der Tag E 1 wird durch das Vorhandensein eines im Vaginalbereich befindlichen Schleimpfropfens definiert.Am Tag nach einer Paarung wird ein weibliches Tier mit einem Männchen zusammengelegt, nachdem alle Instrumente und der Gewebekulturhaube gereinigt wurden. Bereiten Sie eine saubere Petrischale mit 20 Milliliter kaltem Dissektionsmedium vor. Bereiten Sie danach die Maus mit einer Injektion von Chloralhydrat zur Anästhesie vor.Sobald die Maus beispielsweise nicht mehr mit einem Schmerzreflex auf das Zusammendrücken einer Zehe reagiert, euthanasieren Sie sie durch Halswirbelbruch oder Enthauptung. Wir bevorzugen es, das Tier nicht mit CO2 zu anästhesieren, da dies möglicherweise nachgeschaltete Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Feten und letztlich auf die daraus gewonnenen Zellen haben kann. Nach der Desinfektion des Bauchbereichs öffnen Sie den Bauch mithilfe einer großen Schere und einer Pinzette, um die Gebärmutter zu entfernen. Je nach Stamm enthält die Gebärmutter acht bis 14 Feten.Legen Sie den Uterus in frisches, kaltes Dissektionsmedium in eine saubere Petrischale, um die Feten zu isolieren. Spülen Sie zuerst Blut und überschüssiges Gewebe weg. Entnehmen Sie dann jeden Fetus aus dem Uterushorn und trennen Sie ihn vom embryonalen Sack und von der Plazenta.Überführen Sie die Feten mit kleinen Scheren in eine Schale mit frischem, kühlem Dissektionsmedium. Das kalte Medium senkt die Stoffwechselaktivität und erhält die Vitalität der gewonnenen Zellen. Unter einem Dissektionsmikroskop verwenden Sie Pinzette und Feder-Scheren, um die Haut entlang des Rückenmarks zu schneiden, zurückzuklappen und das Rückenmark freizulegen.Quersektionieren Sie das Rückenmark etwa bei C ein und am Anfang des Schwanzes. Entfernen Sie dann vorsichtig das Rückenmark mit all seinem Knochen- und Knorpelgewebe und sammeln Sie jedes präparierte Rückenmark in einer einzelnen Schale. Mit frischem Dissektionsmedium gewinnen wir das gesamte Rückenmark, obwohl eine höhere Zellpopulation aus GRP-Zellen vorhanden ist.Schließlich selektiert das GRP-Medium jedoch für das GRP-Phänotyp, und diese Population wird durch H zwei B fünf-Immuno weiter maximiert, um ein Überwachsen von Meningealgewebe zu verhindern. Entfernen Sie in nachfolgenden Zellkulturen so viel wie möglich von den Meningen aus dem Rückenmark aufgrund der neu entstehenden hervorstehenden peripheren Nerven. Dies ist schwieriger, als Meningealgewebe aus entnommenem zerebralem Gewebe zu entfernen.Wenn so viel wie möglich der Hirnhäute entfernt wurde, überführen Sie die Rückenmarkstücke in eine 20 Millimeter große Petrischale und fahren Sie mit der Dissoziation fort. Die Zellen sind in Vorbereitung. Prewarmen Sie eine Aliquot aus Trypsin mindestens eine halbe Stunde in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.Die folgenden Schritte sollten schnell durchgeführt werden, um die Vitalität des gewonnenen Rückenmarkgewebes zu verbessern. Überführen Sie die Rückenmarksstücke in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das Trypsin und DNase enthält. Anschließend pipettieren Sie die Mischung kurz um.Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Vortexen Sie erneut und setzen Sie die Inkubation anschließend weitere 10 Minuten fort. Geben Sie dann fünf Milliliter GRP-Medium in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang.Bei 1000 U/min den Überstand abpipettieren und resuspendieren. Den Pellet in 10 Milliliter GRP-Medium mit DNAs one suspendieren. Anschließend weitere 10 Minuten inkubieren und die Zellen bei 1000 U/min für fünf Minuten pelletieren.Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in frischem GRP-Medium. Lassen Sie die Zellen durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 40 bis 70 Mikron laufen und impfen Sie sie in PLL-Laminin-beschichtete T-25-Flaschen aus.Inkubieren Sie die Zellen und wechseln Sie am nächsten Tag 100 % des Mediums und danach jeden zweiten Tag oder häufiger, falls die Nährstoffe verbraucht sind. Zu diesem Zeitpunkt haben sich die GRPs angeheftet und beginnen, Fortsätze auszubilden, und können mithilfe von Immuno-Panning optimiert werden. Kultivieren Sie die Zellen weiter, bis sie 85 bis 90 % konfluent sind oder eine Woche vergangen ist.Anschießend die Zellen mit einem Gummischaber oder Trypsin ablösen. Die Zellen in frischem Medium resuspendieren und in drei T-25-Flaschen vermehren, wobei das Medium mindestens alle 48 Stunden gewechselt wird. Wenn die Flaschen konfluent sind, die Zellen wie zuvor in fünf Milliliter GRP-Medium ernten. Die Zellsuspension pipettieren, um Zellklumpen aufzubrechen, und auf eine mit A2B5 beschichtete bakteriologische Platte übertragen.Die Petrischalen inkubieren die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur ohne Schütteln auf den A-two-B-Platten. Danach das Medium abziehen und die Platten vier bis acht Mal mit PBS waschen, um eine hohe Stringenz bezüglich unspezifischer Bindung der Zellen an die Platte aufrechtzuerhalten. Unter Verwendung eines Gummispatels.Sammeln Sie die gewaschenen Zellen in zwei Millilitern GRP-Medium und überführen Sie die Suspension anschließend in mit PLL-Lamina beschichtete Platten oder Kolben mit GRP-Medium. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 85 bis 90 % erreicht haben, gewinnen Sie sie mittels Trypsin, verdünnen und inaktivieren anschließend das Trypsin mit acht Millilitern GRP-Stock-Medium und sammeln die Zellen als Pellet. Resuspendieren Sie das Zellvolumen aus einem T25-Fläschchen in einem Milliliter GRP-Gefriermittel oder das aus einem T75-Fläschchen in zwei Millilitern GRP-Gefriermittel.Passt die Zellsuspensionskonzentration bei Bedarf an und überführt die Zellen langsam in Kryoröhrchen; friert die Zellen über Nacht in einem Kryobehälter mit Isopropanol bei minus 80 Grad Celsius ein; überführt die Zellen am folgenden Tag in die Langzeitlagerung. Die Zellen weisen nach dem Auftauen sechs Monate bis ein Jahr später eine Vitalität von 60 bis 80 % auf.Die Vitalität hängt weitgehend von der Qualität der PLL-Laminin-Beschichtung ab. Nach zwei Tagen in Kultur wurde beobachtet, dass plattierte Rückenmarkzellen unterschiedlicher Morphologie sich maximal anreichern. Die GRP-Population der Zellen ist immunopan, um die A2B5-Population auszuwählen.Wenn ein Problem mit der Kontamination durch Neuroepithelzellen vorliegt, kann ein doppeltes Immunopanning angewendet werden, um zunächst die NCA-positive Population zu entfernen, gefolgt von der A2B5-Selektion. Ein T3-freies B27-Zusatzmittel wurde hinzugefügt, um die Kontamination mit reifen Oligodendrozyten zu verringern. Gereinigte GRP-Zellen waren anhand ihres kleinen Soma und zweier oder dreier kurzer Fortsätze erkennbar.Häufig gab es auch eine kleine, persistierende Population von A zwei B fünf negativen Zellen, die neuroepithelialen Ursprungs waren und entweder zu GRP oder N rp differenzieren konnten. Glücklicherweise desto wahrscheinlicher die Zellen das GRP-Phänotyp annahmen, je länger sie in GRP-Medium kultiviert wurden. Die grundlegenden Techniken dieses Verfahrens können verwendet werden, um andere Zelltypen zu gewinnen, was zusätzliche Fragen beantworten könnte, beispielsweise welche Zelle besser für eine Zellersatztherapie geeignet ist oder ob kortikale Neuronen gute Modelle für die in-vitro-Myelinisierung darstellen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt die Methode zur Isolierung von neuroprecursors aus den Entwicklungsländern Kortex embryonaler Mäuse verwendet. Das Verfahren zur Entfernung von Embryonen aus der Gebärmutter, sezieren die kortikale Gewebe und verdauen die isolierten Hirnrinde dargestellt.

Kultur der Maus Neural Stem Cell Precursors

Das Video demonstrierte die Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus einem neugeborenen Mäusegehirn. Es beinhaltete die enzymatische und mechanische Dissoziation des Gehirns, gefolgt von der Kultivierung in Wachstumsmedien ohne neuronalen Wachstumsfaktor, um eine gemischte Gliapopulation zu erhalten.

Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Die Transplantation von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPCs) hält große Versprechungen in der regenerativen Neurologie. Die systemische Verabreichung von NPCs ist in effektive, invasiv und therapeutisch sehr wirksam Protokoll wandte sich Stammzellen im Gehirn und Rückenmark von Nagern und Primaten durch experimentelle chronisch entzündliche Schädigung des zentralen Nervensystems betroffen zu liefern.

Die systemische Injektion von Neural Stem / Progenitor-Zellen in Mäusen mit chronischer EAE

Dieses Verfahren zeigt, wie Interneuronen im sich entwickelnden Maus-Vorderhirn mittels in utero-Elektroporation gezielt angegriffen werden können. Diese Technik war besonders effizient, um eine selektive Genexpression in Interneuronen-Subtypen zu erreichen, die für die oberflächlichen Schichten des Kortex bestimmt sind.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Hier beschreiben wir die Isolation der magensaftresistenten Gliazellen aus Darm-Submukosa mit sequentiellen EDTA Inkubationen chelatkomplex zweiwertigen kationen und dann Inkubation in nicht-enzymatische Zelle-Recovery-Lösung. Beschichtung der daraus resultierenden Zellsuspension auf Poly-D-Lysin und Laminin führt zu einer hoch angereicherten Kultur der submucosal Gliazellen für Funktionsanalyse.

Isolierung der magensaftresistenten Gliazellen aus der Submukosa und Lamina Propria der Erwachsenen Maus

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Wir beschreiben das Verfahren zur In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in neuronale Zellen mit der Hanging-Drop-Methode. Darüber hinaus führen wir eine umfassende phänotypische Analyse durch RT-qPCR, Immunfluoreszenz, RNA-seq und Durchflusszytometrie durch.

Differenzierung und Charakterisierung neuronaler Vorläufer und Neuronen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Lernen Sie die Ableitung von Gliazellen eingeschränkten Vorstufen aus E13-Mäusen für Neurobiologie und Transplantationsforschung. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung und Langzeitlagerung von GRP-Zellen.

Ableitung von Gliazellen Eingeschränkte Vorstufen aus E13-Mäusen

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