Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein allgemeines Protokoll für die zyklische V-Telemetrie mit schneller Slic-Suche zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hirngewebe für das koronale Schneiden vorbereitet wird. Dann werden Elektroden auf die diskrete Gehirnregion von Interesse gelegt.

Der nächste Schritt besteht darin, die Spannung als Dreieckswellenform durch die Elektrode zu leiten, um Dopamin nachzuweisen. Schließlich wird ein pharmakologischer Wirkstoff von Interesse auf die Hirnscheibe aufgetragen und seine Wirkung auf die präsynaptische Dopamindynamik beobachtet. Letztendlich zeigt dieses Protokoll Veränderungen in der präsynaptischen Dopamindynamik, wie z. B. die stimulierte Dopaminfreisetzung und die Dopaminaufnahmeraten durch zyklische Fast-Scan-Volumentelemetrie

Obwohl diese Methode einen Einblick in die präsynaptische Dopamindynamik geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich tierischer und Neurotransmitter wie Ratten und Fruchtfliegen sowie Serotonin und Noradrenalin, die respektabel demonstrieren, dass das Verfahren Francis Mena, MEA Khalid und Erin oo, die Doktoranden aus meinem Labor, sein werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, heißt es im beigefügten Manuskript. Bereiten Sie drei Arten von künstlichen zerebralen Rückenmarksflüssigkeitslösungen vor: Saccharose, A-C-S-F-A-C-S-F-Lösung für metrische Volta-Aufzeichnungen und modifizierte A-Liquorlösung für die Elektrodenkalibrierung. Als nächstes 10 Milliliter Saccharose A CSF in ein kleines Becherglas geben und in einen Eiskübel geben. Geben Sie dann den Sofortkleber Loctite in einen Eiskübel.

Bereiten Sie danach eine Rasierklinge und die für die Dissektion erforderlichen Werkzeuge wie Pinzette, Spatel und Schere vor, indem Sie sie mit einem Alkoholpad abwischen. Opfere dann eine Maus durch Enthauptung und entferne schnell ihr Gehirn. Legen Sie das Gehirn für ca. 10 Minuten in ein Becherglas mit eiskalter Saccharose, einem Liquor.

In der Zwischenzeit das VIBRAM zum Schneiden vorbereiten. Geben Sie etwas zerstoßenes Eis in das Probenbad. Setzen Sie dann die Probenkammer in den Vibram ein und fixieren Sie sie.

Fügen Sie mehr Eis um die Probenkammer hinzu, um die Lücken zu füllen, und stellen Sie sicher, dass kein Eis in die Kammer gelangt. Legen Sie anschließend eine gereinigte Rasierklinge in den Klingenhalter. Füllen Sie dann die Probenkammer mit eiskalter Saccharose A CSF.

Gießen Sie anschließend etwas kalte Saccharose A CSF auf ein Stück Papiertuch auf einer nach oben gebogenen Petrischale. Übertragen Sie das frisch präparierte Mausgehirn mit einer Pinzette darauf. Entfernen Sie dann das Kleinhirn, indem Sie mit einer Rasierklinge entlang der medialen Seitenachse schneiden.

Dadurch entsteht ein flacher Boden, der auf dem Vibramtisch befestigt werden kann. Geben Sie anschließend einen Tropfen des Loctite-Klebstoffs auf den Probentisch. Befestigen Sie das flache Ende des vorbereiteten Gehirns sofort auf der Bühne und halten Sie es so aufrecht wie möglich.

Platzieren Sie dann den Tisch in der Probenkammer und ziehen Sie die Schraube fest. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig in den Saccharose-A-Liquor in der Kammer eingetaucht ist. Stellen Sie danach den Tisch mit dem Regler so ein, dass die Rasierklinge mit der Oberseite des Gehirns ausgerichtet ist.

Optimale Parameter für den Vibrator erhält man, indem man die Frequenz und Drehzahl auf niedrig stellt. Stellen Sie als Nächstes die Scheibendicke auf 400 Mikrometer ein. Die ersten Scheiben enthalten in der Regel kein Striatum.

Wiederholen Sie das Schneiden, bis die Scheiben mit dem Striatum erhalten sind. Sobald der stri-AAL-Bereich erreicht ist, heben Sie die Scheibe mit einem Pinsel an und legen Sie sie in ein Becherglas mit sauerstoffreicher Raumtemperatur. Ein Liquor.

Typischerweise kann man drei bis vier Scheiben erhalten, die den Thesalkomplex enthalten, in dem das Caudatus Putamen und der Nucleus accumbens enthalten sind. Lassen Sie die Scheiben mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem mit 95 %O2 und 5 %CO2 sprudelnden Liquor akklimatisieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. Um diesen Vorgang zu starten, verbinden Sie den Schlauch mit der Untertauchaufnahmekammer.

Pumpen Sie dann das sauerstoffhaltige Liquor mit Raumtemperatur A mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute. Stellen Sie den Temperaturregler auf 32 Grad Celsius ein, nachdem ein Liquor den speziell angefertigten Scheibenhalter gefüllt hat. Entfernen Sie alle Luftblasen unter dem Netz mit einer Nadelspritze.

Erzeugen Sie mit einer Spritze einen Unterdruck im Abflussschlauch, um den Durchfluss zu starten Um den Pufferüberlauf zu kontrollieren. Legen Sie ein Kim-Tuch auf den Rand des Scheibenhalters, das als Docht dient. Übertragen Sie dann eine Scheibe in den Scheibenhalter in der Aufnahmekammer, die kontinuierlich bei Raumtemperatur mit sauerstoffhaltigem A-Liquor durchblutet wird.

Tauchen Sie die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in den Scheibenhalter und verbinden Sie sie mit einer Krokodilklemme mit dem Kopftisch. Befestigen Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode an dem Mikromanipulator und verbinden Sie sie mit einer Krokodilklemme mit dem Kopftisch. Senken Sie als nächstes die Wolfram-Stimulationselektrode und die Kohlefaser-Mikroelektrode auf die Oberfläche der Salhirnscheibe.

Die Stimulationselektrode wird verwendet, um entweder einen einzelnen Impuls oder mehrere Impulse elektrischer Stimulationen an die Scheibe abzugeben, um die Freisetzung von Neurotransmittern hervorzurufen, um das elektrisch evozierte Dopamin unter Verwendung der zyklischen Fast-Scan-Vol-Telemetrie oder FSCV zu messen, und Spannung in einer dreieckigen Wellenform an die Elektrode anzulegen. Halten Sie das Potential der Kohlefaser-Mikroelektrode bei minus 0,4 Volt. Erhöhen Sie ihn auf einen positiven Grenzwert von 1,2 Volt.

Reduzieren Sie es dann wieder auf minus 0,4 Volt bei einer Abtastrate von 400 Volt pro Sekunde. Stimulieren Sie die Scheibe alle fünf Minuten und führen Sie die volmetrische Messung des resultierenden Dopamin-FLX für jeweils 15 Sekunden nach mindestens drei Minuten durch. Stabile elektrisch stimulierte Dopamin-Freisetzungsaufzeichnungen, die als weniger als 10 % Unterschied zwischen den Peakhöhen definiert sind.

Wechseln Sie zur Perfusion der Scheibe mit einem Liquor, der pharmakologischen Wirkstoff von Interesse enthält, bei einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute für 30 Minuten, um eine maximale Wirkung zu erzielen, ähnlich wie bei der Aufzeichnung zu Studienbeginn. Die elektrisch stimulierte Dopaminausschüttung wird während der pharmakologischen Perfusion alle fünf Minuten freigesetzt. Abbildung A ist ein Beispiel für die elektrisch evozierte Dopaminfreisetzungsmessung mittels FSCV nach Einzelpulsstimulation im Caudatus Putamen.

Abbildung B zeigt ein dreidimensionales Pseudo-Farbdiagramm, das die Informationen sowohl aus den Strom-Zeit-Kurven als auch aus dem zyklischen Volt-Graham kombiniert. In ähnlicher Weise zeigen Abbildung A und C die Dopaminfreisetzung, die durch einen einzigen elektrischen Stimulationsimpuls im Kern bzw. in der Schale des Nucleus accumbens hervorgerufen wird, und die dreidimensionalen Pseudofarbendiagramme für den Kern und die Schale des Nucleus accumbens sind in Abbildung B bzw. D dargestellt. Hier sind die repräsentativen Spuren zu sehen, nachdem die Scheibe 30 Minuten lang mit einem pharmakologischen Wirkstoff behandelt wurde, gefolgt von Einzelpulsstimulationen, um die Dopaminausschüttung im Schwanzputamen hervorzurufen.

Die in den Experimenten verwendeten Wirkstoffe sind Chinol, Methamphetamin und der vom Gehirn abgeleitete neurotrophe Faktor. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man koronale Hirnschnitte von Mäusen vorbereitet, um die präsynaptische Dopamindynamik mit Hilfe von schneller und wahrscheinlicher Telemetrie zu erhalten und zu messen.