Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen allgemeinen Protokollablauf für die schnelle Scan-Zyklus-V-Telemetrie an Schnitten darzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hirngewebe für koronare Schnitte vorbereitet wird. Anschließend werden Elektroden in der jeweiligen interessierenden Hirnregion platziert.

Der nächste Schritt besteht darin, über die Elektrode eine Spannung in Form einer dreieckförmigen Welle anzulegen, um Dopamin nachzuweisen. Schließlich wird ein pharmakologischer Wirkstoff der Wahl auf das Gehirnschnittpräparat aufgebracht und dessen Einfluss auf die präsynaptischen Dopamindynamiken beobachtet. Letztendlich zeigt dieses Protokoll Veränderungen in den präsynaptischen Dopamindynamiken auf, wie beispielsweise stimulierte Dopaminfreisetzung und Dopamin-Aufnahmeraten mittels schneller Scan-Cyclic-Voltammetrie.

Obwohl diese Methode Einblicke in die präsynaptische Dopamindynamik ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, einschließlich Tierarten und Neurotransmitter wie Ratten und Fruchtfliegen sowie Serotonin und Noradrenalin. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Francis Mena, MEA Khalid und Erin oo, die Doktoranden aus meinem Labor. Um dieses Verfahren zu beginnen, gemäß dem beigefügten Manuskript, bereiten Sie drei Arten künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeitslösungen vor: eine Saccharose-A-C-S-F-A-C-S-F-Lösung für voltammetrische Messungen und eine modifizierte A-CSF-Lösung zur Elektrodenkalibrierung. Danach überführen Sie 10 Milliliter der Saccharose-A-CSF-Lösung in ein kleines Becherglas und stellen es in einen Eisbehälter. Anschließend stellen Sie den Sofortkleber Loctite ebenfalls in einen Eisbehälter.

Danach bereiten Sie eine Rasierklinge und die für die Dissektion erforderlichen Werkzeuge, wie Pinzette, Spatel und Schere, vor, indem Sie diese mit einem Alkoholtupfer abwischen. Anschließend opfern Sie eine Maus durch Enthauptung und entfernen schnell das Gehirn. Legen Sie das Gehirn etwa 10 Minuten lang in ein Becherglas mit eiskaltem Sucrose, A CSF.

Unterdessen bereiten Sie das VIBRAM zum Schneiden vor. Geben Sie etwas zerstoßenes Eis in das Probennassbad. Dann stellen Sie die Probenkammer in das Vibram und befestigen Sie sie fest.

Fügen Sie mehr Eis um die Probenkammer hinzu, um die Lücken zu füllen, und stellen Sie sicher, dass kein Eis in die Kammer gelangt. Danach setzen Sie eine gereinigte Rasierklinge in den Klingenhalter ein. Füllen Sie anschließend die Probenkammer mit eiskaltem Sucrose-A-CSF.

Anschließend etwas kalte Saccharose-A-Hirnwasser auf ein Stück Papiertuch auf einer umgedrehten Petrischale geben. Das frisch präparierte Maushirn mit einer Pinzette darauf übertragen. Dann das Kleinhirn entfernen, indem man entlang der mediolateralen Achse mit einer Rasierklinge schneidet.

Dadurch entsteht eine flache Basis, die an der Vibram-Plattform befestigt werden kann. Geben Sie anschließend einen Tropfen des Loctite-Klebstoffs auf die Probenträgerplattform. Befestigen Sie umgehend das flache Ende des präparierten Gehirns auf der Plattform und halten Sie es so aufrecht wie möglich.

Danach platzieren Sie den Objekttisch in der Probenkammer und ziehen die Schraube fest. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig in der Saccharose-A-CSF-Lösung in der Kammer eingetaucht ist. Danach justieren Sie den Objekttisch mithilfe der Steuerung, sodass die Rasierklinge mit der Oberseite des Gehirns ausgerichtet ist.

Die optimalen Parameter für den Vibratome werden durch Einstellung der Frequenz und Geschwindigkeit auf niedrig erzielt. Anschließend sollte die Schnittdicke auf 400 Mikrometer eingestellt werden. Die ersten paar Schnitte enthalten gewöhnlich nicht das Striatum.

Wiederholen Sie das Schneiden, bis die Schnitte das Striatum enthalten. Sobald der AAL-Bereich des Striatums erreicht ist, heben Sie den Schnitt mit einem Pinsel auf und legen Sie ihn in einen Becher mit oxygenierter Raumtemperatur. Eine CSF.

Typischerweise können drei bis vier Schnitte gewonnen werden, die den Striatum-Komplex enthalten, in dem der Caudatusputamen und der Nucleus accumbens enthalten sind. Lassen Sie die Schnitte mindestens eine Stunde lang in ACSF, das mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ durchblubbert wird, bei Raumtemperatur akklimatisieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. Um dieses Verfahren zu beginnen, schließen Sie den Schlauch an die Submersions-Aufzeichnungskammer an.

Pumpen Sie dann das oxygenierte A-CSF bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute. Stellen Sie den Temperaturregler auf 32 Grad Celsius, nachdem das A-CSF den speziell angefertigten Schnothalter gefüllt hat. Entfernen Sie Luftblasen unter dem Netz mit einer Nadel und einer Spritze.

Erzeugen Sie mit einer Spritze Unterdruck in der Ausflussleitung, um den Fluss zu starten, um das Überlaufen des Puffers zu kontrollieren. Legen Sie ein Kim-Tuch an die Kante des Schnethalters, das als Docht fungiert. Überführen Sie dann einen Schnitt in den Schnethalter in der Ableitungskammer, die kontinuierlich mit oxygeniertem aCSF bei Raumtemperatur perfundiert wird.

Legen Sie die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in den Schnalthalter und verbinden Sie sie mit der Kopfverstärkerstufe über eine Krokodilklemme. Befestigen Sie die Kohlenstofffasermikroelektrode am Mikromanipulator und verbinden Sie sie ebenfalls mit der Kopfverstärkerstufe über eine Krokodilklemme. Senken Sie danach die Wolframelektrode zur Stimulation und die Kohlenstofffasermikroelektrode auf die Oberfläche des sagittalen Gehirnschnitts ab.

Die stimulierende Elektrode wird verwendet, um entweder einen einzelnen Impuls oder mehrere Impulse elektrischer Stimulationen an das Schnittpräparat abzugeben, um die Freisetzung von Neurotransmittern hervorzurufen und den elektrisch hervorgerufenen Dopamin mittels schneller Scan-Kreisvoltammetrie oder FSCV zu messen, wobei eine Spannung in Form einer Dreieckswelle an die Elektrode angelegt wird. Halten Sie das Potential der Kohlenstoff-Mikroelektrode bei minus 0,4 Volt. Erhöhen Sie es auf einen positiven Grenzwert von 1,2 Volt.

Bringen Sie es anschließend mit einer Scanrate von 400 Volt pro Sekunde wieder auf minus 0,4 Volt zurück. Stimulieren Sie die Schnitte alle fünf Minuten und nehmen Sie jeweils 15 Sekunden lang die volumetrische Messung des resultierenden Dopamin-Freisetzungsstroms (FLX) nach mindestens drei Stimulationsdurchgängen vor. Als stabil definierte elektrisch stimulierte Dopaminfreisetzungsaufzeichnungen weisen eine Differenz zwischen den Peakhöhen von weniger als 10 % auf.

Wechseln Sie dazu über, die Schnitte mit einem CSF, der den gewünschten pharmakologischen Wirkstoff enthält, für 30 Minuten mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute zu perfundieren, um einen maximalen Effekt zu erzielen, der mit der Basalaufzeichnung vergleichbar ist. Nehmen Sie alle fünf Minuten während der pharmakologischen Perfusion die elektrisch stimulierte Dopaminausschüttung auf. Abbildung A zeigt ein Beispiel für die Messung der elektrisch hervorgerufenen Dopaminausschüttung mittels FSCV nach Einzelpulsstimulation im Caudatoputamen.

Abbildung B zeigt eine dreidimensionale Pseudofarbdarstellung, die die Informationen aus den Strom-Zeit-Spuren und der zyklischen Voltammetrie nach Graham kombiniert. Ebenso zeigen Abbildung A und C die durch einen einzelnen elektrischen Stimulationsimpuls hervorgerufene Dopaminfreisetzung im Kern bzw. im Mantel des Nucleus accumbens, und die dreidimensionalen Pseudofarbdarstellungen für den Kern und den Mantel des Nucleus accumbens sind in Abbildung B bzw. D dargestellt. Gezeigt sind hier repräsentative Spuren nach einer 30-minütigen Behandlung des Schnitts mit einem pharmakologischen Wirkstoff, gefolgt von Einzelimpulsstimulationen zur Hervorrufung der Dopaminfreisetzung im Caudatum-Putamen.

Die in den Experimenten verwendeten Wirkstoffe sind Quinol, Methamphetamin und das aus dem Gehirn stammende neurotrope Faktor. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man koronale Gehirnschnitte von Mäusen präpariert, um präsynaptische Dopamindynamiken mittels schneller und wahrscheinlich Telemetrie zu erfassen und zu messen.