Präsynaptische Dynamics in striatalen Hirnschnitten mit Fast-Scan-Cyclovoltammetrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen allgemeinen Protokollablauf für die schnelle Scan-Zyklische-V-Telemetrie an Schnitten zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirngewebe für koronale Schnitte präpariert wird. Anschließend werden Elektroden in der jeweiligen interessierenden Gehirnregion platziert.

Der nächste Schritt besteht darin, über die Elektrode eine Spannung in Form einer dreieckförmigen Welle anzulegen, um Dopamin nachzuweisen. Schließlich wird ein pharmakologisches Agens der Wahl auf den Gehirnschnitt aufgebracht und dessen Wirkung auf die präsynaptischen Dopamindynamiken beobachtet. Letztendlich zeigt dieses Protokoll Veränderungen in den präsynaptischen Dopamindynamiken auf, wie beispielsweise stimulierte Dopaminfreisetzung und Dopamin-Aufnahmeraten mittels schneller Scan-Cyclic-Voltammetrie.

Obwohl diese Methode Einblicke in die präsynaptische Dynamik von Dopamin ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, einschließlich Tierarten und Neurotransmitter wie Ratten und Fruchtfliegen sowie Serotonin und Noradrenalin. Den Ablauf demonstrieren Francis Mena, MEA Khalid und Erin oo, die Doktoranden aus meinem Labor. Um mit dem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie gemäß der beigefügten Publikation drei Arten von künstlichem zerebrospinalen Flüssigkeitslösungen vor: eine Saccharose-A-C-S-F-A-C-S-F-Lösung für voltammetrische Messungen und eine modifizierte A-CSF-Lösung zur Elektrodenkalibrierung. Danach überführen Sie 10 Milliliter der Saccharose-A-CSF-Lösung in ein kleines Becherglas und stellen es in einen Eisbehälter. Anschließend stellen Sie den Instant-Loctite-Klebstoff ebenfalls in einen Eisbehälter.

Danach bereiten Sie eine Rasierklinge und die für die Dissektion erforderlichen Werkzeuge, wie Pinzette, Spatel und Schere, vor, indem Sie diese mit einem Alkoholtupfer abwischen. Anschließend opfern Sie eine Maus durch Enthauptung und entfernen schnell das Gehirn. Legen Sie das Gehirn etwa 10 Minuten lang in ein Becherglas mit eiskaltem Sucrose, A CSF.

Unterdessen bereiten Sie das VIBRAM zum Schneiden vor. Geben Sie etwas zerstoßenes Eis in das Probennassbad. Dann stellen Sie die Probenkammer in das Vibram und befestigen Sie sie fest.

Fügen Sie weiteres Eis um die Probekammer hinzu, um die Lücken zu füllen, und stellen Sie sicher, dass kein Eis in die Kammer gelangt. Danach setzen Sie eine gereinigte Rasierklinge in den Klingenhalter ein. Füllen Sie anschließend die Probekammer mit eiskaltem Sucrose-A-CSF.

Anschließend etwas kalte Saccharose-A-Hirn-Rückenmarks-Flüssigkeit auf ein Stück Papiertuch geben, das auf einer umgedrehten Petrischale liegt. Das frisch präparierte Maushirn mit einer Pinzette darauf übertragen. Dann das Kleinhirn entfernen, indem entlang der medialen lateralen Achse mit einer Rasierklinge geschnitten wird.

Dadurch entsteht eine flache Basis, die an der Vibram-Plattform befestigt werden kann. Als Nächstes einen Tropfen des Loctite-Klebstoffs auf die Probenträgerplattform geben. Unmittelbar danach das flache Ende des präparierten Gehirns auf die Plattform aufbringen und so aufrecht wie möglich halten.

Danach platzieren Sie den Objekttisch in der Probenkammer und ziehen die Schraube fest. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn vollständig in der Saccharose-A-CSF-Lösung in der Kammer eingetaucht ist. Danach justieren Sie den Objekttisch mithilfe der Steuerung, sodass die Rasierklinge mit der Oberseite des Gehirns ausgerichtet ist.

Die optimalen Parameter für den Vibratome werden durch Einstellung der Frequenz und Geschwindigkeit auf niedrig erzielt. Anschließend stellen Sie die Schnittdicke auf 400 Mikrometer ein. Die ersten paar Schnitte enthalten gewöhnlich nicht das Striatum.

Wiederholen Sie das Schneiden, bis die Schnitte das Striatum enthalten. Sobald der AAL-Bereich des Striatums erreicht ist, heben Sie den Schnitt mit einem Pinsel auf und legen Sie ihn in einen Becher mit oxygenierter Raumtemperatur. Eine CSF.

Typischerweise können drei bis vier Schnitte gewonnen werden, die das Striatum enthalten, in dem der Caudatus-Putamen-Komplex und der Nucleus accumbens enthalten sind. Lassen Sie die Schnitte mindestens eine Stunde lang in aCSF, das mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ durchblubbert wird, bei Raumtemperatur akklimatisieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren. Um dieses Verfahren zu beginnen, schließen Sie den Schlauch an die Tauchkammer für die Ableitung an.

Pumpen Sie dann das oxygenierte A-CSF bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute. Stellen Sie den Temperaturregler auf 32 Grad Celsius, nachdem das A-CSF den speziell angefertigten Schnothalter gefüllt hat. Entfernen Sie Luftblasen unter dem Netz mit einer Nadel und einer Spritze.

Erzeugen Sie mit einer Spritze Unterdruck in der Ausflussleitung, um den Fluss zu starten, um das Überlaufen des Puffers zu kontrollieren. Legen Sie ein Kim-Tuch an die Kante des Schnitthalters, um als Docht zu wirken. Überführen Sie dann einen Schnitt in den Schnalthalter in der Ableitungskammer, die kontinuierlich mit oxygeniertem A CSF bei Raumtemperatur perfundiert wird.

Tauchen Sie die Silber-Silberchlorid-Referenzelektrode in den Schnitthalter ein und verbinden Sie sie mit der Headstage über einen Krokodilklemmenanschluss. Befestigen Sie die Kohlenstofffaser-Mikroelektrode am Mikromanipulator und verbinden Sie sie ebenfalls mit der Headstage über eine Krokodilklemme. Senken Sie anschließend die Wolframelektrode zur Stimulation und die Kohlenstofffaser-Mikroelektrode auf die Oberfläche des Hirnschnitts ab.

Die Stimulations-Elektrode wird verwendet, um entweder einen einzelnen Impuls oder mehrere Impulse elektrischer Stimulationen an das Schnittpräparat abzugeben, um die Freisetzung von Neurotransmittern hervorzurufen und den elektrisch hervorgerufenen Dopamin mittels schneller Scan-Kreisvoltammetrie oder FSCV zu messen, wobei eine Spannung in Form einer Dreieckswelle an die Elektrode angelegt wird. Halten Sie das Potential der Kohlenstoff-Mikroelektrode bei minus 0,4 Volt. Erhöhen Sie es auf einen positiven Grenzwert von 1,2 Volt.

Bringen Sie es anschließend mit einer Scanrate von 400 Volt pro Sekunde wieder auf minus 0,4 Volt zurück. Reizen Sie die Schnitte alle fünf Minuten und nehmen Sie jeweils 15 Sekunden lang die volumetrische Messung des resultierenden Dopamin-Freisetzungsstroms (FLX) nach mindestens drei stabilen elektrisch stimulierte Dopaminfreisetzungsaufzeichnungen vor, definiert als weniger als 10 % Differenz zwischen den Peakhöhen.

Wechseln Sie zur Perfusion des Schnitts mit einem CSF, das den gewünschten pharmakologischen Wirkstoff enthält, mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute für 30 Minuten, um einen maximalen Effekt im Vergleich zur Basislinienaufnahme zu erzielen. Die elektrisch stimulierte Dopaminausschüttung wurde alle fünf Minuten während der pharmakologischen Perfusion gemessen. Abbildung A zeigt ein Beispiel für die elektrisch hervorgerufene Messung der Dopaminausschüttung mittels FSCV nach Einzelpulsstimulation im Caudatus-Putamen.

Abbildung B zeigt eine dreidimensionale Pseudofarbdarstellung, die die Informationen aus den Strom-Zeit-Spuren und der zyklischen Voltammetrie nach Graham kombiniert. Ebenso zeigen Abbildung A und C die durch einen einzelnen elektrischen Stimulationsimpuls hervorgerufene Dopaminfreisetzung im Kern bzw. im Mantel des Nucleus accumbens, und die dreidimensionalen Pseudofarbdarstellungen für den Kern und den Mantel des Nucleus accumbens sind in Abbildung B bzw. D dargestellt. Gezeigt sind hier repräsentative Spuren nach einer 30-minütigen Behandlung des Schnitts mit einem pharmakologischen Wirkstoff, gefolgt von Einzelimpulsstimulationen zur Hervorrufung der Dopaminfreisetzung im Caudatoputamen.

Die in den Experimenten verwendeten Wirkstoffe sind Quinol, Methamphetamin und das aus dem Gehirn stammende neurotrope Faktor. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man koronale Hirnschnitte von Mäusen präpariert, um präsynaptische Dopamindynamiken mittels schneller und wahrscheinlich Telemetrie zu erfassen und zu messen.