Name: Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Lernen Sie, wie Sie Invitrogen Nupage Novex Minigel-Kassetten wiederverwenden, um kostengünstige Polyacrylamid-Gele für die Proteinelektrophorese herzustellen und bei 4°C zu lagern.

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Die Autoren danken dem Howard Hughes Medical Institute für eine UF Science for Life Award an AH

1. Vorbereitung der Kassetten <ol><li> Saubere Vorder-und Rückseite eines gebrauchten Platten Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassette, oder andere Geschäfte Minigel Kassette. </li><li> Bereiten Sie etwa 1-3 ml Kunststoff Epoxy und gut mischen nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Anwenden das Epoxidharz auf die Innenkante der Frontplatte, wobei die beiden Platten in Berührung kommen wird, wenn die Kassette montiert ist. </li><li> Schieben ein Stück Filterpapier Papier oder Karton durch den Bodenschlitz der Rückplatte bei der Montage der Kassette, um überschüssiges Epoxidharz von Abdichten der Öffnung zu verhindern. Entfernen Sie das Filterpapier, sobald die beiden Platten zusammengebaut werden. </li><li> Zeigen Binder Clips an den Rändern für einen dichten Verschluss, und lassen Sie die Kassetten sitzen über Nacht für das Epoxidharz vollständig aushärten. </li><li> Verschließen Sie den Schlitz an der Unterseite der hinteren Platte mit Isolierband. </li></ol> 2. Gießen des Trenngels <ol><li> Um einen 125-ml Seitenarm Kolben, fügen Sie die folgende:2,25 ml 4X Tris-Base Trenngelpuffer pH 8,70, 3,50 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 3,25 ml Typ I analysenreines Wasser (IRG-H 2 O) mit einem Gesamtvolumen von 9 ml. </li><li> De-Gas die Lösung für 10 min durch Anbringen der Seitenarm des Kolbens auf einer Vakuumvorrichtung, und Platzieren eines invertierten Anschlag auf dem oberen Ende des Kolbens. </li><li> Übertragen Sie die 9 ml entgastem Lösung auf eine 50 ml Einweg-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 30 ul 10% ammounium Persulfat (APS) und 6 ul N, N, N ', N',-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und mischen auch durch Schwenken der Lösung zu vermeiden, Einführen von Bläschen. </li><li> Gießen Sie sofort die Lösung in der Kassette, so dass es zu laufen an der Seite der Kassette, um alle Blasenbildung zwischen den Gel-Platten zu verhindern. Füllen Sie die Kassette auf ca. 2 cm vom oberen Rand des vorderen (kürzeren) Platte. </li><li> Sanft fügen Sie 0,5 ml 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt und lassen Sie das Gel für 1 polymerisierenStunde. </li></ol> 3. Gießen der Sammelgel <ol><li> Fügen Sie das folgende in einen 125 ml Seitenarm Flasche: 0,75 ml 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer pH 6,80, 0,40 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 1,85 ml IRG-H 2 O mit einem Gesamtvolumen von 3 ml. </li><li> De-Gas die Lösung für 10 min, wie in Schritt 2 beschrieben. </li><li> Während die Stacking-Gel-Lösung Entgasung, giesst die 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer von der Oberseite des Trenngels gesättigt. Spülen Sie den oberen Rand des Trenngels einmal mit IRG-H 2 O. Gießen Sie das Wasser ab und verwenden Sie eine saugfähige oder Whatman-Filterpapier, um restliche Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Nehmen Sie 3 ml Ihren entgaste Lösung und fügen 9 ul von 10% APS und 2 ul TEMED und gut mischen. </li><li> Schnell geben die Lösung in der Kassette, so dass er mittig entlang der Seite der Kassette, bis sie nahe dem oberen Rand der kürzeren vorderen Gelplatte ist. </li><li> Legen Sie eine saubere Gel Kamm in der Spitze des Gelkassette,Stellen Sie einen Binder Clip auf der Kassette über den Kamm zu halten Sie es fest. Lassen Sie die Stacking-Gel für 1 Stunde bis über Nacht zu polymerisieren. </li></ol> 4. Speichern Sie das Gel <ol><li> Wenn das Gel vollständig polymerisiert, entfernen Sie die Binder Clips und legen Sie die Kassette in einer heißsiegelfähigen Plastikbeutel oder eine wieder verschließbare Plastiktüte. </li><li> Gießen 20 ml 1X Stacking-Gel Puffer, 0,1% Natriumazid in den Beutel enthält. </li><li> Heißzusiegeln den Beutel für 5 Sekunden und stellen Sie sicher, es gibt keine Lecks in der Tasche. </li><li> Bewahren Sie das Gel bei 4 ° C </li></ol> 5. Die Vorbereitung der Proben <ol><li> In einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen, summieren sich auf 6,5 ul der Probe Protein, 7,5 ul 2x Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer, 1 ul 100 mM Dithiothreitol (DTT) und IRG-H 2 O (falls erforderlich) für ein Gesamtvolumen von 15 ul. </li><li> Mischen Sie die Probe durch Vortexen, und kurz zentrifugieren Sie die Probe auf Inhalte auf dem Boden des Röhrchens zu bringen. </li> &lt;li&gt; denaturieren die Probe bei 70 ° C für 10 min. </ol> 6. Das Ausführen des Gels <ol><li> Richten Sie das Novex Gel-Apparatur. </li><li> Zugabe von 200 ml Tris-Glycin-Laufpuffer, die 500 ul NuPAGE Antioxidationsmittel in die innere Kammer, und 300 ml Tris-Glycin-Laufpuffer in die äußere Kammer enthält. </li><li> Legen Sie die denaturierten Proteinproben (15 ul) in die Vertiefungen mit einem Gelbeladung Pipettenspitze. </li><li> Die Elektrophorese bei 200 V für 60-70 min. </li></ol> 7. Färbung des Gels <ol><li> Nehmen Sie die Kassette aus dem Gel Apparate und brechen die Epoxiddichtung durch Aufhebeln der beiden Kunststoff-Gel-Platten auseinander mit einem Messer oder einem Gel steif Spachtel. Trennen Sie vorsichtig das Gel von den Platten, darauf achtend, nicht reißen das Gel. </li><li> Spülen des Gels mit IRG-H 2 O dreimal mit leichtem Schütteln. </li><li> Färben des Gels mit Invitrogen SimplyBlue SafeStain für 1 Stunde unter leichtem Rühren. </li><li> Abgießen und FärbelösungEntfärben des Gels mit IRG-H 2 O. </li></ol> 8. Die Reinigung der Kassetten <ol><li> Verwenden Sie einen Spachtel aus Metall zu kratzen oder ablösen all dem Epoxidharz auf den Kassetten, so dass sie wieder verwendet werden können. </li><li> Waschen Sie jede der Kunststoff-Gel-Platten mit einer milden Reinigungslösung, und spülen Sie gut mit Leitungswasser mit destilliertem Wasser spülen. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Da Epoxy eine wasserdichte Abdichtung (1) bilden wird, werden die Kassetten nicht lecken, wenn das Acrylamid-Lösung in sie gegossen wird. Darüber hinaus können die Gelkassetten leicht geöffnet werden, um das Gel für die Färbung abzurufen, und das Epoxidharz kann aus der Kassetten abgezogen werden, um ihre weitere Wiederverwendung zu ermöglichen. Wie in 2 gezeigt ist, zeigt das Gel klare Trennung von Protein-Marker und Probe Bands für den routinemäßigen-Elektrophorese. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. AppliKationen von Epoxy zu Minigel Kassetten abzudichten. Eine dünne Schicht von Epoxid wird an den Rand einer der Kassetten vor der Montage aufgebracht. Um das Epoxid zu markieren, war es falsch-rot gefärbt in diesem Bild. <img src="/files/ftp_upload/3465/3465fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Trennung von Proteinen auf einem SDS-Tris-Glycin-Gel gegossen und mit wieder verwendet Minigel Kassetten. SDS-PAGE durchgeführt wurde, wie oben beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel aus der Minigel Kassette, in SimplyBlue SafeStain gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt entfernt und fotografiert mit weißem Licht übertragen. Spur M enthält SeeBlue Plus2 Pre-gefärbten Protein-Standards. Die Molekulargewichte der Proteine ​​in Spur M sind auf der rechten Seite des Gels in Kilodalton (kDa) angegeben. Die anderen Spuren für Proteine ​​aus einem geklärten Lysat von Bakterien Expression eines Glutathion-S-Transferase (GST)-markierte Protein. Die Proteine ​​sind diejenigen vom g gewaschenlutathione Kügelchen vor der Elution des GST-markierten Proteins.

<ol><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Raymond, S., Weintraub, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+gel+as+a+supporting+medium+for+zone+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis.</a> Science. 130, 711-711 (1959).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Protein-Gel-Elektrophorese ist eine unverzichtbare Methode für die meisten molekularbiologischen Laboratorien. Im Handel erhältliche Minigelen bieten ein hohes Maß an Komfort, sondern kann teuer werden. Hier zeigen wir, wie man die Wiederverwendung der Minigel Kassetten aus einer populären Marke im Handel erhältliche Minigelen. Dieses Verfahren hält die Einfachheit eines vorgefertigten Quelle von Gelen, aber nur einen Bruchteil der Kosten für im Handel erhältliche Minigelen. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren wir...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Cassette (1,0 mm) </td><td> Invitrogen </td><td> NC2010 </td><td> Erhältlich in 2, 5, 10, 12, 15 und 2D-Brunnen </td></tr><tr><td> Kunststoff Epoxy </td><td> Loctite </td><td> 108771 </td><td></td></tr><tr><td> Electrical Tape </td><td> Scotch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 125 ml Seitenarm Kolben </td><td> Pyrex </td><td> 5360 </td><td></td></tr><tr><td> 4X Tris-Base Trenngelpuffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-Base pH 8,7 </td></tr><tr><td> Acrylamid </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01065-500 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-Acrylamid </td><td> MP Biomedicals, Inc. </td><td> 800173 </td><td></td></tr><tr><td> 30,8% Acrylamid-Lösung </td><td></td><td></td><td> 30:0.8 Acrylamid: Bisacrylamid in IRG-H 2 O </td></tr><tr><td> 10% igen APS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP179-25 </td><td> 0,1 g Ammoniumpersulfat in 1 ml IRG-H 2 O, unmittelbar vor der Verwendung hergestellt </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Arcos Organics </td><td> 138450500 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt </td><td></td><td></td><td> 5.02 1-Butanol auf 1X Trenngelpuffer </td></tr><tr><td> 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer </td><td></td><td></td><td> 1,5 M Tris-Base pH 6,8 </td></tr><tr><td> Gel Kamm </td><td> Invitrogen </td><td> NC3015 </td><td> 15 gut, 1,0 mm Stärke </td></tr><tr><td> Impulssiegelgerät </td><td> TEW Elektroheizausruestung </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heisssiegelfähige Pouch </td><td> Kapak / Scotchpak </td><td></td><td> 1 Pint Größe (6,5 &quot;x 8&quot;) </td></tr><tr><td> Gel-Speicherpuffer </td><td></td><td></td><td> 1X Sammelgel-Puffer mit 0,1% Natriumazid </td></tr><tr><td> Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2X) </td><td> Invitrogen </td><td> LC2676 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> FisherBiotech </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> 10X Tris-Gylcine Laufpuffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td> 1L von 10X Lager: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g Glycin, 10,0 g SDS </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Knife </td><td> Invitrogen </td><td> EI9010 </td><td></td></tr><tr><td> SimplyBlue Sichere Stain </td><td> Invitrogen </td><td> LC6065 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

gießen und ausführen eines protein-gel durch die wiederverwendung von gewerbe-kassetten

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

Die Auswertung der Proteine ​​mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE-Analyse) ist eine gängige Technik der Biochemie und Molekularbiologie Forscher 1-4 verwendet. Für Laboratorien, die täglich Analyse von Proteinen führen, können die Kosten für im Handel erhältliche Polyacrylamidgelen (~ $ 10/gel) beträchtlich sein im Laufe der Zeit. Um diese Kosten zu mindern, bereiten einige Forscher ihre eigenen Polyacrylamidgelen. Traditionelle Methoden der Ausgießen dieser Gele verwenden üblicherweise spezialisierte Ausrüstung und Glas-Gel-Platten, die teuer und schließt Gießen viele Gele und speichert sie für eine zukünftige Verwendung kann. Darüber hinaus kann der Handhabung von Glasplatten bei der Reinigung oder Gel in Gießen versehentlichem Bruch schafft ein Sicherheitsrisiko darstellen, was ihren Einsatz in Labor Undergraduate-Klassen ausschließen kann zur Folge haben. Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele gleichzeitig gießen Recycling von Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten, und preiswert maMaterialien gekauft zu einem Baumarkt. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen. Darüber hinaus sind Kunststoff Gelkassetten extrem bruchfest, was sie ideal für Bachelor-Labor Klassenzimmer macht.

Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele zu einer Zeit, gießen durch Recycling Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten und kostengünstige Materialien zu einem Baumarkt gekauft. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen.

Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten

Die Untersuchung von Proteinen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ist eine gängige Technik in der Biochemie ...

Mein Name ist David Oppenheimer und ich arbeite an der Abteilung für Biologie der University of Florida. Der Kauf vorgegossener Polyacrylamidgelen für die routinemäßige Proteinelektrophorese ist praktisch, da man jederzeit gebrauchsfertige Gele zur Verfügung haben kann. Allerdings können kommerzielle Gele kostspielig sein, wenn Ihr Labor viele Gele durchführt.Außerdem werden kommerzielle Gele üblicherweise in Kunststoffkassetten gegossen, die nach Gebrauch entsorgt werden sollen, wodurch Kunststoffabfall entsteht, der meist auf einer Deponie landet. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kunststoffkassetten wiederverwenden können, um Ihre eigenen Polyacrylamid-Gele herzustellen, die wochenlang gelagert werden können, und so Ihrem Labor eine kostengünstige Quelle für fertige Gele für die routinemäßige Proteinelektrophorese bereitzustellen. Gut, beginnen wir.Bereiten Sie eine saubere neue Seite mit Vitrogen und Novak-Mini-Gel-Kassetten vor. Entnehmen Sie etwa einen Teelöffel Epoxidharz und mischen Sie die Lösung vollständig mit einer Pipettenspitze. Sobald Sie das Mischen des Epoxidharzes abgeschlossen haben, tragen Sie es auf die Rückseite der vorderen Kassette auf, an der sich Vorde

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen unter Verwendung von Poly-acrylimid Gelelektrophorese (PAGE).

Elektrophoretische Trennung von Proteinen

In diesem Video, beschreiben wir die Charakterisierung von Multiproteinkomplexen (MPL) durch blaue nativen Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-PAGE). In einer ersten Dimension sind dialysiert Zelllysaten durch BN-PAGE getrennt an die einzelnen MPL zu identifizieren. In einer zweiten Dimension SDS-PAGE, werden MPC von Interesse weiter unterteilt, um ihre Wähler durch Immunoblot analysieren.

Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) zur Analyse von Multiproteinkomplexen aus Zelllysaten

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

V3-Workflow ist ein Western-Blot-Verfahren mit fleckenfreien Gelen. Die fleckenfreie Technologie ermöglicht es Forschern, die Proteintrennungsqualität zu visualisieren, die Übertragungseffizienz zu überprüfen und vor allem die Veränderung des von Interesse interessierten Proteins mithilfe der gesamten Proteinquantifizierung als zuverlässige Belastungskontrolle zu validieren.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

Verfahren zur Stabilisierung und Trenn nativen Proteinkomplexe aus unmodifizierten Gewebelysat gekoppelt, um ein Amin-reaktives Protein Vernetzers unter Verwendung von auf eine neuartige zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) -System dargestellt.

Multimer-PAGE: Ein Verfahren zum Erfassen und Auflösen von Proteinkomplexen in biologischen Proben

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