Name: Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung mikroregionaler Hypoxie in der Maus-Großhirnrinde mittels Zwei-Photonen-Imaging der endogenen NADH-Fluoreszenz. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Analysen der Sauerstoffversorgung mit geringerer Invasivität.

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Wir danken Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) für den Kopf-Bauweise. Die Arbeit wurde von NIH Auszeichnungen wurden auf SD (R01DA026325 und P30AI078498 und Stiftung Stipendien an KK (Dana Foundation Brain and Immunoimaging Programm, American Heart Association 0635595T und der ALS Association [# 1112)]) unterstützt.

1. Vorbereitung der Tiere für die Bildgebung Hinweis: Wir verwenden erwachsene C57BL Mäusen. Verschiedene transgene Stämme können je nach Fragestellung werden. Mikrovaskuläre Praxen und Pulsoximetrie sind bei Mäusen mit weißem Pelz (zB FVB-Stamm) erleichtert. <ol><li> Bereiten Sie das Operationsgebiet an der Werkbank. Alle chirurgischen Instrumente müssen autoklaviert oder mit 70% Ethanol desinfiziert werden. </li><li> Legen Sie eine rektale Sonde, und messen kontinuierlich den Körper des Tieres Temperatur während des gesamten Verfahrens </li><li> Betäuben die Maus mit anfänglich 5% Isofluran. In 15 bis 30 s, wenn das Tier bewegt sich nicht, legen Sie es auf einem Heizkissen (37 ° C), und tragen Sie eine Gesichtsmaske für die kontinuierliche Lieferung von Luft mit 1,3 bis 1,5% Isofluran). Stellen Sie sicher, dass das Tier reagiert nicht auf einen Schmerzreiz (zB Schwanz Prise). </li><li> Verwenden Sie künstliche Tränenflüssigkeit Gel auf die Maus in die Augen bedecken, um die Exposition gegenüber trockener Luft zu verhindern. </li><li> Mit einem elektrischen Rasierer, Haare zu entfernen fROM den Kopf und aus beiden Oberschenkeln. Bewerben Haarentferner (zB Nair) zum Oberschenkel für 2 min, und wischen Sie es sorgfältig, um die restlichen Haare zu entfernen. Dieser Schenkel wird für Oximetrie verwendet werden. </li><li> Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10% Povidon-Jod-Lösung und 70% Ethanol. </li></ol> 2. Vorbereiten des offenen Schädel Schädel-Fenster <ol><li> Ab 5 mm kaudal der Schädelbasis, einen Einschnitt in der Kopfhaut mit einer Schere und einem Zentimeter vorrücken. Bewegen Haut an den Seiten, um den Schädel freizulegen. </li><li> Um die Membranen auf der Oberseite des Schädels entfernen gelten 10% Eisenchloridlösung an die Spitze des Schädels. Wischen Sie die überschüssige Lösung, und kratzen die Membranen weg mit 45 °-Winkel Nr. 5 Pinzette. Es ist wichtig, um die Site sorgfältig vorzubereiten, um sicherzustellen, daß die Kopfplatte sicher an dem Schädel befestigt werden (Schritte # 4-6). </li><li> Mit einem Dissektionsmikroskop, identifizieren den Bereich von Interesse. Beachten Sie, dass die Schädelnähte vermieden werden, da der Schädel cein unvorhersehbar brechen in dieser Richtung. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht des schnellen Kleber (zB Loctite 454) an den Rändern des Fensters von der Kopfplatte (Abbildung 1). Positionieren der Kopfplatte in einer solchen Weise, dass der Bereich von Interesse in dem Fenster freigelegt. Wenden Sie leichten Druck auf der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff schnell polymerisieren. Halten Sie für 10 Sekunden, während der Leim Polymerisation. </li><li> Eine kleine Menge des schnellen Leim auf den Rändern des Fensters, um die Kopfplatte und den Schädel zu versiegeln. Schrauben Sie die Kopfplatte an das Tier Halterung unter dem Sezieren Umfang. </li><li> Mit dem Bohrer MicroTorque II bei 6000 Umdrehungen pro Minute und einer IRF 005 Bohrer gesetzt, entfernen Sie alle zusätzlichen Klebstoff aus dem Schädel und aus der Kopfplatte. Ein verbleibender Klebstoff auf der Kopfplatte sollte entfernt werden, da es sonst mit der Befestigung der Glasabdeckung stören. </li><li> Setzen Sie den Bohrer bei 1000 rpm, und starten Sie den Schädel bohren, indem Sie einen Kreis innerhalb der Kopfplatte Fenster, Durchmesser ca. 5 mm. Verwenden Sie leichte kreisenden Bewegungen, als ob Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen sind. Stop Bohren alle 20-30 Sekunden, um Knochen Staub mit Druckluft zu entfernen. Hinweis: Die Form der Öffnung in der Kopfplatte können zusätzliche Zugang für den Bohrer (für links und rechtshändige Chirurg), die es leichter, einen kreisförmigen Schädelfenster erstellen lassen. Darüber hinaus bieten die beiden seltsam geformten Löcher den erforderlichen Raum, um eine Clark-Elektrode oder Glas-Elektrode in das Hirngewebe einfügen unter dem kranialen Fenster für zusätzliche polarographische oder elektrophysiologische Messungen. </li><li> Da das Bohren fortschreitet, wird ein Bau rund um den intakten Schädel in der Mitte gebildet. Achten Sie darauf, durch den ausgedünnten Schädel stecken, aber um diese Höhle von gleichmäßiger Dicke zu machen. Seien Sie besonders vorsichtig um große Blutgefäße, sie sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt. </li><li> Verwenden Sie ein "Bein" der Pinzette # 3 zu heben ("Flick Off") die Knochen in der Mitte des Fensters. Einen Tropfen Künial zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) auf der Scheibe. </li><li> Wischen Sie sanft mit einem aCSF Ecke von weichem Tissue-Papier (z. B. Kimwipe). Gewöhnlich wird die Dura nach einem oder mehreren Orten um den Rand des Fensters beschädigt. Ab einer dieser Seiten, heben Sie vorsichtig und entfernen Sie dann die Dura von der Hirnoberfläche, mit 45 °-Winkel Pinzette # 5. Bei der Wahl der Stelle, an der zu beginnen Entfernen der Dura, vermeiden die Bereiche neben großen Blutgefäßen. Kommt es zu Blutungen, einen Tropfen aCSF und warten Sie 2-3 min für kleinere Blutungen zu stoppen. </li><li> Bereiten 0,07% niedrig schmelzende Agarose in aCSF gelöst) Bringen Sie die geschmolzene Agarose auf Körpertemperatur. Wischen über die aCSF von der Oberfläche des Gehirns. Gießen Sie die Agarose in dem Fenster, und decken mit einem Glasträger. Drücken Sie das Glas vorsichtig, um einen Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte machen, und warten Sie 10-20 Sekunden, bis die Agarose ist solide. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige Agarose aus der Glasabdeckung mit einer Pinzette und weichem Tissue-Papier. </li><li> Geben Sie eine kleineHöhe der schnellen Leim um das Glas zu kleben das Glas an der Kopfplatte. Eine kleine Menge von Zahnzement, um den Klebstoff (1) verfestigen. </li></ol> 3. Die intravenöse Injektion und Blutoxygenierung Überwachung Hinweis: routinemäßig verwendet, die Oberschenkelvene zur intravenösen Applikation von Texas-Rot als die Schwanzvene injiziert. Dies liegt daran, Vena femoralis Injektionen sichere und reproduzierbare Bolusinjektionen des Farbstoffs. <ol><li> Drehen Sie das Tier teilweise über die Innenseite des linken Oberschenkels aussetzen. Klebeband, um die Tiere in dieser Position zu sichern. </li><li> Bewerben antiseptischen Gestrüpp, und dann 100% Ethanol auf die Haut. </li><li> Einen Einschnitt entlang der medialen Oberschenkel vom Knie bis zur Symphyse. Separate Weichteile durch stumpfe Präparation mit einer Pinzette # 5. </li><li> Füllen Sie 1 ml-Spritze mit 130 ul von Texas Red (2,5 mg / ml). Befestigen Sie eine neue Nadel (Gauge 30), und biegen Sie ihn sorgfältig bei 30 ° und hält die Fase auf. Füllen Sie die Nadel with Texas Red-Lösung. </li><li> Unter einem Dissektionsmikroskop, führen Sie die Nadel in die V. femoralis und injizieren 100 ul Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht die Vene mit Gaze, um eine Blutung zu stoppen. </li><li> Schließen Sie die Haut mit 4-0 Naht. </li><li> Zur kontinuierlichen Überwachung von Blut SpO 2 (auf angemessene Blutoxygenierung gewährleisten) setzen Sie den Oximetermeßfühler auf dem rechten Oberschenkel (aus denen Haare hatte es schon zuvor). </li></ol> 4. Zwei-Photonen-Imaging Hinweis: Wir verwenden eine Olympus Fluoview1000 Multiphotonen Imaging-System (stehend) mit einem Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Femtosekunden-Ti: Sa-Lasers als Anregungsquelle. Für die Bildgebung, nutzen wir × 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat) oder × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) Wasser-Immersions-Objektive. Wir nehmen Bilder auf 12-Bit-Farbtiefe bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel mit einem Pixel-Verweilzeit von 2 us. Die NADH-und Texas-Red-Dextran werden gleichzeitig bei 740 nm angeregt, und Fluorescence wird vom Anregungslicht getrennt mit einem dichroitischen Spiegel / Nah-IR-Sperrfilter Kombination (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, USA) gliedert sich in zwei Kanäle mit einem dichroitischen Spiegel (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, USA), und bandpassgefiltert (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laserleistung nach dem Objektiv 10-20 mW gemessen wurde, war für die Bildgebung in Schicht I und 20-50 mW für die Bildgebung in Schicht II. <ol><li> Übertragen Sie die chirurgisch präparierten Maus auf dem Mikroskoptisch. Nehmen Sie ein erstes Bild der Schädelbasis Fenster Website mit Hellfeldbeleuchtung mit 4x-Vergrößerung um sie als Referenz für die Registrierung Karte mit höherer Vergrößerung Zwei-Photonen-Angiographien zu verwenden. </li><li> Zoomen Sie in dem interessierenden Gebiet mit x 10 Vergrößerung. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in kortikalen Schichten I oder II (bis zu 150 um unterhalb der Pia-Oberfläche). Wenn höhere Vergrößerung gewünscht wird, verwenden × 25 Ziel </li><li> Start Aufzeichnung der Zeitreihen (FiguZu 2). Wir empfehlen, durchschnittlich 3-5 Frames, um die Qualität des Bildes zu erhöhen. </li><li> Induzieren Hypoxämie durch Zugabe von 50% N2 in die Luft, dass das Tier atmet. Dadurch wird der O2-Gehalt bis 10% zu bringen. Stellen Sie sicher, Hypoxämie durch Überwachung Oximeter Daten. </li><li> Fortfahren, um die Zeitreihe durch Hypoxämie (z. B. 30 Sekunden) aufzunehmen, und nach den üblichen O2 wird wiederhergestellt. </li><li> Sammeln von Daten für die Berechnung der Sauerstoff-Verteilung durch Erfassen, Messen und Quantifizieren der Bereich der Hypoxie und oxygenierten Gewebe Rollen, um die Blutgefäße. </li></ol> 5. Datenverarbeitung <ol><li> Bestimmen der Krogh Gewebezylinder Radius R Dies kann manuell erfolgen (3) durch Messung des Abstandes zwischen Mitte des Blutgefäßes und der Grenze, bei der hohen NADH Fluoreszenz nachgewiesen wird. </li><li> Alternativ können Sie auch den Rechenaufwand Ermittler-unabhängige semi-automatische Bestimmung des Gewebes Zylinder Radius R und die zentrale blood r Gefäß, das beschrieben wurde bisher 1 in ergänzender Form zusammengefasst und in der Diskussion Abschnitt dieses Protokoll. </li><li> Die Fläche von Hypoxie mit Open-Access-Bildanalyse-Software, zB ImageJ. Um dies zu tun, verwenden NADH-Signal, definieren Sie eine Schwelle, die die hohe Intensität NADH Bereich abgrenzt, und messen Sie dann den Bereich mit erhöhten NADH Fluoreszenz Gewebe. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt ein Video von NADH / Angiographie Bilder bei transienten Hypoxämie (für die PDF-Version dieser Abbildung, ausgewählten Standbilder verwendet wurden). Die eingeatmeten Sauerstoffkonzentration von 21% bis 10% für einen Zeitraum von 3 min abgesenkt. Dieses Niveau der experimentell induzierten Hypoxämie ausreichend ist, um schwere Hypoxie in der Hirnrinde zu induzieren. Hypoxie führte zu einem Anstieg der NADH-Fluoreszenz, zunächst in den Bereichen, die am weitesten von der arteriellen Durchblutung waren. Beachten Sie die scharfen NADH GewebeGrenzen, die Grenzen des beobachtbaren Gewebe Sauerstoffdiffusion vertreten von der kortikalen Mikrozirkulation. Das Bild in Abbildung 3 zeigt die Geometrie der Sauerstoffdiffusion Grenzen umliegenden Hirngefäße. Es ist möglich, Krogh Walzendurchmesser dieser Grenzen abzuleiten, wie zuvor beschrieben ein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. (A)-Maus mit Schädel-Fenster für die Bildgebung vorbereitet. (B) Abmessungen der Kopfplatte. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Endogenen NADH grüne Fluoreszenz sichtbar gemacht mit Zwei-Photonen-Imaging durch kraniale Fenster, ca. 50 um unterhalb der Pia-Oberfläche. Die Blutgefäße werden visualisiert mit Texas Red Dextran. Sauerstoff in der Atemluft wurde auf 10% für 3 min reduziert und dann für 21% wiederhergestellt. Maßstab: 50 um. &lt;img alt = "Bild 3" src = "/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg" /&gt; Abbildung 3. Geometrie der NADH Fluoreszenz Grenzen. Gelb zeigt Umriss Grenze von funktionellen Hypoxie; blaue Kreise zeigen projiziert Sauerstoff (Krogh) Zylindern. Blaue Linien zeigen Zylinderradien; Zahlen zeigen Radien in Mikrometern.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Eine hohe räumliche Auflösung Informationen über Sauerstoffdiffusion ist wichtig zu verstehen, wie Blutfluss im Gehirn reguliert wird, um Sauerstoff zu Gehirnzellen zu gewährleisten und metabolischen Bedarf zu decken. Traditionelle polarographischen Sauerstoff-Messungen mit Clark-Stil Glaselektroden sind sehr invasiv und haben eine geringe räumliche Auflösung und 3.2 signifikant (zweite Reihe) Reaktionszeit. Bisher ist die einzige nicht-invasive Methode zur Messung von pO 2 im Hirngewebe ist Phosphoreszenz Abschrecken, wo die Rate der Zerfall des angeregten Sonde ist proportional zur Sauerstoffkonzentration 4. Diese Methode liefert genaue Sauerstoffkonzentrationen, erfordert aber eine proprietäre Farbstoff und ein technisch ausgereiftes Phosphoreszenz Lifetime-Imaging-System. Hier zeigen wir ein übersichtlicher und einfacher Ansatz, der auf einem Standard-Zwei-Photonen-Imaging-System mit zwei flurescence Kanäle geleitet werden kann. Unser Ansatz nutzt eine intrinsische Gewebe ein Signal 5ND benötigt nur kontrastierende Darstellung der kortikalen Mikrozirkulation. Aufgrund der nicht-linearen, im wesentlichen binären Zunahme der Fluoreszenz bei NADH funktional Sauerstoffgrenzkonzentrationen 1, erhöhte intrinsische NADH Fluoreszenz nur in Bereichen mit hohem, metabolisch begrenzen Hypoxie beobachtet. Eine wichtige Folgerung ist, dass Gewebe Grenzen der Sauerstoffdiffusion aus kortikalen Mikrogefäße direkt von zylindrisch geformten Intensität Veränderungen der endogenen NADH Fluoreszenz zu beobachten. Wir bezeichnen diese Strukturen als Krogh Zylinder, weil der Begriff der zylindrisch geformte Strukturen, die das Volumen des oxygenierten umgebende Gewebe ein Blutgefäß durch definieren August Krogh eingeführt wurde, und wurde kürzlich experimentell beobachteten mit Zwei-Photonen-Imaging-NADH ein. Krogh Zylindern Bilder können in 3D, indem sie eine Z-Stapel von Bildrahmen gesammelt werden. Sie sind besonders deutlich in der Nähe des durchdringenden Arteriolen und sie sind nämlich kongruenth Kapillare erschöpft periarteriolären Gewebszylinder 1,4. Um eine objektive Bestimmung des Krogh Gewebe Zylinder Radius R (siehe Abschnitt 5.2) messen wir ihre radiale Pixelintensitätswerte innerhalb eines klar definierten Segment zwischen der Mitte des Zylinders und der äußeren Grenze mit dem Matlab-Funktion &quot;improfile&quot; bieten. Der äußere Rand des Segments sollte so gewählt werden mit einem Sicherheitsabstand über die sichtbare Grenze verlängert werden kann. Um das Signal-Rausch-Ebene zu verbessern averageed wir über alle radialen Linien benötigt, um den sichtbaren Zylinder Segment bei 1 °-Schritten zu decken. Die daraus resultierende mittlere radiale Intensitätsprofil innerhalb des Segments wiesen einen starken Anstieg, der auf den sichtbaren Gewebe-Grenze R entsprach. Die passten wir noch eine sigmoide Funktion (zB Boltzmann-Funktion) mit dem gemittelten radialen Intensitätsverlauf und nutzte seine Wendepunkt (auch als x 0 genannt) als eine Definition von R. Die entsprechenden zwei-pHoton Mikroangiographie (Texas-Rot) zeigte den Querschnitt eines einsamen zentrale Blutgefäß in der Mitte des Zylinders. Der Durchmesser des zentralen Blutgefäß direkt angewendet werden, um r zu bestimmen. Zwei-Photonen-Imaging-NADH bietet die gleiche räumliche Auflösung als die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung der kortikalen Mikroangiographie. Ein wichtiges Merkmal für die quantitative Anwendung dieses Verfahrens ist, daß p 50 des NADH Fluoreszenzanstieg wurde gemessen, um von 3,4 sein ± 0,6 mm Hg 1 und dass die NADH-Fluoreszenzintensität als eine Funktion der mikroregionale Gewebe pO 2 kann mathematisch beschrieben werden eine sigmoidale Funktion. . Wir zeigen, dass diese Technik, um Brain Bereichen, die besonders anfällig für Hypoxie (durch Verringern Sauerstoffgehalt in der Luft um 10%) zu identifizieren. Wir zeigen auch, dass Sauerstoffdiffusion eine einfache geometrische perivaskuläre Muster folgt. Ein critschen Schritt dieses Verfahrens ist die Qualität des Schädelfenster Herstellung. Die Operation sollte nur geringe Schäden, um nicht den Blutfluss in den exponierten Bereich stören. Eine Sorge ist, dass in einer chirurgisch kompromittiert Vorbereitung, die Rinde unter dem Fenster kann hypoxischen zunächst unter Ausschluss irgendwelcher aussagekräftige Experimente. Ein gut vorbereiteter kranialen Fenster sollte intakt Dur-und Moll Blutgefäße mit lebendigen Blutfluss in allen Schiffstypen und ohne signifikante Blutungen entlang der Kanten auf. Unter normoxischen Bedingungen (PaO2 80-100 mmHg, Sp. 97-99% O2) das Hirnparenchym sollten einheitliche, homogene NADH Fluoreszenz ohne auffällige, helle Gewebe Patches mit erhöhten NADH Fluoreszenz zeigen. Eine grundlegende physikalische Beschränkung unseres Ansatzes ist Eindringtiefe begrenzt. Die blau-grüne NADH Fluoreszenz im Gehirn ist schnell gedämpft durch Hämoglobin-Absorption und Streuung Gewebe bei diesen Wellenlängen. Selbst mit hoher numerischer Apertur (z. B. 1,05) WasserImmersionsobjektive Zwei-Photonen-Imaging-NADH ist derzeit auf kortikalen Schichten I und II beschränkt. Diese Einschränkung ist wissenschaftlich relevant, weil Energiestoffwechsel in oder in der Nähe der weißen Substanz wird wahrscheinlich von grauen Substanz unterscheiden. Jedoch würde die Untersuchung der tiefen kortikalen Strukturen wie Schichten IV-VI oder subkortikalen Strukturen wie weißen Substanz oder im Striatum erfordern die Verwendung von spezialisierten Mikrolinsen wie bei der Maus in vivo Cortex 6 beschrieben. NADH-basierte Messung der Sauerstoffdiffusion Grenzen kann besonders nützlich sein, wenn sie mit anderen Messungen, wie Analysen der funktionellen Hyperämie, und den Nachweis von Kapillare Fluxraten 7 zusammengefasst. Zum Beispiel kann diese Technik geeignet ist, Hypoxie Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD)-Modelle zu visualisieren. Die einfache Geometrie der Sauerstoffdiffusion ermöglicht es, die Sauerstoff-Gradienten in mikrovaskulären Betten unter Umständen, wo Kapillardichte ist de vorherzusagenerhöhte 8 (z. B. AD 9) und zu prüfen, ob Hirngewebe Regionen mit reduzierter Kapillardichte ein erhöhtes Risiko für Schäden, die durch Hypoxie Mikrohüben sind. Die Fähigkeit, Bild microregionally ermöglicht es auch, die Geometrie und Größe des Gewebes Mikrohüben prüfen und zu bestimmen das Volumen des Gewebes, in dem Hypoxie auftritt, sowie die Beziehung zwischen Gewebehypoxie und nachfolgenden neuronalen Tod oder Umbau Kapillare 10. Schließlich, da Erhöhungen der endogenen NADH Fluoreszenz die direkte Folge der akuten mitochondriale Dysfunktion sind, erstellt diese Methode die Möglichkeit, NADH-Bildgebung als eine spezifische Reporter für neuronale Energiestoffwechsel 11 und einen Proxy für mitochondriale Dysfunktion zu verwenden. Zusammenfassend ist Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz eine einfache, anspruchslose Tool, mit dem Sauerstoffversorgung und-verbrauch im Gehirn sowohl unter normalen verstehen kannund in pathologischen Zuständen.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Heizkissen </td><td> Jenseits von Bodi Hitze </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Augensalbe (Künstliche Tränen) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidon-Iod-Lösung 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Eisenchlorid 10% ige Lösung </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zement </td><td> Stoelting Unternehmen </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cyanacrylat 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> MicroTorque II Handstück Kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 Bohrer </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzetten # 5/45 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 Deckglas </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fotovervielfacherröhre </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Saphir-Laser-Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von mikroregionale hypoxie in maus-großhirnrinde zwei-photonen-imaging von endogenen nadh fluoreszenz

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Die Fähigkeit des Gehirns, um auf einem hohen Niveau der metabolischen Funktion abhängig von der Nachfrage kontinuierliche Sauerstoffversorgung durch den Blutfluss und Gewebe Sauerstoffdiffusion. Hier präsentieren wir eine visualisierte experimentellen und methodischen Protokoll direkt sichtbar mikroregionale Gewebehypoxie und perivaskuläre Sauerstoff Gradienten in der Maus Cortex abzuleiten. Es ist auf dem nicht-lineare Beziehung zwischen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) endogenen Fluoreszenzintensität und Sauerstoff-Partialdruck in dem Gewebe, wo das Gewebe NADH-Fluoreszenz abrupt am Gewebe Sauerstoff unter 10 mmHg 1 beobachtet bezogen. Wir verwenden zwei-Photonen-Anregung bei 740 nm, die für die gleichzeitige Anregung der intrinsischen Fluoreszenz NADH Gewebe und Blutplasma mit Texas-Red Dextran gegenübergestellt werden können. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Ansätzen gehören die folgenden: es nutzt eine intrinsische Gewebe Signal und kann mit Standard-Zwei-Photonen in vivo im werdenAltern wird gebraucht und es erlaubt eine kontinuierliche Überwachung im gesamten Sichtfeld mit einer Tiefenauflösung von ~ 50 um. Wir zeigen, dass Hirngewebe Bereichen am weitesten von zerebralen Blutgefäße gefährdete Gebiete, die Wasserscheide der Erste, der sich funktionell hypoxischen nach einem Rückgang in der vaskulären Sauerstoffversorgung sind entsprechen. Diese Methode erlaubt es, Bild mikroregionale kortikaler Oxygenierung und ist daher nützlich für die Überprüfung der Rolle der Unangemessenheit oder des eingeschränkten Sauerstoffversorgung im Gewebe neurovaskulären Erkrankungen und Schlaganfall.

Hier beschreiben wir eine Methode, um direkt zu visualisieren mikroregionale Gewebehypoxie in der Maus Kortex<em&gt; In-vivo-</em&gt;. Es wird auf gleichzeitigen Zwei-Photonen-Bildgebung von Nicotinamidadenindinucleotid (NADH) und der kortikalen Mikrozirkulation bezogen. Diese Methode eignet sich für hochauflösende Analyse von Gewebe-Sauerstoffversorgung.

Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

Die Fähigkeit des Gehirns, bei einem hohen metabolischen Bedarf funktionell leistungsfähig zu bleiben, hängt von einer kontinuierlichen Sauerstoffversorgung durch den Blutfluss und die Sauerstoffdiffusion im Gewebe ab. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mikroregionale Gewebehypoxie im Maus-Kortex in vivo direkt zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein offenes Schädel-Fenster an einer anästhesierten Maus präpariert wird. Anschließend wird ein fluoreszierender Farbstoff intravenös injiziert, um die zerebralen Blutgefäße zu markieren.Schließlich erfolgt gleichzeitig die Photonenaufnahme der intrinsischen NADH-Fluoreszenz und der fluoreszenzmarkierten kortikalen Mikrozirkulation. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die funktionelle Hypoxie in mikroskopisch kleinen Bereichen des Hirnparenchyms durch die Visualisierung der reduzierten Form von Nicotinamidadenindinukleotid zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Clark-Elektroden besteht darin, dass sie eine hohe räumliche Auflösung über ein großes Sichtfeld bietet und zudem weniger invasiv ist.Dieses Verfahren kann an einem standardmäßigen zweikanaligen Fluoreszenz-Imaging-System mit zwei fluoreszierenden Kanälen durchgeführt werden. Hallo, ich bin Steve Hurst, Professor und Leiter der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie an der University of Rochester. Die heutige Demonstration wird von Anitas Sohn aus dem Kishka-Labor sowie von Oxana Paulka, einer wissenschaftlichen Assistentin aus meinem Labor, durchgeführt. Dr. Kishka, der die NADH-Bildgebungstechnik maßgeblich entwickelt hat, kann heute leider nicht anwesend sein, da er kürzlich nach Deutschland gezogen ist. Nachdem der Operationsbereich mit den notwendigen Instrumenten vorbereitet wurde, die entweder im Autoklaven sterilisiert oder mit 70 %igem Ethanol desinfiziert wurden, und die Maus mit 5 % Isofluran narkotisiert wurde, platzieren Sie das Tier auf einer Heizplatte und legen eine Gesichtsmaske an, um 1,3 bis 1,5 % Isofluran in Luft zuzuführen.Überprüfen Sie den Anästhesiegrad durch eine Schwanzquetschung. Führen Sie anschließend eine rektale Sonde ein und messen Sie kontinuierlich die Körpertemperatur des Tieres während des gesamten Verfahrens. Tragen Sie künstliches Tränen-Gel auf die Augen der Maus auf, um Austrocknung zu verhindern.Entfernen Sie dann die Haare vom Kopf und tragen Sie an beiden Oberschenkeln zwei Minuten lang Enthaarungsmittel auf, um die restlichen Haare zu entfernen; der Oberschenkel wird für die Oximetrie verwendet. Desinfizieren Sie abschließend die Kopfhaut mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung und 70%igem Ethanol. Um ein Schädel Fenster anzulegen, beginnen Sie fünf Millimeter vom Schädel entfernt und schneiden Sie mit der Schere.Führen Sie einen Schnitt in die Kopfhaut ein und führen Sie ihn um einen Zentimeter fort. Bewegen Sie die Haut zur Seite, um den Schädel freizulegen, um die Membranen auf der Oberseite des Schädels zu entfernen. Tragen Sie eine 10%ige Eisen(III)-chlorid-Lösung auf.Wischen Sie die überschüssige Lösung ab und kratzen Sie die Membranen in einem Winkel von 45 Grad ab. Nummer fünf, Pinzette: Identifizieren Sie mithilfe eines Stereomikroskops den Bereich von Interesse. Tragen Sie eine dünne Schicht Schnellkleber um die Ränder des Fensters der Kopfplatte auf.Platzieren Sie die Kopfplatte so, dass der interessierende Bereich im Fenster freiliegt, und üben Sie leichten Druck auf die Kopfplatte aus. Geben Sie eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Klebstoff schnell zu polymerisieren. Halten Sie den Druck während der Polymerisation des Klebstoffs 10 Sekunden lang aufrecht.Tragen Sie eine kleine Menge Schnellkleber auf die Ränder des Fensters auf, um die Kopfplatte mit dem Schädel zu verbinden. Schrauben Sie anschließend die Kopfplatte unter dem Präparationsmikroskop am Tierhalter fest. Verwenden Sie dazu das Mikrodrehmoment-Bohrgerät, eingestellt auf 6.000 U/min, und den Bohrer IRF 0 0 5.Entfernen Sie jeglichen überschüssigen Kleber vom Schädel und von der Kopfplatte. Stellen Sie dann den Bohrer auf tausend Umdrehungen pro Minute ein und beginnen Sie, den Schädel zu bohren, indem Sie einen Kreis innerhalb des Fensters der Kopfplatte mit einem Durchmesser von etwa fünf Millimetern erzeugen. Verwenden Sie dabei leichte, fegende Bewegungen, als würden Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen.Unterbrechen Sie das Bohren alle 20 bis 30 Sekunden und verwenden Sie Druckluft, um Knochendust zu entfernen. Während des Bohrvorgangs bildet sich ein Graben um den intakten Schädel in der Mitte herum. Achten Sie darauf, nicht durch den dünnen Schädel zu stechen, sondern sicherzustellen, dass dieser Graben eine gleichmäßige Dicke aufweist.Seien Sie außerdem besonders vorsichtig in der Nähe großer Blutgefäße. Diese sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt werden. Heben Sie mit einer Spitze einer Pinzette den Knochen in der Mitte des Fensters an und geben Sie einen Tropfen künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit auf das Fenster. Wischen Sie vorsichtig mit der Ecke eines Kim-Tuchs die künstliche zerebrospinale Flüssigkeit in einem Winkel von 45 Grad ab.Punkt fünf, Pinzette. Suchen Sie einen Bereich der beschädigten Dura entlang des Fensterrandes, heben Sie sie an und entfernen Sie sie. Falls Blutungen auftreten, geben Sie einen Tropfen künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) auf und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis geringfügige Blutungen zum Stillstand kommen.Bereiten Sie als Nächstes 10 Milliliter einer 0,07 %igen Low-Melting-Agarose-Lösung in künstlichem zerebrospinalen Fluid vor. Erwärmen Sie die geschmolzene Agarose auf Körpertemperatur. Entfernen Sie das überschüssige künstliche zerebrospinale Fluid von der Oberfläche des Gehirns.Geben Sie das Aeros in das Fenster und bedecken Sie es mit einem Deckglas. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Glas, um den Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte herzustellen, und warten Sie 10 bis 20 Sekunden, bis das Aeros fest wird. Entfernen Sie mithilfe von Pinzette und weichem Papiertuch überschüssiges Aeros vom Deckglas.Geben Sie eine kleine Menge Schnellkleber rund um das Glas, um es an der Kopfplatte zu befestigen. Tragen Sie anschließend eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Kleber zu verfestigen, bevor Sie in die Vena femoralis injizieren. Drehen Sie das Tier teilweise um, um die Innenseite des linken Oberschenkels freizulegen.Fixieren Sie das Tier mit Klebeband. Tragen Sie in dieser Position einen antiseptischen Abwasch und anschließend hundertprozentigen Ethanol auf die Haut auf. Danach führen Sie einen Schnitt entlang der medialen Oberschenkelregion vom Knie bis zur Schambeinfuge durch.Falls erforderlich, trennen Sie die Weichteile durch stumpfe Dissektion. Befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 130 Mikrolitern Texas Red. Setzen Sie eine neue 30-Gauge-Nadel auf und biegen Sie sie vorsichtig um 30 Grad, wobei die Schräge nach oben bleibt.Füllen Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop mit der Texas-Red-Lösung, führen Sie die Nadel in die Arteria femoralis ein und injizieren Sie hundert Mikroliter Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht mit einer Gazekompresse auf die Ader, um die Blutung zu stillen. Verschließen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht, um eine kontinuierliche Überwachung der Blutsauerstoffsättigung zu ermöglichen.Platzieren Sie die Oximeter-Sonde am rechten Oberschenkel, an dem zuvor die Haare entfernt wurden. Um mit der Bildgebung zu beginnen, bringen Sie die chirurgisch vorbereitete Maus auf den Mikroskopständer. Machen Sie ein erstes Bild der kranialen Fensterstelle mit Hellfeldbeleuchtung bei vierfacher Vergr&ouml;&szlig;erung, um es als Referenzkarte f&uuml;r die Registrierung mit h&ouml;herer Vergr&ouml;&szlig;erung zur Photonanierung zu verwenden.Vergrößern Sie den Bereich von Interesse mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Sie einen Bereich von Interesse in den kortikalen Schichten aus. Beginnen Sie mit der Aufnahme der Zeitreihe mit einem oder zwei. Wir empfehlen die Verwendung eines Durchschnitts von drei bis fünf Bildern, um die Bildqualität zu verbessern. Induzieren Sie anschließend eine Hypoxämie, indem Sie 50 % Stickstoff zu der Luft hinzufügen, die das Tier einatmet. Dadurch wird der Sauerstoffgehalt auf 10 % gesenkt. Überprüfen Sie die Hypoxämie durch die Überwachung der Oximeterdaten.Setzen Sie die Erfassung der Zeitreihe während der Hypoxämie für etwa 30 Sekunden und danach bis zur Wiederherstellung des normalen Sauerstoffniveaus fort. Sammeln Sie Daten zur Berechnung der Sauerstoffverteilung, indem Sie den Bereich der Hypoxie und der sauerstoffreichen Gewebezylinder um die Blutgefäße detektieren, messen und quantifizieren. Um den Radius R des sauerstoffreichen Gewebezylinders zu bestimmen, messen Sie den Abstand zwischen dem Mittelpunkt des Blutgefäßes und der Grenze, an der hohe NADH-Fluoreszenz detektiert wird.Beziehen Sie sich auf das schriftliche Protokoll für die Methoden der Datenverarbeitung. Diese Abbildung zeigt gleichzeitige NADH- und Geographiebilder aus einem Video, das während einer vorübergehenden Hypoxämie aufgezeichnet wurde, bei der die inspirierte Sauerstoffkonzentration für einen Zeitraum von drei Minuten von 21 % auf 10 % gesenkt wurde. Dieses Ausmaß einer experimentell induzierten Hypoxämie ist ausreichend, um eine schwere Hypoxie in der Großhirnrinde hervorzurufen.Die Hypoxie führte zu einer Zunahme der NADH-Fluoreszenz, die anfangs grün in den Bereichen am weitesten entfernt von der arteriellen Blutversorgung sichtbar war. Beachten Sie die scharfen NADH-Gewebegrenzen, die die beobachtbaren Gewebegrenzen der Sauerstoffdiffusion aus der kortikalen Mikrozirkulation darstellen, die rot dargestellt ist. Hier ist ein gleichzeitiges Bild der fluoreszenzmarkierten Mikrogefäße der Hirnrinde in rot und der intrinsischen NADH-Fluoreszenz aus der grauen Substanz der Hirnrinde in grün; die Intensitätsverteilung der NADH-Fluoreszenz ist binär.Es gibt Bereiche mit einheitlich niedriger NADH-Fluoreszenz und Bereiche mit einheitlich hoher NADH-Fluoreszenz. Die gelben Linien stellen die Gewebegrenzen zwischen den Bereichen mit niedriger und hoher NADH-Fluoreszenz dar. Diese Gewebegrenzen weisen eine räumliche Beziehung zu den benachbarten Mikrogefäßen auf.Diese Beziehung wird durch die Sauerstoffdiffusion von den Mikrogefäßen in das Gewebe bestimmt. In einigen Fällen kann die zylindrische Struktur oder der CRO-Gewebeszylinder dieser Gewebegrenzen direkt erkannt werden, wie durch die blauen Linien angezeigt. Hier weist die Gewebegrenze eine kreisförmige Form mit einem konzentrisch liegenden zentralen Blutgefäß auf, sobald dies beherrscht ist.Diese Technik kann in 1,5 Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Deckglas auf der Metallplatte zu befestigen, um vertikale Bewegungen der kortikalen Oberfläche aufgrund von Ödemen zu verhindern. Nach diesem Verfahren können zusätzliche Analysen durchgeführt werden, wie beispielsweise Messungen der funktionellen Hyperämie mit dem Ziel, weitere Fragestellungen zu klären, etwa den Zusammenhang zwischen Gewebehypoxie und zerebrovaskulärer Kopplung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mikroregionale Gewebehypoxie in der Mausenhirnrinde sichtbar machen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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