Erkennung von mikroregionale Hypoxie in Maus-Großhirnrinde Zwei-Photonen-Imaging von endogenen NADH Fluoreszenz

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mikroregionale Gewebehypoxie in der Hirnrinde der Maus in vivo direkt sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein offenes Schädelschädelfenster in einer anästhesierten Maus präpariert wird. Als nächstes wird ein Fluoreszenzfarbstoff intravenös injiziert, um die zerebralen Blutgefäße zu markieren.

Schließlich wird parallel zur Photonenbildgebung der intrinsischen NADH-Fluoreszenz und der fluoreszenzmarkierten kortikalen Mikrovaskulatur durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine funktionelle Hypoxie in Mikroregionen des Hirnparenchyms zeigen, indem das Vorhandensein der reduzierten Form von Nicotinamid, Adenindinukleotid, sichtbar gemacht wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie z.B. Clark-Elektroden besteht darin, dass sie eine hohe spezielle Auflösung über das große Sichtfeld bietet und auch weniger invasiv ist.

Diese Methode kann an einem standardmäßigen Zwei-Photoen-System mit zwei Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden. Hallo, ich bin Steve, Professor und Lehrstuhlinhaber für Mikrobiologie und Immunologie an der University of Rochester, der heute demonstriert, dass das Verfahren Anitas Sohn aus dem Kishka-Labor sein wird, sowie Oxana Paulka, eine wissenschaftliche Assistenzprofessorin aus meinem Labor, Dr. Kishka, der Pionierarbeit für die NADH-Bildgebungstechnik geleistet hat, heute nicht hier sein kann, weil er kürzlich nach Deutschland gezogen ist. Nachdem Sie das Operationsfeld mit den notwendigen Instrumenten vorbereitet haben, die autoklaviert oder mit 70 % Ethanol desinfiziert wurden, und die Maus mit 5 % Fluor betäubt wurde, legen Sie sie auf ein Heizkissen und tragen Sie eine Gesichtsmaske auf, um 1,3 bis 1,5 % Fluor an die Luft abzugeben.

Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie, indem Sie einen Schwanzkneifen durchführen. Führen Sie anschließend eine rektale Sonde ein und messen Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierlich die Körpertemperatur des Tieres. Tragen Sie künstliches Tränengel auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen zu verhindern.

Entfernen Sie dann die Haare vom Kopf und von beiden Oberschenkeln tragen Sie zwei Minuten lang Haarentferner auf den Oberschenkel auf, um die restlichen Haare zu entfernen, der Oberschenkel wird für die Oximetrie verwendet. Zum Schluss desinfizieren Sie die Kopfhaut mit einer 10%igen Povidon-Jodlösung und 70%igem Ethanol. Um ein Schädelfenster zu machen, das fünf Millimeter beginnt und mit einer Schere mit dem Schädel verhätschelt wird.

Machen Sie einen Schnitt in der Kopfhaut und gehen Sie einen Zentimeter nach vorne. Bewegen Sie die Haut zur Seite, um den Schädel freizulegen Um die Membranen auf dem Schädel zu entfernen. Tragen Sie 10%ige Eisenchloridlösung auf.

Wischen Sie die überschüssige Lösung ab und kratzen Sie die Membranen in einem 45-Grad-Winkel ab. Nummer fünf, Pinzette Identifizieren Sie mit einem Seziermikroskop den interessierenden Bereich. Tragen Sie eine dünne Schicht Schnellkleber um die Ränder des Fensters der Kopfplatte auf.

Positionieren Sie die Kopfplatte so, dass der interessierende Bereich im Fenster freiliegt, und üben Sie leichten Druck auf die Kopfplatte aus. Tragen Sie eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Kleber schnell zu polymerisieren. 10 Sekunden lang halten, während der Kleber polymerisiert.

Trage eine kleine Menge Schnellkleber auf die Fensterränder auf, um die Kopfplatte und den Schädel abzudichten. Schrauben Sie dann die Kopfplatte unter dem Präparierbereich an den Tierhalter. Mit dem Micro Torque Zwei-Bohrer-Set mit 6.000 U/min und dem IRF 0 0 5 Bohrer.

Entfernen Sie den überschüssigen Kleber vom Schädel und von der Kopfplatte. Stellen Sie dann den Bohrer auf tausend Umdrehungen pro Minute ein und beginnen Sie mit dem Bohren des Schädels, indem Sie einen Kreis mit einem Durchmesser von etwa fünf Millimetern in das Kopfplattenfenster machen. Verwenden Sie leichte, schwungvolle Bewegungen, als würden Sie mit einem sehr weichen Bleistift zeichnen.

Stoppen Sie das Bohren alle 20 bis 30 Sekunden und verwenden Sie Druckluft, um Knochenstaub zu entfernen. Im Laufe der Bohrung bildet sich um den intakten Schädel in der Mitte eine Höhle. Achte darauf, dass du nicht durch den dünnen Schädel stichst, sondern dass dieser Bau gleichmäßig dick ist.

Seien Sie außerdem besonders vorsichtig in der Nähe großer Blutgefäße. Sie sollten nicht beeinträchtigt werden und, wenn möglich, nicht einmal berührt werden Mit einer Pinzette den Knochen in der Mitte des Fensters abheben und einen Tropfen künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit auf das Fenster auftragen. Wischen Sie mit der Ecke eines Kim-Tuchs die künstliche Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit vorsichtig in einem 45-Grad-Winkel ab.

Nummer fünf, Pinzette. Suchen Sie einen Bereich mit beschädigter Dura entlang der Fensterkante und heben Sie ihn an, um ihn zu entfernen. Wenn Blutungen auftreten, tragen Sie einen Tropfen künstlichen Liquor auf und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis die leichten Blutungen aufhören.

Bereiten Sie als Nächstes 10 Milliliter 0,07 % niedrigschmelzendes Aero vor, das in künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit gelöst ist. Bringen Sie die geschmolzenen Aeros auf Körpertemperatur. Wischen Sie die überschüssige künstliche Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit von der Oberfläche des Gehirns ab.

Gießen Sie die Aeros in das Fenster und decken Sie es mit einem Glasschieber ab. Drücken Sie dann vorsichtig auf das Glas, um Kontakt zwischen dem Glas und der Kopfplatte herzustellen, und warten Sie 10 bis 20 Sekunden, bis die Aerodynamik fest ist. Entfernen Sie mit einer Pinzette und weichem Seidenpapier überschüssiges Aero von der Glasabdeckung.

Trage eine kleine Menge Schnellkleber um das Glas auf, um es auf die Kopfplatte zu kleben. Tragen Sie dann eine kleine Menge Zahnzement auf, um den Kleber zu verfestigen, der in die Oberschenkelvene injiziert werden soll. Drehen Sie das Tier teilweise um, um die Innenseite des linken Oberschenkels freizulegen.

Verwenden Sie Klebeband, um das Tier zu sichern. Tragen Sie in dieser Position ein antiseptisches Peeling und dann hundertprozentiges Ethanol auf die Haut auf. Machen Sie dann einen Schnitt entlang des medialen Oberschenkels vom Knie bis zur Schamsynthese.

Falls erforderlich, trennen Sie die Weichteile durch stumpfe Dissektion. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 130 Mikrolitern Texas Red. Bringen Sie eine neue 30-Gauge-Nadel an und biegen Sie sie vorsichtig in einem 30-Grad-Winkel, wobei Sie die Fase oben halten.

Füllen Sie die Nadel unter einem Präpariermikroskop mit Texas Red Solution, führen Sie die Nadel in die Oberschenkelvene ein und injizieren Sie hundert Mikroliter Texas Red. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie leicht mit Gaze auf die Vene, um die Blutung zu stoppen. Verschließen Sie die Haut mit vier oh Nähten zur kontinuierlichen Überwachung der Blutsauerstoffsättigung.

Platzieren Sie die Oximetersonde auf dem rechten Oberschenkel, von dem zuvor Haare entfernt wurden. Um mit der Bildgebung zu beginnen, bringen Sie die chirurgisch vorbereitete Maus auf den Mikroskoptisch. Machen Sie ein erstes Bild des Schädelfensters mit Hellfeldbeleuchtung bei vierfacher Vergrößerung, um es als Referenzkarte für die Registrierung bei höherer Vergrößerung auf Photonenanies zu verwenden.

Vergrößern Sie den interessierenden Bereich mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Sie einen Interessenbereich in den kortikalen Schichten aus. Ein oder zwei beginnen mit der Aufzeichnung der Zeitreihen.

Wir empfehlen, durchschnittlich drei bis fünf Bilder zu verwenden, um die Qualität des Bildes zu erhöhen. Als nächstes induzieren Sie eine Hypoxämie, indem Sie der Luft, die das Tier atmet, 50 % Stickstoff hinzufügen. Dadurch wird der Sauerstoffgehalt auf 10 % gebrachtÜberprüfen Sie die Hypoxämie, indem Sie die Oximeterdaten überwachen.

Nehmen Sie die Zeitreihe bis zur Hypoxämie etwa 30 Sekunden lang auf, nachdem der normale Sauerstoffgehalt wiederhergestellt ist. Sammeln Sie Daten zur Berechnung der Sauerstoffverteilung, indem Sie den Bereich von Hypoxie und sauerstoffhaltigen Gewebezylindern um die Blutgefäße erkennen, messen und quantifizieren. Um den Zylinderradius R des Krächzgewebes zu bestimmen, messen Sie den Abstand zwischen dem Zentrum des Blutgefäßes und der Grenze, an der eine hohe NADH-Fluoreszenz nachgewiesen wird.

Für die Methoden der Datenverarbeitung wird auf das schriftliche Protokoll verwiesen. Diese Abbildung zeigt gleichzeitige NADH- und Geographie-Bilder von Videos, die während einer vorübergehenden Hypoxämie aufgenommen wurden, wobei die eingeatmete Sauerstoffkonzentration für einen Zeitraum von drei Minuten von 21 % auf 10 % gesenkt wurde. Dieses Maß an experimentell induzierter Hypoxämie reicht aus, um eine schwere Hypoxie in der Großhirnrinde zu induzieren.

Die Hypoxie führte zu einem Anstieg der grün dargestellten NADH-Fluoreszenz zunächst in den Bereichen, die am weitesten von der arteriellen Blutversorgung entfernt waren. Beachten Sie, dass die scharfen NADH-Gewebegrenzen, die beobachtbare Gewebegrenzen der Sauerstoffdiffusion aus der kortikalen Mikrozirkulation darstellen, rot dargestellt sind. Hier ist ein gleichzeitiges Bild der fluoreszenzmarkierten Mikrogefäße der Rinde in rot, und die intrinsische NADH-Fluoreszenz aus der grauen Substanz der Rinde in grün, die NADH-Fluoreszenzintensitätsverteilung ist binär.

Es gibt Bereiche mit einheitlich niedriger NADH-Fluoreszenz und Bereiche mit einheitlich hoher NADH-Fluoreszenz. Die gelben Linien stellen die Gewebegrenzen zwischen den Bereichen mit niedriger und hoher NADH-Fluoreszenz dar. Diese Gewebegrenzen weisen eine räumliche Beziehung zu den benachbarten Mikrogefäßen auf.

Dieser Zusammenhang wird durch die Sauerstoffdiffusion aus den Mikrogefäßen in das Gewebe bestimmt. In einigen Fällen kann die zylindrische Natur oder der CRO-Gewebezylinder dieser Gewebegrenzen direkt erkannt werden, was durch die blauen Linien angezeigt wird. Hier ist die Gewebegrenze kreisförmig mit einem konzentrischen zentralen Blutgefäß, das einmal beherrscht ist.

Diese Technik kann in 1,5 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das Deckglas auf die Metallplatte zu kleben, um eine vertikale Bewegung der kortikalen Oberfläche aufgrund von Ödemen zu verhindern. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Analysen durchgeführt werden, wie z. B. Messungen der funktionellen Hyperämie mit dem Ziel, zusätzliche Fragen wie den Zusammenhang zwischen Gewebehypoxie und zerebrovaskulärer Kopplung zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mikroregionale Gewebehypoxie im Kortex der Maus visualisiert.