Annotation of Plant Gene-Funktion über Kombinierte Genomics, Metabolomik und Informatik

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neue Genfunktionen mithilfe der Genannotation durch kombinierte Analyse der Metabolitenprofilerstellung und der Co-Expressionsanalyse zu entdecken und zu charakterisieren. Dies wird durch die Berücksichtigung des experimentellen Designs unter besonderer Beachtung spezifischer Stoffwechselwege und Pflanzenarten erreicht. Im zweiten Schritt werden analytische Ansätze verwendet, um den gesamten Stoffwechselweg anhand der chemischen Strukturen der nachgewiesenen Verbindungen zu rekonstruieren.

Anschließend wird die Struktur des vorhergesagten Signalwegs mit einer Ko-Expressionsanalyse kombiniert, um Kandidatengene einzugrenzen, die vermutlich Schlüsselgene des Stoffwechsels darstellen. Letztendlich werden die Ergebnisse durch ein Mindestmaß an Experimenten unter effizienter Nutzung mehrerer biologischer Ressourcen erzielt, um die funktionelle Identifizierung von Genen zu charakterisieren. Unsere erste Idee zu dieser Methode entstand, als wir eine sehr hohe Korrelation von Abosi OID Bio-Zystengenen in der Ko-Expressionsdatenbank namens ate feststellten.

Wir sind der Ansicht, dass diese Strategie einer der schnellsten Wege ist, um die Funktionen von Neogenen mithilfe der öffentlich verfügbaren Datenbank und einer effizienten Nutzung biologischer Ressourcen zu ermitteln. Beginnen Sie die Extraktion, indem Sie das Pflanzenmaterial gewinnen und es sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sobald das Pflanzenmaterial zu Pulver zermahlen ist, portionieren Sie es mit einem Mühlenmixer in eine zwei Milliliter fassende EOR-Röhrchen und geben Sie anschließend eine Metallkugel in das Röhrchen.

Fügen Sie 250 Mikroliter Extraktionspuffer pro 50 Milligramm Probe hinzu. Der Extraktionspuffer enthält den internen Standard zur Normalisierung. Anschließend homogenisieren Sie das gefrorene Pulver zwei Minuten lang mit der Mühle.

Bei einer Frequenz von 25 zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang mit 12.000 U/min. Danach überführen Sie den Überstand in einen Zentrifalfilter. Nach einer zweiten Zentrifugation überführen Sie den Überstand in ein neues Einmaltube.

Als Nächstes richten Sie die HPLC ein, indem Sie zunächst überprüfen, ob die Temperatur des Säulenofens 35 Grad Celsius und die der Probenwechselvorrichtung 10 Grad Celsius beträgt. Richten Sie die Massenspektrometrie-Bedingungen ein und überprüfen Sie den Vakuumzustand und die Heizkapillare. Führen Sie eine Kalibrierung der Massenüberschreitung des MS-Detektors durch Infusionsinjektion der Kalibrierlösungsmischung durch.

Verwenden Sie die automatische Kalibrierungsanwendung in der Software. Überführen Sie anschließend 50 Mikroliter der Extrakte in ein Glasvial. Führen Sie für die HPLC mindestens fünf Injektionen des Extraktionspuffers durch, bevor die Analyse der ersten Probe wie im schriftlichen Verfahren beschrieben beginnt.

Nach der Konfiguration eines Massenspektrometrie-Analysewerkzeugs wählen Sie die zu verarbeitenden Daten aus. Bereiten Sie eine Tabelle der erfassten Peaks von Interesse gemäß der in der schriftlichen Anleitung angegebenen Verbindungsklasse vor. Identifizieren Sie die Peaks durch Ko-Evolution mit Standardverbindungen und annotieren Sie die erfassten Peaks mithilfe von MS/MS-Analyse, Literatur, Übersichten und Metabolit-Datenbankabfragen in diesem Schritt.

Die Vorhersage eines Stoffwechselwegs sollte auf den chemischen Strukturen basieren, indem die enzymatische Funktion im Stoffwechselweg verknüpft wird. Daher sollten diese Schritte durch eine präzise Peakzuordnung der nachgewiesenen Verbindungen durchgeführt werden. Datenbanken allgemeiner Stoffwechselwege wie die KEGG-Datenbank und PlantCyc sind sehr effektiv für die Vorhersage des betreffenden Stoffwechselwegs.

Um eine Genliste mit Arabidopsis-Orthologen vorzubereiten, laden Sie zunächst eine Gen-ID-Liste aus der genomischen Datenbank herunter. Fügen Sie die Arabidopsis-Gen-ID der Orthologengene hinzu, falls die Ziel-Pflanze nicht Arabidopsis ist. Bereiten Sie anschließend eine Liste der Gene im gewünschten Signalweg vor.

Die Annotation von Arabidopsis-Wegdaten und Genfamilien-Daten ist auf der TAAR-Website verfügbar. Listen orthologer Arabidopsis-Gene können anschließend kombiniert werden. Führen Sie eine Co-Expressionsnetzwerkanalyse durch, indem Sie die vorbereitete Gen-ID-Liste verwenden, um in der besten Datenbank nach dem vorhergesagten Weg zu suchen.

Überprüfung der Korrelation von wohlbekannten Genpaaren in dem betreffenden Signalweg. Falls keine Ko-Expressionsdatenbank oder Genexpressionsdatenbank verfügbar ist, sollte im Fall von Interesse die Arabidopsis-Ko-Expressionsdatenbank zusammen mit einer Liste von Arabidopsis-Autologen verwendet werden.

Als Nächstes konstruieren Sie das Gerüst für das Ziel-Ko-Expressionsnetzwerk. Gehen Sie dabei aus von den Verbindungen der gut bekannten Gene in dem betreffenden Signalweg. Fügen Sie korrelierte Kandidatengene hinzu und prüfen Sie deren Genannotation in den vorhergesagten Familien hinsichtlich ihrer Einbindung in dieses Netzwerk, um den besten Kandidaten zu identifizieren.

Die Genschwelle des Koeffizientenwerts sollte entsprechend der Netzwerkstruktur und der Dichte korrelierter Gene abgestimmt werden. Erstellen Sie nun eine Liste von Genen, die als auf den Zielweg spezialisiert eingegrenzt werden können. Anhand dieser Liste überprüfen Sie die Genexpression in Bezug auf organspezifische Ausprägungen und Stressantworten der Kandidatengene.

Beginnen Sie mit der Integration der Informationen, indem Sie gut charakterisierte Gene, die für die Abfrage der Ko-Expressionsanalyse verwendet wurden, dem vorhergesagten Stoffwechselweg hinzufügen. Führen Sie eine Literaturrecherche durch, um zu überprüfen, ob die nicht charakterisierten Teile dieses Weges neuartig sind, einschließlich nicht charakterisierter enzymatischer Schritte, Transportproteine und Transkriptionsfaktoren. Prognostizieren Sie zu diesem Zeitpunkt die am besten geeignete Genannotation für diese fehlenden, nicht charakterisierten Schritte.

Kombinieren Sie die Ergebnisse der Metabolitenprofilerstellung und der in silico-Genexpression von Kandidatengenen basierend auf dem vorhergesagten Stoffwechselweg. Ordnen Sie anschließend die Kandidatengene gemäß ihrer Genfunktion entlang des vorhergesagten Stoffwechselwegs an. Beispielsweise Acetyltransferase für acetylierte Metaboliten, Glycosyltransferase für Glykoside und P450 für oxidierte Verbindungen.

Überprüfen Sie die Konsistenz der Gewebespezifitäten oder Stressantworten zwischen Metabolitakkumulation und Genexpressionslevel der Kandidatengene. Prüfen Sie außerdem die Verbindungen zu anderen Stoffwechselwegen hinsichtlich der Bereitstellung von Substraten und stressresponsiver Gene. Führen Sie als letzten Schritt ein Experiment zur Identifizierung der Genfunktion unter Verwendung von Bioressourcen wie einer Knockout-Mutantenbibliothek und einer vollständigen cDNA-Bibliothek durch.

Hier ist ein Beispiel für eine Analyse eines Koregulationsnetzwerks des Anthocyanin-Stoffwechselwegs. Die Koregulationsanalysen wurden mithilfe des PRAM-Koexpressionindex basierend auf dem Datensatz der hinzugefügten Version drei mit dem PX-Programm durchgeführt, wobei rote Knoten dargestellt werden. 12 enzymatische Gene für Anthocyanine und zwei Transkriptionsfaktoren für die Anthocyaninproduktion wurden zur Suche nach Kandidatengenen verwendet. Ein Koexpressionsnetzwerk, das 68 korrelierte Kandidatengene und 14 Abfragegene umfasst, wurde durch eine vernetzte Mengensuche unter Verwendung der Prime-Datenbank rekonstruiert, was zu T-net-Ausgabedateien führte, die mit der PX-Software dargestellt wurden.

Die blauen Knoten zeigen die Kandidatengene an, die mit Anthocyan-Genen nach deren Entwicklung korrelierten. Diese Strategie wird uns einen guten Hinweis darauf geben, um Vorhersagen über neuartige Genfunktionen in pflanzlichen Stoffwechselprozessen zu treffen.