Name: Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Lernen Sie die Präparation intakter Bandscheiben aus Rinderkörpern für die Organkultur. Diese Methode ermöglicht mechanobiologische Studien und regenerative Medizinforschung mit lebensfähigen Zellen.

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Dieses Projekt wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (SNF # 310030-127586/1) unterstützt.

1. Bandscheiben-Harvesting <ol><li> Ganze Länge Rinder Schwanz ist von einem örtlichen Schlachthof erhalten, wenn möglich, ohne Haut, da die Anwesenheit der Haut erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination (Abb. 2). </li><li> Bereiten Sie große Schneidebrett und bereiten sterile Arbeitsplatz und Instrumente auf einem Schneidebrett (Abb. 2). </li><li> Bereiten Sie unter der sterilen Laminarströmungshaube steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat und in jedes Well der 6-Well-Platte. </li><li> Bereiten Sie eine Schüssel und verdünnt 1:100 Betadine Lösung mit Leitungswasser. </li><li> Tauchen Sie den gesamten Rinder-tail in einem Becken mit 1% Betadine Lösung für 5 min. </li><li> Kurz trocknen Schwanz mit steriler Gaze und legen Sie sie auf sterile Arbeitsplatz. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Muskeln rund um den Schwanz mit Skalpell Nr. 22. </li><li> Hacken weg die Teile des Schwanzes, die nicht benötigt werden, in der Regel an beiden Enden des Schwanzes, die relativ große und sehr kleine enthaltenIVD (Abb. 3). </li><li> Trim weiter die Muskeln und Sehnen auf der ganzen IVD mit Skalpell Nr. 10. Vorsicht nicht auf die äußeren Ring der Scheiben schneiden. </li><li> Mark der vorderen des IVD mit einem chirurgischen Hautmarker (dieser Schritt ist optional, hilft es, das Zentrum für axiale Rotation in unsere Bioreaktor zu bestimmen). </li><li> Suchen Sie den IVD und Wirbel Anschlusspunkt, indem Sie den Schwanz sanft. Spüren Sie die Grenze zwischen IVD und Knochen mit der stumpfen Seite eines Skalpell. Die Spaltung Website sollte 1-2 mm entfernt von der IVD in Richtung des Wirbels werden. Legen Sie maßgeschneiderte industrielle Messerhalter auf die Spaltung Website (Abb. 4). </li><li> Cleave IVD und Wirbel durch Hämmern auf der Oberseite des maßgeschneiderten industriellen Messerhalter (Abb. 3). </li><li> Wiederholen Sie auf der anderen Seite des IVD-Wirbel-Verbindung. </li><li> Wrap isoliert IVD mit steriler Gaze angefeuchtet mit 0,9% Natriumchlorid enthalten, 55mm Natriumcitrat. </li><li> Fahren Sie mit der Isolierung von IVD, um die gewünschte Sample-Nummer (in der Regel rund 6 könnengeerntet werden mit einem Durchmesser zwischen 10-20 mm). </li><li> Schließen Sie das Jet-Lavage System (Zimmer, inkl..) Mit steriler Ringer-Laktat-Lösung werden 5L Beutel eine nützliche Größe (alternativ sterile PBS oder 0,9% iger Kochsalzlösung). </li><li> Halten Sie die IVD mit einer Pinzette und Jet-Lavage beiden Seiten der Endplatte Oberfläche mit Zimmer Pulsavac Jet-Lavage System (Abb. 1C). Die Jet-Pistole sollte auf der Endplatte Oberfläche in einem Winkel zwischen 30 Schuss - 60 ° für ca. 30s auf jeder Seite. (Abb. 1 und 7) </li><li> Setzen Sie den IVD zurück zu den 6-Well-Platte und wickeln mit angefeuchteten Mull, während Jet Waschen eine andere Disc Probe. </li><li> IVD sind bereit für Orgel Kultur und down-stream-Applikationen (zB die Lebensfähigkeit der Zellen, mechanische Belastung, Orgelkultur) (Abb. 1D). </li></ol> 2. Repräsentative Ergebnisse Outcome-Messungen zu einer erfolgreichen Bandscheiben-Vorbereitung Richter kann eine Diffusion Experiment sein, wo ein kleines Molekulargewicht Fluoreszenzfarbstoff (zB Procion Red)bereit ist, als eine 1% ige Lösung in PBS 2. Der IVD ist dann mit mindestens 100 ml Farbstofflösung und der Farbstoff wird dann erlaubt, passiv diffundieren in die IVD für 24 Stunden unter freiem Schwellung gehalten. Der IVD ist dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und brachte wieder auf Raumtemperatur und dehydrierte durch eine Reihe von Aceton Transfers (first in -80 ° C, dann -20 ° C, dann 4 ° C und schließlich auf Raumtemperatur vorgekühlt ). Die Disc kann dann in Poly-Methyl-Acrylat (PMMA) eingebettet und mit einem scharfen Messer bis 100 Mikrometer dicke Schnitte erzeugen. Diese Abschnitte können dann von jedem Standard-Hellfeld-Mikroskop, sondern vorzugsweise durch Verwendung von Fluoreszenz-Mikroskopie seit Procion Red emittiert eine rote Fluoreszenz (Abb. 5-6) eingesehen werden. Die trabeculi der knöchernen Oberfläche erscheinen sehr sauber nach dem jet lavaging Schritt (Abb. 7). Parameter für eine erfolgreiche Orgelkultur sind in erster Linie das Fehlen von Verschmutzungen, erhalten die Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 8-9), Disc-Höhe undGesamt-Wertung "Disc Integrität", mit histologischen Schnitten und Safranin O / schnell grün färben oder Meyers Hämatoxilin 3 gemessen. Wir entwickelten Protokolle und Makros an anderer Stelle veröffentlicht 4,5 zu leben Bandscheibengewebe färben und die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop und dem Live / Dead Färbekit (Molecular Probes, Invitrogen, Basel, Schweiz) zu scannen. Wir weiterentwickelt einem Makro und Routine, um automatisierte Zellzählung, um die Lebensfähigkeit der Zellen in 3D-Gewebe-oder 3D-Träger mit dem NIH ImageJ-Plattform 6.4 Schätzung durchzuführen. Alternate-Protokolle wurden vorgeschlagen, um die Lebensfähigkeit der Zellen des Disc-Zellen durch anfängliche Verdauung mit sequentiellen Verdau der extrazellulären Matrix mit Pronase und Kollagenase Typ zu bestimmen 2 und dann auf die Zelle Aufhängung 7 Fleck. Eine frühere Version des Protokolls beteiligt einem Inkubationsschritt in PBS, die zehn Mal stärker konzentriert Penicillin / Streptomycin-Konzentration für 10 Minuten nach der Ernte der Scheiben vor Organ culture. Mit dem Jet-Lavage Schritt dieser Schritt hinfällig, da dieser Schritt vorteilhaft erscheint für die Kultivierung Zwecke. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Überblick über die methodischen Schritte an Rinder coccygeal Bandscheiben mit intakten Endplatten und eine dünne Schicht (1-2mm) von Knochen vorzubereiten. A) Schematische Darstellung der Bandscheibe (IVD) und ihre ernährungsphysiologischen Wege. B) Verfahren zum Ausschneiden der IVD mit einer angepassten Klinge-Halter und ein industrielles scharfe Klinge. C) Jet Lavage Schritt, um eine hohe Lebensfähigkeit der Zellen und Stoffaustausch halten die Endplatten und 1-2 mm Knochen auf beiden Seiten angebracht zu ermöglichen. D) Schließlich wird die IVD kann in der Probenkammer eines Bioreaktors kultiviert werden oder für jede down-stream-Anwendung verwendet werden. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 TOP:. Volle Länge frischem Rind Schwanz (idealerweise obtainiert innerhalb von 2-3 Stunden post mortem zu hohen Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Unten: Röntgenaufnahme eines Rinder-Schwanz um 6 Monate, welche die Existenz der Wachstumsfugen (GP), sekundäre Zentrum von Verknöcherung, zwischen den knöchernen Endplatten (EP) und der Wirbelkörpern (VB) im Alter. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. A) Tools, um die Rinder Schwanz unter sterilen Bedingungen zu sezieren. B) Customized Blade-Inhaber, cut-out Bewegungs-Segmente aus der Rinder-Schwanz in Aktion während des Schneidens der Bandscheibe. C) Side-Blick auf den kundenspezifischen Blade-Halter mit einem Standard-Industrie-Klinge (Lutz, Deutschland). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Zeichnen und Bild von der Rinder-tail nach dem Entfernen der umgebenden Muskeln und Bänder, welche die Spaltung von Websites zum Ausschneiden der Bewegungs-Segmente. Teilweise Wirbel sollte "geknackt" werden with die maßgeschneiderte Messerhalter idealerweise 1-2 mm entfernt von der knorpeligen Endplatten, um sicherzustellen, voller Knochenoberfläche. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Demonstration der effektiven Reinigung des Jet-Lavage Schritt vor (A) und nach (B). Beachten Sie die saubere Knochenoberflächen der Bandscheibe Segmente nach dem Sprühverfahren. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6. Free-Schwellungen Diffusionsversuch an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, demonstriert Blockade-Effekt durch das Wachstum Platte. Ein digitales Röntgen sagittale Ansicht eines IVD noch mit dem Wachstum Platte und eine zweite Schicht von Knochen Fluoreszenzmikroskopie Bild sagittal durchschnitten des Steißbeins Rinder Bandscheibe Explantation mit knorpeligen und knöchernen Endplatte nach 24h freie Diffusion. GP: Epiphysenfuge, 2ndry CO: Mittelzentrum der Verknöcherung. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7. Free-Schwellungen Experiment an frisch zubereiteten herausgeschnitten Rinder Schwanz Bandscheiben (IVD) für 24 Stunden in 1% Procion rote Lösung links, zeigt reinigende Wirkung der Jet Lavage Behandlung. Sagittal dicke Abschnitte (~ 100 mm) von Rindern herausgeschnitten IVD mit ~ 1,5-mmthick knöchernen Endplatten, die Jet-Lavage Behandlung (links) Steuerseite ohne Behandlung (rechts) jet-gespült Behandlung unterzog. Inlet zeigt das Spritzbild, die aus dem Zimmer Wundreinigung verwendet wurde 24 Stunden freie Diffusion Experimente von Rindern Bandscheibe Explantate in 1% Procion rot. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 8"> Abbildung 8. Live / Dead Bilder von Projektionen der konfokalen Imaging-Stacks (250μm) aus bovin genommene Bandscheibe Segmente mit diesem Jet-Lavage-Methode unter freien Schwellungen für 0 und 14 Tagen jeweils für den Nucleus pulposus (NP), der inneren Faserring (IA) und dem äußeren Faserring (OA) gehalten vorbereitet. Grüne Zellen = lebende Zellen von Calcein AM (Acetyl-Methylester) gefärbt, rote Blutkörperchen = tote Zellen Kern von Ethidium Homodimer-1 gefärbt. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 9"> Abbildung 9. Zellviabilitätsmessungen der Bandscheibe mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie an lebenden Gewebe und 3D-Stapel scannen. Die Lebensfähigkeit der Zellen des Nucleus pulposus (NP) und Faserring (AF) über die 21-Tage-Kultur unter free-Schwellungen Zustand. (Mittelwert ± SEM, N = 6) Statistische Unterschiede wurden mit nicht-parametrischen Kruskal-Wallis unterzeichnet Rangsummentest zwischen den Gruppen. Signifikante Unterschiede wurden zwischen Tag 21 und allen anderen Zeitpunkten in NP gefunden. Während in AF signifikanten Unterschiede zwischen Tag 7 gefundenTag 0. (* P &lt;0,05, ** p &lt;0,01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Der erste Schritt für eine erfolgreiche Orgelkultur ist, um sicherzustellen, dass die Explantation sollte nicht kontaminiert werden. Die Rute sollte gehäutet, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Jedes Tier Haare in ein steriles Labor gebracht werden konnte in Bezug auf die Kontamination problematisch. Die Rinder Schwanz sollte idealerweise so frisch wie möglich (dies betrifft zunächst die Lebensfähigkeit der Zellen). Darüber hinaus ist die betadine Waschschritt empfohlen, das Risiko einer Kontamination weiter zu verri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td colspan="4"> Frischem Rind Bandscheibengewebe aus Rinder-Tails aus den örtlichen Schlachthof (im Idealfall innerhalb weniger Stunden post mortem und ohne Haut). </td></tr><tr><td> Pulsavac Plus AC-System </td><td> Zimmer inkl.., Schweiz </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Beste Leistung mit dem Hip-Sprühkopf und mit AC-Netzteil (das mit der 8 AA Akkus hat auch, ist aber weniger komfortabel) </td></tr><tr><td> High Capacity Fan Spray w / Splash Shield, 12,7 cm Länge </td><td> Zimmer inkl.., Schweiz </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Es gibt mehrere Sprühköpfe zur Verfügung, testeten wir diese erfolgreich </td></tr><tr><td> Skalpellklingen Nr. 22 und Nr. 10 </td><td> Swann-Mortauf, England </td><td> Nr. 10: 0201 Nr. 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpel Messerhalter # 3 und # 4 </td><td> Hausmann, Deutschland </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz industriellen Klinge </td><td> Lutz, Deutschland </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Saline (PBS) </td><td> Invitrogen, Schweiz </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) </td><td> Gibco, Schweiz </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer-Laktat-Lösung (ohne Glukose) </td><td> Bichsel, Schweiz </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well Multi-Well-Platte </td><td> TPP, Schweiz </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine Lösung </td><td> Mundipharma, Schweiz </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Chirurgische Hautmarker </td><td> Porex Surgical, Schweiz </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Große Schneidebrett </td><td></td><td></td><td> Jede Marke ist möglich </td></tr></tbody></table>

vorbereitung von intact bovine rute bandscheiben für orgel kultur

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Die Bandscheibe (IVD) ist das Gelenk der Wirbelsäule verbinden Wirbel zu Wirbel. Es funktioniert nach Belastung der Wirbelsäule übertragen und bieten die Flexibilität, um die Wirbelsäule. Es komponiert aus drei Abteilungen: der innerste Kern pulposus (NP) umfasst von der Faserring (AF), und zwei knorpeligen Endplatten Anschluss der NP und AF auf die Wirbelkörper auf beiden Seiten. Bandscheibenbedingte Schmerzen möglicherweise durch degenerative Bandscheibenleiden (DDD) und Bandscheibenvorfälle verursacht hat, als ein großes Problem in unserer modernen Gesellschaft identifiziert worden. Zur Untersuchung möglicher Mechanismen der IVD-Degeneration, sind in vitro Orgelkultur Systeme mit Live-CD-Zellen sehr ansprechend. Die in vitro-Kultur von intakten Rinder coccygeal IVD hat einen entsprechenden Modell, das die Untersuchung der mechanisch-biologischen Aspekten in einer gut kontrollierten physiologischen und mechanischen Umgebung ermöglicht fortgeschritten. Bovine Schwanz IVD erhalten relativ leicht in höhere Zahlen Seien Sie eind sind sehr ähnlich wie das menschliche Lendenwirbelsäule IVD in Bezug auf die Zelldichte, Zell-Population und Dimensionen. Allerdings gelang früheren Rinder caudal IVD Erntetechniken Beibehaltung knorpeligen und knöchernen Endplatten Endplatten nach 1-2 Tagen der Kultur, da die Ernährung Wege waren offensichtlich durch geronnenes Blut blockiert. IVD sind die größten avaskuläre Organe, so sind die Nährstoffe zu den Zellen in der NP allein abhängig von der Diffusion über die Kapillare Knospen aus der benachbarten Wirbelkörper. Präsenz von Knochen Schutt und geronnenes Blut auf der Endplatte Oberflächen können Nährstoffdiffusion in die Mitte der Scheibe und des Kompromisses die Lebensfähigkeit der Zellen zu verhindern. Unsere Gruppe wurde eine relativ schnelle Protokoll-out &quot;knacken&quot; des IVD vom Schwanz mit einem geringen Risiko für Verunreinigungen. Wir sind in der Lage, den frisch geschnittenen knöchernen Endplatte Oberflächen mit Hilfe eines chirurgischen Jet-Lavage System, das die Bildung von Blutgerinnseln und Schneidabfall entfernt und sehr effizient öffnet die Ernährung Diffusionsweg permeabilisierenum die Mitte des IVD. Die Anwesenheit des Wachstums Platten auf beiden Seiten der Wirbelknochen muss vermieden werden und vor der Kultur entfernt werden. In diesem Video stellen wir die entscheidenden Schritte bei der Vorbereitung und Demonstration der Schlüssel zu einer erfolgreichen Orgelkultur Beibehaltung der hohen Lebensfähigkeit der Zellen für 14 Tage unter freiem Schwellungen Kultur. Die Kultur der Zeit könnte erweitert werden, wenn geeignete mechanische Umwelt durch mechanische Belastung Bioreaktor aufrechterhalten werden kann. Das kann die Methode auf andere Tierarten wie Schweine, Schafe und leporine caudal-und Lendenwirbelsäule IVD Isolation erweitert werden.

Dieses Protokoll stellt eine Erntetechnik für coccygeal Rinder Bandscheiben für Orgel Kultur<em&gt; In-vitro-</em&gt; Orgel Kultur.

Vorbereitung von Intact Bovine Rute Bandscheiben für Orgel Kultur

Die Bandscheibe (Intervertebraldiskuss, IVD) ist das Gelenk der Wirbelsäule, das Wirbel mit Wirbel verbindet. Sie dient dazu, die Belastung der Wirbelsäule zu übertragen und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, intakte Bandscheiben aus dem Schwanz von Rindern für die Kultur und andere nachgeschaltete Anwendungen vorzubereiten; in unserem Fall für die Kultivierung in einem Bioreaktor unter Verwendung komplexer mechanischer Belastung. Dies wird erreicht, indem zunächst der Kälberschwanz desinfiziert und anschließend die Muskulatur entfernt wird, um einen klaren Überblick über die knöchernen und diskalen Strukturen zu erhalten. Danach wird eine einzelne Bandscheibe unter Belassung von zwei bis drei Millimetern des angrenzenden Wirbelkörpers auf beiden Seiten mit einem speziellen Schneidwerkzeug herausgeschnitten.Der dritte Schritt besteht darin, die knöchernen Oberflächen der Bandscheibe mit dem Jet-Lavage-System zu reinigen, um die Diffusion kleiner gelöster Stoffe wie Glukose in das Zentrum der Bandscheibe sicherzustellen. Der letzte Schritt ist das Einlegen der Bandscheibe in ein stabilisierendes Puffermedium oder das Einwickeln in sterile Gaze, um sie für nachfolgende Anwendungen feucht zu halten. Letztendlich wird der Erfolg des Verfahrens mittels einer Live-Dead-Färbung überprüft, um das Vorhandensein lebender Zellen 14 oder 21 Tage nach Beginn der Bandscheiben-Kultur zu kontrollieren.Das folgende Protokoll zeigt, wie invertierbare Bandscheibensegmente für die Organkultur konserviert werden können, was zur Beantwortung zentraler Fragen der Mechanobiologie und Gewebeengineering beitragen kann. Es gibt gute Gründe dafür, dass die Rinder-Schwanzbandscheibe zu einem Modellsystem im Gewebeengineering geworden ist. Erstens ist die Zelldichte der menschlichen Bandscheibe sehr ähnlich und ebenso gering wie bei der introvertierten menschlichen Bandscheibe.Zweitens ist die Zellpopulation dort frei von nicht-kordalen Zellen, was der menschlichen Situation stark ähnelt. Drittens stimmen ebenfalls die Dimensionen und die biochemische Zusammensetzung sehr gut mit der menschlichen Situation überein. Im Allgemeinen haben Anfänger bei dieser Methode Schwierigkeiten, da es schwer ist, die knöcherne Endplatte vom Wirbelkörper zu unterscheiden, weshalb es schwierig erscheint, das Vorhandensein der Knorpelwachstumsplatte sicherzustellen.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir nach einer schnellen und sterilen Technik suchten, um die umkehrbare Scheibe mit Endplatte für die individuelle Kultur zu isolieren. Die visuelle Darstellung dieser Methoden ist wichtig, da es schwierig ist, eine Schnittstelle zu lokalisieren, weil sich diese nur etwa einen Millimeter von der knöchernen Platte entfernt befindet. Beschaffen Sie zunächst einen gesamten Rinder­schwanz aus einer örtlichen Schlachterei.Im Idealfall sollte der Schwanz nicht länger als vier Stunden postmortal sein und mit entfernter Haut gewonnen werden. Da das Vorhandensein von Haut die Kontaminationsgefahr erhöht, muss sichergestellt werden, dass alle für den Präparationsvorgang verwendeten Instrumente steril sind. Richten Sie außerdem eine sterile Arbeitsstation ein, indem Sie ein autoklaviertes Schneidebrett auf der Arbeitsfläche platzieren.Danach im sterilen Lamina-Fluss-Schrank ein Stück steriler Gaze mit 0,9 % steriler Natriumchloridlösung, die 55 Millimolar Natriumcitrat enth&auml;lt, befeuchten. Ein St&uuml;ck durchtr&auml;nkte Gaze in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte geben. Als N&auml;chstes ein sauberes Becken mit einer 1:100 verd&uuml;nnten Betadine-L&ouml;sung, die mit Leitungswasser versetzt wurde, f&uuml;llen und den Schwanz f&uuml;nf Minuten lang in die L&ouml;sung eintauchen.Nach dem Einweichen entfernen Sie den Schwanz. Trocknen Sie ihn kurz mit steriler Gaze ab und legen Sie ihn auf die sterile Arbeitsfläche. Entfernen Sie zunächst mit einem Skalpell der Größe 20 oder 22 die Muskulatur um den Schwanz herum. Anschließend schneiden Sie mit einer Gulaschschere die unerwünschten Teile des Schwanzes ab, üblicherweise vom proximalen und distalen Bereich, die relativ große bzw. sehr kleine Zwischenwirbelscheiben enthalten.Verwenden Sie dann ein Skalpell der Größe 10, um die Muskeln und Sehnen um die Bandscheiben herum zu entfernen. Achten Sie darauf, den äußeren Anulus der Bandscheiben nach Möglichkeit nicht zu verletzen. Zur Orientierung markieren Sie die Vorderseite der Bandscheibe mit einem chirurgischen Hautmarker.Bewegen Sie anschließend vorsichtig den Schwanz, um die Bandscheibe und die Verbindungsstelle zum Wirbel zu lokalisieren. Verwenden Sie die stumpfe Seite einer Skalpellklinge, um die Grenze zwischen der Bandscheibe und dem Knochen abzutrennen. Suchen Sie dann die Spaltstelle, die sich ein bis zwei Millimeter von der Bandscheibe in Richtung Wirbelkörper entfernt befinden sollte.Platzieren Sie den speziell angefertigten industriellen Messerhalter an der Spaltstelle. Dieses Diagramm zeigt sehr deutlich die Spaltstelle. Spalten Sie die Bandscheibe und die Wirbel, indem Sie auf die Oberseite des speziell angefertigten industriellen Messerhalters schlagen. Danach bewegen Sie den Messerhalter auf die andere Seite der Verbindung zwischen Bandscheibe und Wirbel und schlagen durch diese Seite der Bandscheiben-Wirbel-Verbindung, um die Bandscheibe zu lösen.Anschließend schnell die Bandscheibe mit steriler Gaze isolieren, die mit 0,9 %iger Natriumchloridlösung mit 55 Millimolar Natriumcitrat angefeuchtet wurde. Den Vorgang wiederholen, um die gewünschte Anzahl an Bandscheiben zu erhalten. Üblicherweise können aus einem Schwanz etwa sechs Scheiben mit einem Durchmesser von 10 bis 20 Millimetern gewonnen werden.Nachdem alle umkehrbaren Scheiben gewonnen wurden, schließen Sie das Jet-Spülsystem an einen dreiliter-Beutel sterile Ringer-Laktat-Lösung, sterile PBS oder 0,9 % sterile Kochsalzlösung an. Halten Sie dann eine umkehrbare Scheibe mit einer Pinzette und spülen Sie mit dem Jet-Spülsystem beide Seiten der Endplattenoberfläche jeweils 30 Sekunden lang ab, wobei das Jet-Spülsystem in einem Winkel von 30 bis 60 Grad zur Endplattenoberfläche gehalten wird. Diese Abbildung zeigt die Reinigungswirkung der Jet-Spülung. Die obere Reihe der Scheiben zeigt die umkehrbaren Scheiben vor der Reinigung, während die untere Reihe dieselben Scheiben nach der Reinigung darstellt.Wenn die erste Bandscheibe gespült wurde, wickeln Sie sie zur weiteren Verwendung in feuchte Mullbinden ein, während die anderen invertierbaren Bandscheiben gespült werden. Nach dem Spülen sind die invertierbaren Bandscheiben für die Organkultur bereit. Zusätzlich kann ein Diffusionsversuch durchgeführt werden, um den Erfolg der Vorbereitung der invertierbaren Bandscheiben zu überprüfen, wobei im laminaren Luftstromarbeitsplatz gearbeitet wird.Stellen Sie 40 Milliliter sterilem DMEM-Kulturmedium mit 5 % Fötalem Rinderserum pro Scheibe her. Gießen Sie das Medium in einen Becher und tauchen Sie eine einzelne Bandscheibe in das Medium ein. Stellen Sie den Becher auf eine schüttelnde Plattform in einem Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 °C und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist.Die Bandscheiben können auf diese Weise etwa 14 Tage lang kultiviert werden. Die Verwendung dieser speziell angefertigten Probekammern gewährleistet eine geeignete mechanische Belastung, wodurch eine längere Kulturzeit ermöglicht wird. Bereiten Sie zunächst 40 Milliliter sterile DMEM-Kulturmedien mit 5 % Fötales Kälberserum pro Scheibe wie zuvor beschrieben vor.Als Nächstes wird die umkehrbare Scheibe in eine der maßgeschneiderten Kulturkammern eingelegt und 40 Milliliter des frisch zubereiteten Mediums zugegeben. Die Kammer wird unter dem Flussgehäuse geschlossen. Anschließend wird die maßgefertigte Probekammer in einen Zellkulturinkubator gestellt.Fügen Sie Gewicht zur Kammer entsprechend der Oberfläche der Scheiben hinzu. Bereiten Sie zunächst 100 Milliliter einer 1%-igen Lösung eines fluoreszierenden Farbstoffs, wie beispielsweise Proso-Rot in PBS, pro Bandscheibe vor. Tauchen Sie anschließend die Scheibe in die Lösung ein und inkubieren Sie sie unter den gleichen Bedingungen über Nacht.Wie bei der Freischwellkultur wird nach der Inkubation die Scheibe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend in Aceton bei minus 80 Grad Celsius eingetaucht. Danach wird die Bandscheibe durch 24-stündige Inkubationen in Aceton bei minus 20 Grad Celsius, vier Grad Celsius und schließlich in Aceton bei Raumtemperatur langsam auf Raumtemperatur zurückgebracht. Nachdem die Scheibe wieder auf Raumtemperatur gebracht wurde, wird sie gemäß Standardverfahren vollständig ein bis zwei Wochen lang in Polymethylmethacrylat eingebettet.Nach vollständiger Einbettung wird die Probe durch Schneiden mit einer scharfen Klinge und Polieren mit einer Schleifmaschine bearbeitet. Nach der Bearbeitung kann die Diffusion von Pro-Cy-Red durch die Probe mittels Mikroskopie bewertet werden. Diese Bilder zeigen die Ergebnisse eines Freischwellungs-Diffusionsexperiments.Abbildung C zeigt die Röntgenübersicht einer invertierbaren Scheibe mit den beiden knöchernen Endplatten, die mit unserer Methode präpariert wurden. Auf der Oberseite wurde die Wachstumsfuge nicht entfernt und unter Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Es ist erkennbar, dass die Diffusion des roten Fluoreszenzfarbstoffs durch das Vorhandensein der als gp gekennzeichneten Wachstumsfuge blockiert wird, die somit als Barriere wirkt und die Anfärbung der tieferen Schichten der knorpeligen Endplatte und der invertierbaren Scheibe verhindert.Die Wachstumsfuge liegt zwischen dem primären und dem sekundären Ossifikationszentrum, das mit co gekennzeichnet ist. Wenn die Wachstumsfuge erfolgreich entfernt wurde, kann sich der rote fluoreszierende Farbstoff ungehindert bis zum Nucleus pulposus, gekennzeichnet mit np, ausbreiten. Diese Bilder zeigen die Reinigungswirkung der Jet-Lavage-Behandlung.Die sagittalen Schnitte haben eine Dicke von etwa 100 Mikrometern und die knöchernen Endplatten sind etwa 1,5 Millimeter dick. Hier wurde die Bandscheibe einer Jet-Lavage-Behandlung unterzogen, und die Diffusion des Farbstoffs ist über die gesamte Endplatte hinweg sichtbar. Auf der Kontrollseite hingegen, an der keine Jet-Lavage-Behandlung durchgeführt wurde, diffundiert der Farbstoff schlecht.Hier sehen wir Live-Dead-Konfokalmikroskopieaufnahmen von bovinen invertierbaren Discsegmenten, die mit dieser Jet-Lavage-Methode präpariert und unter Freischwellbedingungen für den Nucleus-pulposus-Prozess (gekennzeichnet als np), den inneren Annulus fibrosus (gekennzeichnet als IA) und den äußeren Annulus fibrosus (gekennzeichnet als oa) aufbewahrt wurden. Die grünen Bereiche zeigen lebende Zellen, die mit Calcium-acetyl-methyl-ester gefärbt wurden, und die roten Bereiche zeigen die Kerne abgestorbener Zellen, die mit Aum-Homodimer 1 angefärbt wurden. Aufnahmen aus denselben Regionen zeigen hier, dass nach 14 Tagen unter Freischwellbedingungen eine hohe Anzahl vitaler Zellen, angezeigt durch grüne Fluoreszenz, erhalten bleibt.Dieses Diagramm zeigt die Zellviabilität der Regionen Nucleus pulposus und Anulus fibrosus der Bandscheiben über den 21-tägigen Kulturzeitraum, dargestellt als Mittelwerte plus oder minus Standardfehler des Mittelwerts für sechs Proben. Wie gezeigt, wurden statistische Unterschiede mit nichtparametrischen Rosco-Wallace-Tests für gepaarte Stichproben (signed rank sum tests) zwischen den Gruppen geprüft.Signifikante Unterschiede wurden zwischen Tag 21 und allen anderen Zeitpunkten im Nucleus pulposus sowie im Annulus fibrosus gefunden. Signifikante Unterschiede zeigten sich zwischen Tag sieben und Tag null. Mithilfe dieses Verfahrens kann die Kulturbedingung angepasst werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise zum Einfluss mechanischer Belastung, Ernährung oder Wachstumsfaktoren auf den Verlauf der Degeneration oder Regeneration. Unser Protokoll beschleunigt die Gewinnungstechnik, wodurch gut interpretierbare Bandscheibensegmente für Ansätze im Bereich des Gewebemanagements zur Messung von Physiologie oder Mechanobiologie erhalten werden können. Bei herkömmlichen Methoden wird ein histologischer Bandschneider oder ein Fräswerkzeug verwendet, das etwa zwei Stunden länger benötigt als unser Protokoll.

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Bioengineering

Biotechnik

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