Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie
7. Januar 2012
Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.
Mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie ist die Bildaufnahme in tiefen Organbereichen möglich. Die Anregung fluoreszierender Proteine in der Zweiphotonenmikroskopie erfolgt, wenn zwei Photonen mit jeweils etwa gleicher Energie mit dem Molekül interagieren und dadurch eine Anregung erzeugen, die der Absorption eines einzelnen Photons mit der doppelten Energie entspricht. Daher werden bei einem Zweiphotonenmikroskop Infrarotlaser verwendet, wodurch die Bildaufnahme in dicken Gewebeschichten ermöglicht und Photobleichen sowie photoinduzierte Schäden minimiert werden.
Außerdem, da die Anregung auf die Fokusebene beschränkt ist, tritt keine Fluoreszenz außerhalb der Fokusebene auf. Zusammen mit neuen stereotaktischen Werkzeugen und chirurgischen Verfahren entwickelt es sich zu einer leistungsfähigen Technik, um zelluläre Verhaltensweisen in lebenden Tieren zu dokumentieren. In dieser Arbeit wurde die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um intravitale Bilder des Thymus zu gewinnen.
In diesem Organ findet die Reifung der T-Zellen statt, weshalb diese Technik bei Studien zur Thymozytenentwicklung nützlich sein kann. Beginnen wir nun mit den Protokollen. Zunächst die Tiere vorbereiten: Acht Wochen alte nude-Tiere mit 900 Rads bestrahlen. Nach der Bestrahlung die Tiere zurück in den Käfig stellen, bis die Knochenmarktransplantation erfolgt.
Zur Herstellung der Knochenmark-Suspension: Nach der Euthanasie der Spendermäuse mit Kohlendioxid und der Entfernung der Hintergliedmaßen werden Haut und Muskulatur von den Knochen abgelöst und in PBS aufbewahrt. Überführen Sie die Knochen in eine neue Petrischale mit PBS. Schneiden Sie die Enden der Knochen ab.
Füllen Sie eine Spritze mit PBS und spülen Sie die Knochen mit einer 25-Gauge-Nadel durch. Alternativ überführen Sie die Knochen in ein Mörsergefäß und zerkleinern Sie sie mit einem Pistill. Homogenisieren Sie das Knochenmark durch kräftiges Pipettieren und zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten bei 400 ×g. Resuspendieren Sie den Pellet.
Suspendieren Sie die Zellen in PBS und injizieren Sie sie intravenös in Ihre bestrahlte Maus. In den ersten Tagen nach der Übertragung tritt ein bestimmtes weiches Knochenmark auf. Da eine Rekonstitution durch 10 pl nicht erfolgt, beginnen die Mäuse 10 Tage nach der Bestrahlung zu sterben.
Jedoch warten wir sechs bis acht Wochen, um unsere Tiere als vollständig rekonstituiert zu betrachten. Um die Tierpräparation fortzusetzen, wird vier bis sechs Wochen nach der Knochenmarktransplantation eine embryonale Thymustransplantation durchgeführt, um die Beobachtung von Thymozyten in vivo zu ermöglichen.
Zunächst nach der Tötung trächtiger Weibchen am Tag 15 mittels Kohlendioxid und der Gewinnung der Embryonen, entfernen Sie den Thymus jedes Embryos und legen Sie diese in eine Platte mit kaltem PBS bis zur Verwendung. Narkotisieren Sie die Empfängertiere mit Ketamin und Xylazin und halten Sie sie auf einer Wärmematte. Wenn das Tier tief narkotisiert ist, reinigen Sie die Region mit Ethanol. Schneiden Sie die Haut, schneiden Sie die Bauchfellmembran, lokalisieren und exponieren Sie die Niere.
Nachdem die Niere freigelegt ist, wird ein kleiner Einschnitt in die Nierenkapsel und eine darunterliegende Tasche angelegt. Die embryonalen Thymusgewebe werden in diese Tasche eingebracht. Abschließend wird die Niere in ihre ursprüngliche Position zurückverlagert und die Bauchhöhle sowie die Haut verschlossen.
Bei Tierversuchen mit Nähten muss das Tier Analgetika erhalten und auf einer Heizplatte platziert werden, bis es sich von den Anästhetika zu erholen beginnt. Das Verhältnis zwischen CD4-positiven und CD8-positiven Zellen kann wöchentlich durch Blutprobenanalysen verfolgt werden. Tiere mit einem Verhältnis von etwa 1,521 akzeptierten das Thymusorgan.
Die Anteile der T-Zell-Populationen im transplantierten Thymus entsprechen den Anteilen im endogenen Thymus von Kontrolltieren. Die intravitale Bildgebung des transplantierten Thymus erfordert einen neuen chirurgischen Eingriff am Tier sowie die Verwendung unserer Tierhaltervorrichtung. Injizieren Sie zunächst Ketamin, Xylazin und Anästhetika.
Sobald das Tier bewusstlos ist, legen Sie es auf eine Heizplatte und injizieren intravenös Rodin-Isothiocyanat-Dextran, um eine spätere Beobachtung des Blutflusses im Gewebe zu ermöglichen. Öffnen Sie die Haut und die Bauchhöhle, um die Niere mit dem transplantierten Thymus freizulegen, und verhindern Sie so, dass die Niere in ihre ursprüngliche Position zurückkehrt.
Schließen Sie die laterale Seite des Hautschnitts mit Nähten. Überführen Sie das Tier auf die Heizplatte auf dem Haltestadium für Tiere. Klemmen Sie beide Seiten der Niere ab.
Unter Verwendung einer Klammer aus Aluminiumfolie. Schließen Sie den Tierhalter und platzieren Sie die obere Heizung. Führen Sie die Sonde so nah wie möglich an Ihr Gewebe heran.
Gebe niedrig schmelzendes Agarose über Ihre Probe. Bedecken Sie die gesamte Probe mit dem oberen Heizelement. Überwachen Sie die Anästhesie und verabreichen Sie alle 40 Minuten anästhetische Auffrischungsdosen.
Nach Abschluss der Operation wird die gesamte Aufbautung nun auf das Zwei-Photonen-Mikroskop übertragen, um weitere Bildaufnahmen durchzuführen. In unserem Fall verwendeten wir ein Prairie-Ultima-Zwei-Photonen-Mikroskop, das mit einem Titan-Saphir-Laser, vier PMTs vom Typ „top“ sowie einem 20x-Wasser-Immersions-Objektiv ausgestattet ist. Schalten Sie zuerst den Laser und das Mikroskop ein.
Fügen Sie dann RIC-Spiegel und Filterkästen gemäß den gewünschten Wellenlängen hinzu. Platzieren Sie das Tier im Mikroskop. Schließen Sie alle Heizplatten an ihre Steuergeräte an.
Geben Sie Wasser auf die Öffnung des oberen Heizelements und senken Sie das Objektiv vorsichtig in das Wasser ein. Fokussieren Sie auf Blutgefäße oder GFPT-Regs mithilfe des externen XY- und Z-Controllers. Finden Sie schnell den interessierenden Bereich.
Stellen Sie die Verstärkung der PMTs so ein, dass die Farbtrennung optimiert und der zur Erzielung eines ausreichenden Signals über dem Hintergrund erforderliche Laserstrahl minimiert wird. Sobald der interessierende Bereich lokalisiert ist, beginnen Sie die zeitraffende Bildaufnahme, indem Sie sequenzielle Bilder eines 50 Mikrometer tiefen Gewebevolumens in unserem Basissystem aufnehmen. Jedes Volumen benötigt 30 Sekunden für die Aufnahme.
Daher wird eine 30-minütige Bildaufnahme nach 60 aufeinanderfolgenden Wiederholungen dieses Volumens erreicht. Dieses Video zeigt GFP-positive Zellen innerhalb des Thymus. Beachten Sie die Zellbewegung und den Blutfluss innerhalb der Gefäße.
Jedoch, wenn die Vorbereitung nicht gut ist, ist in diesem Fall die Organtemperatur niedrig. Die Zellen hören auf, sich zu bewegen, selbst wenn der Blutfluss weiterhin anhält. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Beobachtung von Thymozyten in ViiV.
Diese Methoden sollten für jeden Immunologen äußerst nützlich sein, der die Verteilung und Wechselwirkungen von Thymozyten während der T-Zell-Entwicklung beobachten möchte. Obwohl die Methode recht einfach ist, sollten einige Schritte beachtet werden, um experimentelle Artefakte zu vermeiden. Beispielsweise ist darauf zu achten, keine Blutgefäße zu beschädigen, da dies die Sauerstoffversorgung im Gewebe verringern würde. Außerdem sollte die Temperatur stets bei 37 Grad Celsius gehalten werden.
Schließlich sollten die hier erzielten Ergebnisse sehr nützlich sein, um andere Ergebnisse oder mit x vivo-Techniken gewonnene Befunde zu validieren.
Übersicht
Diese Studie stellt neuartige Laborwerkzeuge und Protokolle für die intravitale Bildgebung des Thymus mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie vor. Das Verfahren zielt darauf ab, das Verständnis der T-Zell-Entwicklung zu vertiefen, indem spezifische Nischen innerhalb des Thymus identifiziert werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Intravitale Bildgebung
Hintergrund
- Mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie lässt sich in dicken Geweben mit minimalem Photobleichen abbilden.
- Diese Technik ist entscheidend, um zelluläre Verhaltensweisen in lebenden Tieren zu untersuchen.
- Der Thymus ist für die Reifung und Entwicklung von T-Zellen unerlässlich.
- Das Verständnis der Thymozyten-Interaktionen ist von zentraler Bedeutung für die immunologische Forschung.
Zweck der Studie
- Protokolle für die intravitale Bildgebung des Thymus entwickeln.
- Nischen im Thymus identifizieren, in denen die T-Zell-Entwicklung stattfindet.
- Zelluläre Verhaltensweisen in lebenden Tieren während der T-Zell-Maturierung dokumentieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung bestrahlter Nacktmäuse für die Knochenmarktransplantation.
- Transplantation embryonaler Thymusgewebe in Empfängertiere.
- Intravitale Bildgebung mittels eines Zweiphotonenmikroskops.
- Überwachung von Thymocytenpopulationen und Durchblutung während der Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Aufnahme von intravitale Bildern des Thymus.
- Beobachtung der Verteilung und Interaktionen von Thymozyten.
- Entwicklung von Protokollen für zukünftige Studien zur T-Zell-Entwicklung.
- Nachweis der Wirksamkeit der Zwei-Photonen-Mikroskopie in der Live-Bildgebung.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelten Methoden sind wertvoll für Immunologen, die die T-Zell-Entwicklung untersuchen.
- Intravitale Bildgebung liefert Einblicke in die Dynamik von Thymozyten.
- Sorgfältige Durchführung der Protokolle ist entscheidend, um experimentelle Artefakte zu vermeiden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die intravitale Zweiphotonen-Mikroskopie des Maus-Thymus ermöglicht die direkte Visualisierung der T-Zell-Entwicklung und der Dynamik regulatorischer T-Zellen (Treg) in ihrem nativen Mikromilieu. Diese Fähigkeit schließt eine entscheidende Lücke im Verständnis zellulärer Interaktionen in vivo und unterstützt die mechanistische Risikominderung sowie die Zielstruktur-Validierung in immunologisch ausgerichteten Entdeckungsansätzen. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit für frühe immunmodulatorische Arzneimittelprogramme, indem er physiologisch relevante Daten zur Thymozyten-Aktivität und zur Nischenlokalisation liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Beobachtung von Treg- und Thymozyten-Interaktionen in situ zur funktionellen Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem es Echtzeit-Verhaltensweisen von Zellen innerhalb der thymischen Nische aufzeigt.
- Liefert physiologisch relevante Hinweise zur Überprüfung immunologischer Hypothesen und zur Aufklärung von Signalwegen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erleichtert die Herstellung validierter In-vivo-Modelle für nachgeschaltete Immunologie-Tests.
- Liefert quantitative bildgebende Ergebnisse zur Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die Beurteilung von Arzneimittelwirkungen auf die T-Zell-Generierung und -Migration in einem lebenden Gewebe-Kontext.
Translationale und präklinische Forschung
- Bringt präklinische Modelle mit der krankheitsrelevanten Entwicklung und Funktion des Immunsystems in Übereinstimmung.
- Unterstützt die identifizierung translationaler Biomarker, indem bildgebende Befunde mit T-Zell-Phänotypen korreliert werden.
- Verbessert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem eine In-vivo-Validierung von Strategien zur Immunmodulation bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses intravitale Bildgebungsprotokoll integriert sich in den immunologischen Entdeckungsprozess, von frühen mechanistischen Studien bis hin zur präklinischen Validierung immunwirksamer Substanzen.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung und die Kartierung von Signalwegen für die T-Zell-Entwicklung und -Regulation.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare Bildgebungsdaten, um die Wirkung von Substanzen auf die Thymozytendynamik zu bewerten.
- Analytik: Erzeugt Zeitraffer- und Volumendaten für die vergleichende Analyse zellulärer Verhaltensweisen und Arzneimittelwirkungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse aus In-vivo-Studien mit präklinischen Untersuchungen zur Immunmodulation.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsplattform für vielfältige Immunologie- und Zelltherapieprogramme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung immunologischer Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Standardisiert In-vivo-Bildgebungsworkflows hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über verschiedene Studien hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühe immunologische Wirkstoffe entrisikt werden.
- Portfolioauswirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung immunmodulierender Kandidaten basierend auf In-vivo-Evidenz.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in fortgeschrittener Mikroskopie, Tierversuchschirurgie und immunologischen Modellsystemen.
- Setzt Zugang zu Zwei-Photonen-Mikroskopie-Plattformen und spezialisierten stereotaktischen Organhaltern voraus.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung zwischen den Teams, um Reproduzierbarkeit sicherzustellen und Artefakte zu minimieren.
- Möglicherweise ist eine Anpassung für verschiedene Organsysteme oder Immunzellpopulationen notwendig.
- Eine sorgfältige Kontrolle physiologischer Parameter (z. B. Temperatur, Sauerstoffversorgung) ist entscheidend, um experimentelle Artefakte zu vermeiden.
