Name: Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Erfahren Sie die intravitalen Bildgebungsmethoden des Thymus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bei lebenden Mäusen. Diese Technik ermöglicht Immunologen die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung und thymozytären Dynamik in vivo.

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Wir möchten Dr. David Olivieri für die kritische Durchsicht des Manuskripts, Dr. Nuno Moreno danken für die logistische Hilfe für unsere Tier-Halter und Heizkissen und Dr. Vijay K. Kuchroo für die Sachspende von Foxp3-KI gfp / GFP bauen Mäusen. Diese Arbeit wird durch &quot;Fundação para Ciência e Tecnologia&quot; (FCT, Portugal), Grant # PTDC/EBB-BIO/115514/2009 unterstützt.

1. Tierische Vorbereitung Wichtige Hinweise: BM Zellsuspensionen und Thymus-Transplantationen wurden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die BM-Suspensionen wurden in die Hauben unserer Zellkultur Zimmer vorbereitet, während die Thymus-Transplantation in den Operationssaal in unserer Tier-Einrichtung befindet, durchgeführt wurde. Um zu halten und Gewährleistung dieser aseptischen Bedingungen, durften wir nicht zu unserem Video in diesen Orten aufzunehmen. Allerdings wurden alle chirurgischen Materialien autoklaviert und der chirurgischen Bank war zuvor mit Virkon (Pharmacal Research Laboratories Inc.) und 70% Ethanol gereinigt. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) und sie wurden im Einvernehmen mit der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) Richtlinien. Die Zulassung ID-Nummer ist AO10/2010. Alle Bild-Experimente wurden Klemme Verfahren und die Tiere wurden unmittelbar nach dem Ende des Bildes eingeschläfertErwerb. Die detaillierte Vorgehensweise ist wie folgt: <ol><li> Bestrahlen (mit einem γ-Strahler) 8 Wochen alte Nacktmäuse mit 900 rad auf die endogenen hämatopoetischen Vorläufer innerhalb des Knochens Zucchini (BM) zu zerstören. Nach der Bestrahlung Rückkehr der Tiere in ihre Käfige, bis Sie den Spender BM-Zellen für die intravenöse Injektion und weitere BM Rekonstitution vorzubereiten. Das BM übertragen wurde 1 h nach der Bestrahlung durchgeführt. </li><li> Trennen Sie die BM Spendertiere. Schienbeine und Oberschenkel der Hinterbeine von einem Tier sind in der Regel genug zu rekonstruieren bis zu 3 Empfänger Tiere. Nach Euthanasie mit CO 2, entfernen Sie den hinteren Gliedmaßen und entfernen Sie dann die Haut und Muskeln von den Knochen. </li><li> Cut am geschlossenen Ende eines jeden Knochen und spülen Sie es mit PBS (oder RPMI) oder quetschen sie alle in einem Mörser mit einem Stößel, mit 2 ml PBS (oder RPMI), um den BM zu entfernen. </li><li> Stören des BM-Struktur in ein Single-Cell-Suspension durch Wiederholungen der kräftige Aspiration using einer P1000 Pipette. Alternativ können Sie auch den BM während einer 21G Kanüle mehrmals. Zentrifuge (400g, 5 min, RT), resuspendieren Zellen in PBS und intravenös in Ihre nude-bestrahlten Empfänger. In unseren Experimenten verwendeten wir BM von Foxp3-KI gfp / GFP-Mäuse, wo alle regulatorischen T-Zellen (Tregs) GFP 1 Schnellzugwagen wird. </li><li> Die Akzeptanz des Spenders BM tritt in den ersten Tagen nach der Übertragung, da Nicht-BM-rekonstituierte Tiere nicht überleben können mehr als 14 Tage. Allerdings sollte man für 4 bis 6 Wochen warten, um in vollem Umfang der Einziehung aller BM Fächer zu ermöglichen. Bactrim (Roche) wurde auf dem Wasser (2 mg / ml) während der ersten Woche nach der Bestrahlung hinzugefügt, um das Risiko von bakteriellen Infektionen zu verringern. </li><li> Embryonale Thymus-Transplantation wurde bereits 2 beschrieben. Kurz gesagt, beginnen Brutpaare isogenen Mäusen und prüfen zum Einstecken (Nachweis des Koitus) jeden Tag. Separate gesteckt Weibchen und CO 2-euthanize sie am Tag 15 der pregnancy (Beobachtung der Stecker ist Tag 1 der Schwangerschaft). Entfernen Sie die Embryonen und die Thymusdrüse. Legen Sie die embryonale Thymus in kaltem PBS bis zum Transfer. </li><li> Zur Durchführung des Thymus Transplantation betäuben BM-Empfänger Nude Mäuse mit Ketamin (120 ug / g Maus Gewicht) / Xylazin (16 pg / g Maus Gewicht) und bewahren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C, bis sie sich bewusstlos. </li><li> Chirurgisch Setzen der Niere zur Transplantation des Thymus durchzuführen. Zuerst reiben Sie die Haut mit ChloraPrep (CareFusion Inc.) und 70% Ethanol. Dann eine 1 cm auf der Haut des Rückens-lateral Körperteil des Tieres, 2 mm unterhalb des letzten Brust-Rippe geschnitten. </li><li> Cut der Bauchhöhle und ziehen Sie die Niere von diesem Hohlraum. Machen Sie einen kleinen oberflächlichen Schnitt in der Nierenkapsel mit einem Skalpell. Mit einer Pinzette mit einer sehr dünnen Spitze einen Beutel unter die Nierenkapsel des Empfängers Maus und bis zu 4 Thymus Lappen in diese Tasche. </li><li> Legen Sie die Niere b ack an seinen Platz, Naht der Bauchhöhle mit einem oder zwei Stiche, und schließen Sie die Haut von Mäusen mit der gleichen Naht-Methode. Alternativ können Nähte erfolgt über chirurgische Kleber werden. </li><li> Inject analgetische (Butorphanol bei 5 mg / kg) subkutan direkt nach Beendigung der Operation zu Tier Schmerzen zu vermeiden und halten die Tiere in einem Heizkissen, bis sie aus der Narkose zu erholen beginnen. Mäuse sind individuell für die ersten 3 Tage nach der Transplantation zu Käfig Kumpels aus dem Entfernen der Fäden zu verhindern Käfig. Entfernen Stiche nach 1 Woche. </li><li> Nacktmäusen keine T-Zellen. Daher können Sie die Thymusdrüse Transplantat Akzeptanz durch die Überwachung der Anteil der CD4 + oder CD8 + T-Zellen im Blut zu bewerten. Einmal pro Woche, 2 Wochen nach Thymus-Transplantation, bluten die Tiere und Flecken des Blutes mit anti-CD4 und anti-CD8 monoklonalen Antikörpern (MAbs). Wenn die CD4: CD8-Verhältnis von etwa 2:1 ist, ist die transplantierten Thymus voll funktionsfähig (Abbildung 1). </li></ol>"&gt; 2. Intravital Bildaufnahme Bereiten Sie alle Materialien, die Sie im Voraus müssen und legte sie beiseite wird. <ol><li> Anesthetize Tiere mit Ketamin / Xylazin (gleiche Dosen in Punkt 1.5 beschrieben) und platzieren Sie sie auf einem Heizkissen bei 37 ° C. Inject 100 ul von Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran (20 mg / ml in PBS) intravenös Zukunft Visualisierung des Blutflusses erlaubt. </li><li> Expose der Niere mit der transplantierten Thymus nach dem Protokoll bereits in Punkt 1.6 beschrieben. </li><li> Um zu verhindern, die Niere von der Rückkehr in seine ursprüngliche Position, in der Nähe der seitlichen Seiten der Hautschnitt mit Stichen. </li><li> Legen Sie ein Stück PBS-getränkte Baumwolle auf der Oberseite des Organs zu halten sie feucht. </li><li> Legen Sie die Heizkissen auf den Tierhalter Stufe (Abbildung 2A). </li><li> Legen Sie das Tier auf dem Heizkissen in der Tierhalter, Orgel up (Abbildung 2B). </li><li> Pinch das Organ an beiden Seiten mit einer Klemme made von dünnen Aluminiumfolie (Abbildung 2C). </li><li> Schließen Sie die Tierhalter und Ort der Oberheizung Sonde so nahe wie möglich zu Ihrem Gewebe (Abb. 2D). Diese Heizung Sonde misst ständig die Orgel Temperatur und sendet diese Informationen an die Heizung, die elektrischen Strom einzustellen, halten sie bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die PBS-getränkte Baumwolle und fügen niedrig schmelzende Agarose (2% in PBS) bei 30 ° C am Anfang Ihrer Vorbereitung. </li><li> Decken die gesamte Vorbereitung mit der Oberheizung (Abbildung 2E). In die Öffnung an dieser Heizung gibt es ein Deckglas Isolierung der Agarose von den objektiven (Abbildung 2f). Überwachen Sie die Maus Anästhesie und injizieren eine halbe Dosis erhöhen alle 40 min. Nach der Bildaufnahme, einschläfern des Tieres mit CO 2. </li></ol> Hinweis: Bilder von der Aluminiumfolie Clip und der Oberheizung sind in Abbildung 3 dargestellt. 3. Zwei-Photonen-Imaging-Übernahme Wir haben eine aufrechte "Prairie Ultima XY" Zwei-Photonen-Mikroskop. Unser System ist mit einem Ti ausgestattet: Saphir-Laser, vier Top-PMTs zur gleichzeitigen bis zu 4-Kanal-Akquisitionen und einem 20x Wasser Immersionsobjektiv. <ol><li> Schalten Sie den Ti: Saphir-Laser und die ganze Mikroskop-System. </li><li> Add dichroitische Spiegel und Filter-Sets nach den Wellenlängen gewünscht. In unserem Fall haben wir eine Olympus-BX2 Chroma Halter mit einem 565 nm dichroitischen Spiegel, ein 525/50 nm Filter (für Foxp3-GFP-Signal), und ein 595/50 nm Filter (für Dextran-Rhodamin-B-Signal in die Blutgefäße ). Die Laser-Wellenlängenbereich verwendet wurde zwischen 880 bis 900 nm liegt. </li><li> Fügen Sie den Tierhalter an das Mikroskop, anschließen und einschalten alle Heizungen, Wasser hinzufügen, auf der Oberheizung Blende, vorsichtig das Ziel ins Wasser, und konzentrieren sich auf ein Schiff oder ein GFP-Tregs. </li><li> Mit dem Mikroskop x, y, z externe Steuerung, schnell Umfrage des Gewebes zu einer Region finden von Interesse. </li><li> Stellen Sie den Gewinn aus dem PMTs zu Farbseparation optimieren und die Höhe der Laser benötigt, um ein ausreichendes Signal gegenüber dem Hintergrund zu erreichen. Versuchen Sie, die minimale Menge von Laser verwenden, um Foto-Schaden von Gewebe zu vermeiden. </li><li> Sobald der Region Interesse liegt, beginnen Zeitraffer-Bildgebung. In unserem Fall ein typisches 5D (x, y, z, t und Farbe) besteht Übernahme-Protokoll für den Erwerb aufeinander folgenden Bildern einer 50 mu m-Tiefe Gewebe Volumen, in 4,0 um z-Schritten, x-und y-Länge von 140 um geteilt jeder. Jeder Band dauert etwa 30 Sekunden erfasst werden. Daher werden 60 Akquisitionen durchführen rund 30 min von der Bildaufnahme. </li><li> Übertragen Sie die Daten zu den institutionellen Server und verwenden ImageJ, Imaris oder Volocity Software, multi-dimensionale Darstellung und Zell-Tracking durchzuführen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse g1.jpg "/&gt; Abbildung 1. . Embryonale Thymus Akzeptanz und Funktion Nach BM erholen, wurden embryonale Thymus zu BM rekonstituierten Tieren transplantiert, zwei Wochen nach Thymus Transplantation dieser Mäuse wurden einmal pro Woche ausgeblutet der Anteil der T-Zell-Subtypen durch Färbung mit anti-CD4 oder anti-CD8-Monitor MAbs. Wir haben überlegt, den Thymus wurde erfolgreich bei Tieren mit einer CD4 akzeptiert: CD8-Verhältnis um 1.5-2.0:1 (A). Um zu bestätigen, seine Funktionalität, wir einigen Thymus-transplantierten Tiere getötet und gegenüber der Prozentsatz der verschiedenen Thymozyten-Subpopulationen mit WT-Mäusen (B). Der Anteil der Doppel-negative (DN; CD4 - CD8 - Thymozyten) Subpopulationen (durch Färbung mit anti-CD25 und anti-CD44 mAk), Doppel-positive (DP; CD4 + CD8 + Thymozyten) und Single-positive (SP) CD4 + oder CD8 + Thymozyten waren ähnlich zwischen diesen Tieren. ig2.jpg "/&gt; Abbildung 2. Tierische Inhaber Montage. Nach tief narkotisiert, das Tier auf einem Heizkissen gelegt wird, die zuvor auf der Oberseite des Tieres Inhaber Stufe (A) montiert. Die Niere, die die transplantierten Thymus ist nach oben (B). Eine Aluminiumfolie Klemme zart kneift die ganze Niere (C) zu halten, statt. Abb.. 1C einfügen zeigt im Detail die Klemme. Der obere Teil des tierischen Halter ist in Ort (D) gestellt. Die PBS-getränkte Baumwolle ist von der Spitze des Organs, durch warme niedrig schmelzende Agarose ersetzt entfernt, und die Oberheizung hinzugefügt wird (E). Schließlich ist die ganze Versammlung an das Mikroskop übertragen, hier vertreten durch das Objektiv (F). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3504/3504fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Details der Inhaber Teile. Diese Bilder zeigen die Aluminiumfolie Klammer (A) hält die Niere (B). Beachten Sie auch die Region, in der die transplantierten Thymus befindet. Diese etwa zeigt die Regionin den Thymus Kapsel geschnitten und machen die Tasche, um die embryonale Thymus setzen. Die Oberheizung Deckglas (C) wurde mit Silikonkleber an ihrem unteren Teil (D) fest. Movie 1. Intravital Bildgebung von Foxp3-GFP + Thymozyten im Thymus, wo die physiologischen Ebenen der Sauerstoffversorgung und Temperatur (37 ° C) während des gesamten Prozesses gehalten wurden. Beachten Sie die Durchblutung und die Bewegung der Tregs. Diese Geschwindigkeiten können gemessen und verglichen werden mit den veröffentlichten Daten. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie1.avi">Klicken Sie hier, um sich den Film anzusehen.</a> Movie 2. Intravital Bildgebung von Tregs in einem Thymus, wo die Bilder bei 30 erworben wurden ° C. Beachten Sie das Fehlen von Bewegung und die runde Form der Zellen trotz der Aufrechterhaltung der Durchblutung. <a href="/files/ftp_upload/3504/3504movie2.avi">Klicken Sie hier um den Film anzusehen.</a>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

In diesem Papier haben wir gezeigt, die Verfahren für die Zwei-Photonen-Imaging von Thymozyten im Inneren eines lebenden Tieres. Wir haben auch beschrieben, einige Parameter, die man sorgfältig kontrollieren sollten, wie die Fortsetzung des Blutflusses und der Aufrechterhaltung der Orgel Temperatur während der bildgebenden Verfahren. Dennoch, trotz sorgfältiger Anstrengungen, um die Orgel stabil ist, kann Bewegungsartefakte wie &quot;Organ driften&quot; auftreten. Posterior Bildkorrektur kann durch die Entwicklung von Algorithmen speziell für diesen Zweck konzipiert durchgeführt werden. Weitere Bildanalyse könnte auch die Quelle für neue Protokolle Entwicklung, die Fehler zu minimieren sucht. Der Thymus ist das Organ, wo alle T-Zellen produziert und sind daher es das Organ, in dem Immunologen in das Verständnis der Generation von γδ interessiert ist, wird CD4 oder CD8 T-Zellen ihre Aufmerksamkeit. Die meisten Studien über T-Zellen sind auf Unterschiede in den Zahlen und / oder Stabilität dieser Basis cEllen nach verschiedenen in vitro / in vivo Manipulationen. Allerdings erst nach der in vivo-Visualisierung konnten wir beobachten die Interaktion zwischen Zellen des Immunsystems in der Aufrechterhaltung der Homöostase 3-7 beteiligt. Daher ist die in vivo Beobachtung von Thymozyten wahrscheinlich eine der wichtigsten fehlenden Informationen besser zu verstehen, T-Zell-Biologie. Intravital TPM bietet ein detailliertes Bild der T-Zell-Bewegungen und Interaktionen, und wir zeigen hier, wie es für detaillierte Thymozyten Studien eingesetzt werden kann. Allerdings hat jede Technik ihre Grenzen. Während intravital Imaging Acquisition ist die genaueste System zur reflektierenden Zellen Verhalten im Inneren des Körpers, es ist auch wahr, dass explantierten Bildaufnahme von Organen weniger aufwändig ist und verwendet wurde, um wichtige Informationen über das Immunsystem 8,9 sammeln. Darüber hinaus kann man nicht leugnen intravital bildgebenden Verfahren eine Operation erforderlich, um Gewebe und Blutgefäße in narkotisierten Tiere auszusetzen,die per se könnte eine Veränderung in der gesamten Organs Physiologie 10. Dennoch gibt es nicht-invasiv Methoden, die die Artefakte, die durch den chirurgischen Eingriff 11 und neue Methoden verursacht abschaffen werden entwickelt, die besser im Voraus vorbereiten zu verwendenden Tiere 12 sein. Daher werden neue chirurgische Verfahren und Gebühren zu minimieren oder zu umgehen tatsächlichen Grenzen der intravitalen Imaging Erwerb und sich mehr und mehr zugänglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Wir haben gezeigt, dass die Methode, die wir beschrieben haben, machbar ist und es meldet alle in vivo systemische Manipulationen, wie Medikamentengabe, die wir verwendet haben. Daher empfehlen wir den Einsatz dieser Methode in Verbindung mit ex vivo Techniken bereits zur Verfügung, um die Ergänzung und Verstärkung weitere Studien über die Thymozyten Entwicklung.

<table><tbody><tr><td>Rhodamin B-Isothiocyanat-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Stammlösung bei 20 mg/ml herstellen</td><td></td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Mikroskop</td><td>Prairie Technologies Inc.</td><td>Prairie Ultima X-Y</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saphir-Laser</td><td>Coherent, Inc.</td><td>Chameleon Ultra Family</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x/1,00 NA Immersionsobjektiv</td><td>Olympus Inc.</td><td>XLUMPLFLN 20XW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halter (Filter/Dichroik)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td><td>91018 BX2 (U-MF2)</td></tr><tr><td>525 nm/50-Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/50m</td><td></td><td></td></tr><tr><td>595 nm/50-Filter</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET595/50m</td><td></td><td></td></tr><tr><td>565 nm Dichroik</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td><td>565dcxr</td></tr><tr><td>Imaris-Software</td><td>Bitplane AG Inc.</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer Inc.</td><td>Volocity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, USA</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of the mouse thymus mittels 2-photonen-mikroskopie

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) bietet Bildaufnahme in tiefe Bereiche innerhalb Geweben und Organen. In Kombination mit der Entwicklung neuer Werkzeuge und stereotaktische Eingriffe, wird TPM eine leistungsfähige Technik, die auf &quot;Nischen&quot; im Inneren Organe zu identifizieren und zellulären &quot;Verhaltensweisen&quot; in lebenden Tieren zu dokumentieren. Während intravital Bildgebung liefert Informationen, die am ehesten der realen zellulären Verhalten innerhalb des Organs, ist es sowohl aufwändiger und technisch anspruchsvoll im Hinblick auf erforderliche Ausrüstung / Verfahren als alternative ex-vivo-Bildgebung Akquisition. So beschreiben wir ein chirurgischer Eingriff und Roman &quot;stereotaktische&quot; Organ Halter, die uns an die Bewegungen des Foxp3 + Zellen innerhalb des Thymus verfolgen können. Foxp3 ist der Master-Regler für die Generierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Dh: Darüber hinaus können diese Zellen nach ihrer Herkunft klassifiziert werden. Thymus-differenzierten Tregs sind &quot;natürlich vorkommenden Tregs&quot; (nTregs) genannt, als opposed zu peripher umgewandelt Tregs (pTregs). Obwohl erhebliche Menge an Forschung hat in der Literatur über den Phänotyp und die Physiologie dieser T-Zellen berichtet wurde, ist sehr wenig über ihre in-vivo-Wechselwirkungen mit anderen Zellen bekannt. Dieser Mangel kann durch das Fehlen von Techniken, die solche Beobachtungen ermöglichen würde. Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen Abhilfe schafft eine für diese Situation. Unser Protokoll besteht in der Verwendung Nacktmäusen, dass eine endogene Thymus fehlen, da sie eine pünktliche Mutation in der DNA-Sequenz, die die Differenzierung von einigen epithelialen Zellen, einschließlich Thymus Epithelzellen Kompromisse. Nacktmäuse wurden gamma-bestrahlt und rekonstituiert mit Knochen Zucchini (BM) aus Foxp3-KI gfp / GFP-Mäusen. Nach BM Erholung (6 Wochen), erhielt jedes Tier embryonalen Thymus-Transplantation in die Nierenkapsel. Nach Thymus Akzeptanz (6 Wochen) wurden die Tiere narkotisiert, der Niere, die dietransplantierten Thymus ausgesetzt war, fest in unsere Orgel Inhaber und hielt unter physiologischen Bedingungen in vivo Bildgebung von TPM. Wir haben mit diesem Ansatz auf dem Einfluss von Drogen in die Generierung von regulatorischen T-Zellen zu studieren.

Wir haben neuartige Labormethoden und Protokolle zur intravitale Bildgebung des Thymus entwickelt. Unsere Technik sollte bei der Identifizierung von „Nischen“ im Thymus helfen, in denen die Entwicklung von T-Zellen stattfindet.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ermöglicht die Bildgebung in tief liegenden Bereichen innerhalb von Geweben und Organen. In Kombination mit der Entwicklung neuer stereotaktischer...

Mithilfe der Zweiphotonenmikroskopie ist die Bildaufnahme in tiefen Organbereichen möglich. Die Anregung fluoreszierender Proteine in der Zweiphotonenmikroskopie erfolgt, wenn zwei Photonen mit jeweils etwa gleicher Energie mit dem Molekül interagieren und dadurch eine Anregung erzeugen, die der Absorption eines einzelnen Photons mit der doppelten Energie entspricht. Daher werden bei einem Zweiphotonenmikroskop Infrarotlaser verwendet, wodurch die Bildaufnahme in dicken Gewebeschichten ermöglicht und Photobleichen sowie photoinduzierte Schäden minimiert werden.Außerdem, da die Anregung auf die Fokusebene beschränkt ist, tritt keine Fluoreszenz außerhalb der Fokusebene auf. Zusammen mit neuen stereotaktischen Werkzeugen und chirurgischen Verfahren entwickelt es sich zu einer leistungsfähigen Technik, um zelluläre Verhaltensweisen in lebenden Tieren zu dokumentieren. In dieser Arbeit wurde die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um intravitale Bilder des Thymus zu gewinnen.In diesem Organ findet die Reifung der T-Zellen statt, weshalb diese Technik bei Studien zur Thymozytenentwicklung nützlich sein kann. Beginnen wir nun mit den Protokollen. Zunächst die Tiere vorbereiten: Acht Wochen alte nude-Tiere mit 900 Rads bestrahlen. Nach der Bestrahlung die Tiere zurück in den Käfig stellen, bis die Knochenmarktransplantation erfolgt.Zur Herstellung der Knochenmark-Suspension: Nach der Euthanasie der Spendermäuse mit Kohlendioxid und der Entfernung der Hintergliedmaßen werden Haut und Muskulatur von den Knochen abgelöst und in PBS aufbewahrt. Überführen Sie die Knochen in eine neue Petrischale mit PBS. Schneiden Sie die Enden der Knochen ab.Füllen Sie eine Spritze mit PBS und spülen Sie die Knochen mit einer 25-Gauge-Nadel durch. Alternativ überführen Sie die Knochen in ein Mörsergefäß und zerkleinern Sie sie mit einem Pistill. Homogenisieren Sie das Knochenmark durch kräftiges Pipettieren und zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten bei 400 ×g. Resuspendieren Sie den Pellet.Suspendieren Sie die Zellen in PBS und injizieren Sie sie intravenös in Ihre bestrahlte Maus. In den ersten Tagen nach der Übertragung tritt ein bestimmtes weiches Knochenmark auf. Da eine Rekonstitution durch 10 pl nicht erfolgt, beginnen die Mäuse 10 Tage nach der Bestrahlung zu sterben.Jedoch warten wir sechs bis acht Wochen, um unsere Tiere als vollständig rekonstituiert zu betrachten. Um die Tierpräparation fortzusetzen, wird vier bis sechs Wochen nach der Knochenmarktransplantation eine embryonale Thymustransplantation durchgeführt, um die Beobachtung von Thymozyten in vivo zu ermöglichen.Zunächst nach der Tötung trächtiger Weibchen am Tag 15 mittels Kohlendioxid und der Gewinnung der Embryonen, entfernen Sie den Thymus jedes Embryos und legen Sie diese in eine Platte mit kaltem PBS bis zur Verwendung. Narkotisieren Sie die Empfängertiere mit Ketamin und Xylazin und halten Sie sie auf einer Wärmematte. Wenn das Tier tief narkotisiert ist, reinigen Sie die Region mit Ethanol. Schneiden Sie die Haut, schneiden Sie die Bauchfellmembran, lokalisieren und exponieren Sie die Niere.Nachdem die Niere freigelegt ist, wird ein kleiner Einschnitt in die Nierenkapsel und eine darunterliegende Tasche angelegt. Die embryonalen Thymusgewebe werden in diese Tasche eingebracht. Abschließend wird die Niere in ihre ursprüngliche Position zurückverlagert und die Bauchhöhle sowie die Haut verschlossen.Bei Tierversuchen mit Nähten muss das Tier Analgetika erhalten und auf einer Heizplatte platziert werden, bis es sich von den Anästhetika zu erholen beginnt. Das Verhältnis zwischen CD4-positiven und CD8-positiven Zellen kann wöchentlich durch Blutprobenanalysen verfolgt werden. Tiere mit einem Verhältnis von etwa 1,521 akzeptierten das Thymusorgan.Die Anteile der T-Zell-Populationen im transplantierten Thymus entsprechen den Anteilen im endogenen Thymus von Kontrolltieren. Die intravitale Bildgebung des transplantierten Thymus erfordert einen neuen chirurgischen Eingriff am Tier sowie die Verwendung unserer Tierhaltervorrichtung. Injizieren Sie zunächst Ketamin, Xylazin und Anästhetika.Sobald das Tier bewusstlos ist, legen Sie es auf eine Heizplatte und injizieren intravenös Rodin-Isothiocyanat-Dextran, um eine spätere Beobachtung des Blutflusses im Gewebe zu ermöglichen. Öffnen Sie die Haut und die Bauchhöhle, um die Niere mit dem transplantierten Thymus freizulegen, und verhindern Sie so, dass die Niere in ihre ursprüngliche Position zurückkehrt.Schließen Sie die laterale Seite des Hautschnitts mit Nähten. Überführen Sie das Tier auf die Heizplatte auf dem Haltestadium für Tiere. Klemmen Sie beide Seiten der Niere ab. Unter Verwendung einer Klammer aus Aluminiumfolie. Schließen Sie den Tierhalter und platzieren Sie die obere Heizung. Führen Sie die Sonde so nah wie möglich an Ihr Gewebe heran.Gebe niedrig schmelzendes Agarose über Ihre Probe. Bedecken Sie die gesamte Probe mit dem oberen Heizelement. Überwachen Sie die Anästhesie und verabreichen Sie alle 40 Minuten anästhetische Auffrischungsdosen.Nach Abschluss der Operation wird die gesamte Aufbautung nun auf das Zwei-Photonen-Mikroskop übertragen, um weitere Bildaufnahmen durchzuführen. In unserem Fall verwendeten wir ein Prairie-Ultima-Zwei-Photonen-Mikroskop, das mit einem Titan-Saphir-Laser, vier PMTs vom Typ „top“ sowie einem 20x-Wasser-Immersions-Objektiv ausgestattet ist. Schalten Sie zuerst den Laser und das Mikroskop ein.Fügen Sie dann RIC-Spiegel und Filterkästen gemäß den gewünschten Wellenlängen hinzu. Platzieren Sie das Tier im Mikroskop. Schließen Sie alle Heizplatten an ihre Steuergeräte an.Geben Sie Wasser auf die Öffnung des oberen Heizelements und senken Sie das Objektiv vorsichtig in das Wasser ein. Fokussieren Sie auf Blutgefäße oder GFPT-Regs mithilfe des externen XY- und Z-Controllers. Finden Sie schnell den interessierenden Bereich.Stellen Sie die Verstärkung der PMTs so ein, dass die Farbtrennung optimiert und der zur Erzielung eines ausreichenden Signals über dem Hintergrund erforderliche Laserstrahl minimiert wird. Sobald der interessierende Bereich lokalisiert ist, beginnen Sie die zeitraffende Bildaufnahme, indem Sie sequenzielle Bilder eines 50 Mikrometer tiefen Gewebevolumens in unserem Basissystem aufnehmen. Jedes Volumen benötigt 30 Sekunden für die Aufnahme.Daher wird eine 30-minütige Bildaufnahme nach 60 aufeinanderfolgenden Wiederholungen dieses Volumens erreicht. Dieses Video zeigt GFP-positive Zellen innerhalb des Thymus. Beachten Sie die Zellbewegung und den Blutfluss innerhalb der Gefäße.Jedoch, wenn die Vorbereitung nicht gut ist, ist in diesem Fall die Organtemperatur niedrig. Die Zellen hören auf, sich zu bewegen, selbst wenn der Blutfluss weiterhin anhält. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Beobachtung von Thymozyten in ViiV.Diese Methoden sollten für jeden Immunologen äußerst nützlich sein, der die Verteilung und Wechselwirkungen von Thymozyten während der T-Zell-Entwicklung beobachten möchte. Obwohl die Methode recht einfach ist, sollten einige Schritte beachtet werden, um experimentelle Artefakte zu vermeiden. Beispielsweise ist darauf zu achten, keine Blutgefäße zu beschädigen, da dies die Sauerstoffversorgung im Gewebe verringern würde. Außerdem sollte die Temperatur stets bei 37 Grad Celsius gehalten werden.Schließlich sollten die hier erzielten Ergebnisse sehr nützlich sein, um andere Ergebnisse oder mit x vivo-Techniken gewonnene Befunde zu validieren.

intravital-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zwei-Photonen-Imaging hat Lymphozyten Motilität und zellulären Interaktionen im Lymphknoten unter basalen Bedingungen und während einer Immunantwort Antwort 1 aufgedeckt. Hier zeigen wir, adoptiven Transfer von T-Zellen, Isolierung von Lymphknoten und Imaging-Motilität der CD4 + T-Zellen in der explantierten Lymphknoten.

Dissection und 2-Photonen-Imaging der peripheren Lymphknoten in Mäusen

Wir präsentieren Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Erzeugung von Chimären Neugeborenen sowie die Präparation und Vorbereitung des Thymus für die Ex-vivo-Bildgebung durch 2-Photonen-Mikroskopie.

In situ Imaging der Maus Thymus mit 2-Photonen-Mikroskopie

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Source: Nishimura, C. et al. Quantifizierung der zerebralen Gefäßarchitektur mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation. J. Vis. (2016). Dieses Video zeigt die In-vivo-Visualisierung von kortikalen Kapillaren im Gehirn von Mäusen mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. Es beschreibt die Schritte zur Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in eine anästhesierte Maus mit einem dünnschädeligen kortikalen Fenster, zur Vorbereitung des Aufbaus für die...

 Zwei-Photonen-Mikroskopie für die In-vivo-Bildgebung von Mikrogefäßen im Gehirn von Mäusen 

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

In-vivo-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium der Biologie in Gesundheit und Krankheit. Dieses Protokoll beschreibt die transpupille Bildgebung der Netzhaut der Maus mit einem Standard-Zwei-Photonen-Mikroskop. Es zeigt auch verschiedene In-vivoimaging-Methoden, um mehrere zelluläre Kohorten der Netzhaut fluoreszierend zu markieren.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.

Eine minimal-invasive, genaue und effiziente Technik zur intrathymischen Injektion bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Diese Studie präsentiert einen in-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebungsansatz zur Visualisierung der Strukturen von Axonterminals mit niedriger Schwelle von Mechanorezeptoren (LTMR) in der Vorderpfotenhaut von Mäusen. Durch wiederholte, hochauflösende Bildgebung einzelner Axone bietet diese Methode eine neue Grundlage, um die Struktur und Funktion des kutanen Sinneskreises während der Entwicklung und bei Erwachsenen zu untersuchen.

Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung der Morphologie des berührungssensorischen Axons in der Maushaut

Erfahren Sie die intravitalen Bildgebungsmethoden des Thymus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie bei lebenden Mäusen. Diese Technik ermöglicht Immunologen die Untersuchung der T-Zell-Entwicklung und thymozytären Dynamik in vivo.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

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