Name: Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Immunfärbemethode für dissezierte Zebrafisch-Embryonenherzen. Diese Technik ermöglicht hochauflösende Bildgebung zellulärer Strukturen bei deutlich reduzierter Bearbeitungszeit.

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Wir danken Beninio Jomok für seine Hilfe beim Zebrafisch Tierhaltung. Diese Arbeit wird durch NIH HL81753 finanziert.

1. Vorbereitung von Dias und Feuchtekammer <ol><li> Die befeuchteten Kammer kann aus einer Kiste wie ein geleert tip box erfolgen. Wrap sowohl der Kammer und der mit Alufolie abdecken, um die Proben vor Licht zu schützen. </li><li> Im Inneren der Kammer, legte einen Haufen nasse Papiertücher, um die Feuchtigkeit in der Kammer, die das Herz Proben vor dem Austrocknen wird verhindert, aufrecht zu erhalten. Setzen Sie einen kleinen Microplatte auf der Oberseite des Papiertuch als Ablage für die Folien. </li><li> Zeichnen Sie Linien oder Kreise auf der Oberfläche eines Objektträgers mit dem immEdge Stift Brunnen für Herz-Proben mit einer Größe ca. 5x5 mm zu machen. Lassen Sie die Folien trocken. </li><li> Legen Sie die Folien in der feuchten Kammer und fügen 50ul frisch 4% Formaldehyd in jede Vertiefung. </li></ol> 2. Dissection von embryonalen Herzen <ol><li> Anesthetize sich der Embryo in E3 Ei Wasser 7 mit 0,4% Tricaine für ca. 1 Minute bis der Fisch zu stoppen Bewegung des Körpers, aber immer noch normales Herzzu schlagen. </li><li> Legen Sie eine konkave Objektträger auf der Bühne eines Dissektionsmikroskop. Übertragen Sie die Embryonen in die konkave gut. </li><li> Passen Sie das Licht Kombination der Präpariermikroskop zu zeigen deutlich das Herz. Je nach persönlicher Vorliebe, könnte es entweder Dunkelfeld oder DIC-like polarisiertem Licht Zustand sein. </li><li> Saubere zwei Insulin-Spritzen mit 75% Ethanol, dann trocknen lassen. </li><li> Passen Sie die Dissektionsmikroskop höhere Vergrößerung und Fokussierung auf das Herz. Körperlich fix ein Embryo durch Einstecken mit einem Nadelspitze in den Dotter-Somiten Grenze in der Nähe des Kopfes. Legen Sie eine andere Nadel in der Nähe der Herzgegend und ziehen das Herz schnell. Wenn das Herz nicht völlig aus dem Embryo getrennt, schneiden Sie die restlichen angeschlossenen Gewebe zwischen dem Herzen und dem Eigelb. </li><li> Passen Sie das Mikroskop geringer Vergrößerung und Fokussierung auf die getrennte Herzen. Verwenden Sie eine 10 &amp;mgr; l pipetteman und setzen Sie ihn auf 1μl Volumen. Übernehmen Sie die Spitze des pipetteman entweder ziehen oder berühren Sie dieHerz Probe, so dass das isolierte Herz wird entweder innerhalb oder an der Oberfläche der Spitze sein. </li><li> Tauchen Sie die Pipettenspitze in 4% Formaldehyd-Lösung auf vorbereitete Objektträger und drücken Sie die Pipette Kolben an das Herz in die Lösung veröffentlichen. Die Spannung der Wasseroberfläche hilft auch das Herz von Pipettenspitze, um die Lösung veröffentlichen. Legen Sie weniger als 3 Herzen in jede Vertiefung. </li></ol> 3. Immunfärbung <ol><li> Schließen Sie die Kammer und legte es auf einem Schüttler mit einer sanften Schaukelbewegung. Fix Herzen Probe für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wischen Sie das Wasser auf der Rückseite der Folien und legen die Folien auf der Bühne eines Dissektionsmikroskop für Puffer auszutauschen. </li><li> Tauchen Sie die Spitze von einem 10 &amp;mgr; l pipetteman in einen leeren Bereich in jede Vertiefung und halten Sie die Spitze so weit wie möglich von Herz-Proben. Nehmen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um das Herz Befestigung an der Spitze zu vermeiden, da Herzen mit dem Wasserstrom zu bewegen könnte, wenn die Lösung in die Spitze gezogen wird. Änderungdie Spitze Lokalisierung, falls nötig. </li><li> Entsorgen Sie die Lösung auf ein Gewebe und vermeiden jegliche Blasen in die Spitze, da das Herz Probe wird leicht in Gegenwart von Luftblasen verloren. Keeping das Herz Proben teilweise trocken für eine kurze Zeit kann helfen, die Herzen zu bleiben an den Folien. </li><li> Add 50 ul PBST das Herz Probe abdecken und inkubieren in der feuchten Kammer in eine langsame Schaukelbewegung für 5 min. Wiederholen Sie die Spülung noch einmal. Nach diesem Schritt kann das Herz Proben in der feuchten Kammer bis zu 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Blockieren Sie die Herzen Probe mit 10% Schafserum in PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Herzen Probe mit primärer Antikörper, wie zB 1:200 Verdünnung von β-Catenin-Antikörper und 1:200 Verdünnung MEF2 spezifischen Antikörper, in 10% Schafserum / PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Herzen Probe mit PBST dreimal (5 min.) Bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Probe mit sekundärenAntikörper, wie 1:1000 Verdünnung von Alexa-markierten anti-Maus und / oder anti-Kaninchen-Antikörper, in PBST 0,5 Stunden. </li><li> Waschen Sie die Herzen Proben mit PBST dreimal (5 min.) Bei Raumtemperatur. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Entfernen PBST und mit 10 ul Eindeckmedium in jede Vertiefung. Rock the Kammer für einige Minuten, bis die Lösung klar wird. </li><li> Entfernen Sie die meisten der Eindeckmedium und decken alle der Brunnen in eine Folie mit einem Mikroskop Deckglas (24x50). </li><li> Bild Fisch Herz mit Zeiss Axioplan 2 Mikroskop mit ApoTome (Carl Zeiss) ausgestattet. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für ein Bild, das Membran und Kerne aller Zebrafisch Kardiomyozyten offenbart, ist in Abb. dargestellt. 1. mef2c und β-Catenin-Antikörper wurden zusammen, um Herz-Proben von 52 hpf Zebrafischembryo seziert Flecken verwendet. Während mef2c Antikörper färbt die Kerne von Herzmuskelzellen, β-CateninAntikörper zeigt die Grenze der einzelnen Zellen 8-10. Durch die Anpassung der Phase des zusammengesetzten Mikroskop können die Bilder des Herzens Proben der gleichen Orientierung, die die Beobachtung der äußeren Krümmung und der inneren Krümmung im Herzen 11 ermöglichen wird eingestellt werden. Die gesamte Anzahl Kardiomyozyten, Kardiomyozyten Zellgröße und Zirkularität kann dann gemessen werden. Ein weiteres Beispiel, das Sarkomer Struktur eines embryonalen Herzens offenbart, ist in Abb. dargestellt. 2. Wir führten Immunfärbung mit F59, ein Myosin-Antikörper, in einem aufgeschnittenen embryonalen Herzen. Die Myofibrillen Netzwerk in eine ganze embryonale Herz kann deutlich niedrigeren Vergrößerung offenbart werden, während die gestreiften Band aus dickem Faden bei höherer Vergrößerung (Abb. 2) 6 enthüllt werden kann. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig1.jpg"> Abbildung 1. Immunfärbung von MEF2 (rot) und β-Catenin (grün), die Kerne und outl zeigenines der Kardiomyozyten in einem Zebrafisch Ventrikels. Balken = 10 um <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3510/3510fig2.jpg"> Abbildung 2. Immnostaining von Myosin der dicken Filamente in einem Zebrafisch Ventrikel entweder geringer Vergrößerung (A) oder mit hoher Vergrößerung (B) zu zeigen. Balken = 10 um

<ol><li>Shin, J. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Zebrafish+to+human%3A+modular+medical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genomics+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">From Zebrafish to human: modular medical models.</a> Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3, 311-340 (2002).</li>
<li>Beis, D., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+biology%3A+following+the+zebrafish+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends. Cell. Biol. 16, 105-112 (2006).</li>
<li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cardiac+development%3A+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 27-35 (2007).</li>
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<li>Huang, W., Zhang, R., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibrillogenesis+in+the+developing+zebrafish+heart%3A+A+functional+study+of+tnnt2%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2.</a> Dev. Biol. 331, 237-249 (2009).</li>
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<li>Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+zebrafish+essential+and+regulatory+myosin+light+chains+reduces+cardiac+function+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms.</a> Cardiovasc. Res. 79, 97-108 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Vergleich zu klassischen whole mount Immunfärbung Methoden, hat unsere Methode folgende Vorteile. Erstens kann viel stärkere Fluoreszenzsignale konsequent erreicht werden durch die verbesserte Penetration. In der ganze Berg Immunfärbung Methode, die dichten Haut umgebende Gewebe des Herzens deutlich reduziert das Eindringen von vielen Antikörper, was zu hohen Hintergrund in den ganzen Körper. Dieses Problem ist besonders gravierend für Embryonen älter als 3-Tages-post-Fertilisation (DPF). Im Gegensatz dazu seziert He...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Research Organics </td><td> 3007T </td></tr><tr><td> Formaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 04018 </td></tr><tr><td> Insulin Spritze </td><td> Becton Dickinson </td><td> 329461 </td></tr><tr><td> Triton-X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td></tr><tr><td> Anti-β-Catenin-Antikörper </td><td> Sigma </td><td> C7207 </td></tr><tr><td> Anti-Mef2c Antikörper </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> SC313 </td></tr><tr><td> F59 </td><td> Zfin </td><td></td></tr><tr><td> Anti-α-Antikörper actinin </td><td> Sigma </td><td> A7811 </td></tr><tr><td> Anti-Ilk Antikörper </td><td> Zelluläre Signale </td><td> # 3862 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 Ziege anti-Kaninchen IgG </<html> td&gt; <td> Invitrogen </td><td> A11011 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG1 </td><td> Invitrogen </td><td> A21121 </td></tr><tr><td> Eindeckmedium für die Fluoreszenz- </td><td> Vektor </td><td> H-1200 </td></tr><tr><td> ImmEdge Stift </td><td> Vektor </td><td> H-4000 </td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63410-01 </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fischer </td><td> 12 bis 543-D </td></tr><tr><td> Konkave Objektträger </td><td> Fischer </td><td> 7-1305-8 </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td> Leica MZ95 </td><td></td></tr><tr><td> Zusammengesetztes Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> Axioplan2 </td></tr><tr><td> ApoTome </td><td> Zeiss </td><td></td></tr></tbody></table> PBST: 1 x PBS 0,5% Triton-X 100 ENT &quot;&gt; 25X Tricaine: 400 mg Tricaine 97,9 mL ddH 2 O 2,1 ml (1M Tris pH 9) Der pH-Wert auf 7,0

immunfärbung von dissected zebrafisch embryonale herz

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafisch-Embryo wird zu einem beliebten In-vivo-Modell zum Studium der Wirbeltiere kardiale Entwicklung und menschlichen Herzerkrankungen aufgrund seiner vorteilhaften Embryologie und Genetik 1,2. Etwa 100-200 Embryonen sind leicht zugänglich jede Woche von einem einzigen Paar von erwachsenen Fischen. Die transparente Embryonen, die ex utero entwickeln eignen sie sich ideal für die Beurteilung der Herzfehler 3. Der Ausdruck eines beliebigen Gens kann über Morpholino Technologie-oder RNA-Injektion 4 manipuliert werden. Darüber hinaus freuen genetische Screens haben bereits eine Liste von Mutanten, die unterschiedlichen Perspektiven der Kardiogenese 5 berühren generiert. Whole mount Immunfärbung ist eine wichtige Technik in diesem Tiermodell die Expressionsmuster des Zielproteins zu einem bestimmten Gewebe 6 offenbaren. Allerdings haben Bilder mit hoher Auflösung, dass zelluläre oder subzelluläre Strukturen offenbaren kann schwierig gewesen, vor allem aufgrund der physikalischen location des Herzens und der schlechten Penetration der Antikörper. Hier stellen wir eine Methode, um diese Engpässe durch Sezieren Herz zuerst und dann die Durchführung der Färbung auf der Oberfläche eines Objektträgers Adresse. Um den Verlust von kleinen Herzen Proben zu verhindern und die Lösung Handhabung zu erleichtern, haben wir eingeschränkt Herzen Proben innerhalb eines Kreises auf der Oberfläche der Objektträger durch eine immEdge Stift gezeichnet. Nach der Färbung kann die Fluoreszenz-Signale direkt von einem zusammengesetzten Mikroskop beobachtet werden. Unsere neue Methode verbessert das Eindringen von Antikörpern, da ein Herz aus einem embryonalen Fisch besteht nur aus wenigen Zellschichten. Qualitativ hochwertige Bilder von intakten Herzen kann innerhalb eines stark reduzierten Prozession Zeit für Zebrafischembryonen im Alter von Tag 2 bis Tag 6 gewonnen werden. Unsere Methode kann möglicherweise ausgeweitet werden auf andere Organe entweder von Zebrafisch oder andere kleine Tiere seziert Fleck.

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Der Zebrafisch-Embryo ist aufgrund seiner vorteilhaften Embryologie zu einem beliebten In-vivo-Wirbeltiermodell für die Untersuchung der Herzentwicklung und menschlicher Herzkrankheiten geworden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Immunfärbung an isolierten embryonalen Zebrafissherzen durchzuführen, um zelluläre oder subzelluläre Strukturen in hoher Auflösung sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst Objektträger in einer befeuchteten Kammer für die Immunfärbung vorbereitet werden. Anschließend wird das Herz aus einem anästhesierten Zebrafissembryo isoliert und anschließend die Immunfärbung am embryonalen Herzen mit einem spezifischen Antikörper durchgeführt.Dann werden Bilder von Fischherzen mit einem Mikroskop, das mit einem AOME ausgestattet ist, dokumentiert. Schließlich werden zelluläre oder subzelluläre Strukturen im embryonalen Zebrafischherzen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, bedingt durch eine deutlich verbesserte Penetration. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunkomplexfärbung in Heimmontage besteht darin, hochwertige Bilder des Standard-Zebrafischherzens zu erhalten. Um eine befeuchtete Kammer vorzubereiten und die Proben vor Licht zu schützen, wickeln Sie die Kammer und den Deckel einer leeren Pipettenspitzenbox mit Aluminiumfolie ein.Verhindern Sie, dass die Proben austrocknen, indem Sie einen Stapel nasser Papiertücher auf den Boden der Kammer legen, und stellen Sie eine kleine Mikroplatte als Halterung für Objektträger auf die Papiertücher. Verwenden Sie einen Bildstift, um Vertiefungen in Form von Kreisen oder Linien mit Abmessungen von etwa fünf mal fünf Millimetern auf die Oberfläche eines Objektträgers zu zeichnen. Lassen Sie die Objektträger trocknen.Legen Sie die Objektträger in die befeuchtete Kammer und geben Sie 50 µL Formaldehyd in jedes Loch. Um das embryonale Herz zu präparieren, betäuben Sie das Fischembryo in E3-Ei-Wasser, das 0,4 % Trica enthält, bis der Fisch alle Körperbewegungen eingestellt hat, aber der Herzschlag noch normal weitergeht. Etwa eine Minute.Überführen Sie die Embryonen in eine konkave Mulde. Platzieren Sie einen konkaven Objektträger auf dem Objekttisch eines Stereomikroskops, wobei entweder Dunkelfeld- oder DIC-ähnliches polarisiertes Licht verwendet wird. Stellen Sie das Mikroskoplicht so ein, dass das Herz deutlich sichtbar wird.Reinigen Sie anschließend zwei Insulinspritzen mit 75 % Ethanol. Danach trocknen Sie sie ab und erhöhen die Vergrößerung des Mikroskops, um auf das Herz zu fokussieren. Fixieren Sie dann ein Embryo mechanisch, indem Sie eine Nadelspitze in das Eigelb einführen, sodass sich die Milbengrenze nahe am Kopf befindet.Danach eine weitere Nadel in der Nähe des Herzbereichs einführen und das Herz schnell herausziehen. Falls das Herz nicht vollständig vom Embryo getrennt ist, das verbleibende verbindende Gewebe zwischen Herz und Dottersack durchtrennen. Das Herz bei geringerer Vergrößerung fokussieren.Stellen Sie eine 10-Mikroliter-Pipette auf ein Volumen von einem Mikroliter ein. Führen Sie die Pipettenspitze entweder dazu, die Herzprobe aufzusaugen oder das Herzpräparat zu berühren, sodass das isolierte Herz entweder innerhalb der Pipettenspitze oder an deren Oberfläche befestigt ist. Tauchen Sie die Pipettenspitze in die Formaldehydlösung auf vorbereiteten Objektträgern und drücken Sie den Pipettenkolben herunter, um das Herz in die Lösung freizusetzen.Wenn sich das Herz in Formaldehyd auf den Vertiefungsrutschen befindet, schließen Sie die Kammer und stellen Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Schüttler mit sanftem Schaukelbetrieb. Wischen Sie das Wasser von der Unterseite der Rutschen ab und platzieren Sie die Rutschen auf dem Objekttisch eines Stereomikroskops, um den Puffer auszutauschen. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Pipette, um das Formaldehyd vorsichtig von der Rutsche abzusaugen, wobei die Herzen ungestört bleiben. Geben Sie 50 Mikroliter PBST hinzu, um die Herzproben zu bedecken, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang in der befeuchteten Kammer.Spülen Sie die Herzen ein zweites Mal in PBST. Danach blockieren Sie die Herzprobe mit 10% Schafserum in PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie die Herzproben mit einer Verdünnung von 1:200 des primären Antikörpers gegen Beta-Catenin und F zwei in 10% Schafserum PBST für eine Stunde bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Herzproben dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBST bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Proben mit einer 1:1000 Verdünnung einer Alexa-Markierung, anti-Maus- und/oder anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in PBST für 30 Minuten. Waschen Sie die Proben erneut dreimal mit PBST, um die Proben abzubilden.Entfernen Sie das PBST und geben Sie einen Mikroliter Einbettmedium zu jedem hinzu. Schwenken Sie die Kammer mehrere Minuten lang, bis die Lösung klar wird. Bilden Sie das Fischherz mit einem Zeiss-Axio-Plan-2-Mikroskop ausgestattet mit einem Aome ab. In diesem Bild werden die Kerne und Zellmembranen von Zebrafisch-Kardiomyozyten aus einem Zebrafisch-Embryo 52 Stunden nach der Befruchtung mittels Antikörper gegen MEF2C bzw. Betain nachgewiesen.Durch die Einstellung des Objekttisches des zusammengesetzten Mikroskops können die Bilder der Herzproben auf dieselbe Ausrichtung angepasst werden, was die Beobachtung der äußeren und inneren Krümmung des Herzens ermöglicht. Anschließend können die Gesamtanzahl der Kardiomyozyten, die Zellgröße und die Rundheit gemessen werden. Hier wird die Sarkomerstruktur eines präparierten embryonalen Herzens mithilfe des Myosin-Antikörpers F 59 dargestellt. Das Myo-Filament-Netzwerk in einem gesamten embryonalen Herzenventrikel ist bei niedrigerer Vergrößerung deutlich sichtbar, während der streifige Streifen dicker Filamente bei höherer Vergrößerung erkennbar ist.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein immungefärbtes, präpariertes Ebro-Zebrafissherz untersucht, insbesondere wie man das Herz aus einem Zebrafisch vom Typ April präpariert und wie man mit dem Herzen während des Immunfärbeprozesses umgeht.

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Forschung

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Biology

Biologie

Eine klare, standardisierte Methode zur Präparation und Isolierung des Zebrafisch-Herzen an mehreren Entwicklungsstufen beschrieben sind. Annotation und Quantifizierung Techniken werden ebenfalls diskutiert.

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafisch stellt ein wertvolles Modell, um die Mechanismen von Herz-Regeneration bei Wirbeltieren zu untersuchen. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion eines Herzinfarktes bei erwachsenen Zebrafisch mit cryoinjury. Dieses Verfahren führt zu einer massiven Zelltod innerhalb von 20% der Ventrikelwand, ähnlich der in Säugetieren Infarkten beobachtet.

Induktion eines Myokardinfarktes in Adult Zebrafisch Mit Cryoinjury

Dieses Video beschreibt eine Technik zur Isolierung des Herzens von einem Zebrafisch in mehreren Entwicklungsstadien, um die kardiale Entwicklung, Reifung und Alterung zu untersuchen.

Herzdissektion: Eine Methode zur Beobachtung der Herzentwicklung von Zebrafischen

Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.

Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse

Die Verwendung von Zebrafischen für die Herz-Kreislauf-Forschung weitet sich auf die Forschung an erwachsenen Herzen aus. Für diese Anwendungen ist die schnelle und einfache Isolierung von Herzgewebe von entscheidender Bedeutung, um postmortale Veränderungen zu vermeiden und eine ausreichende Anzahl von Proben zu erhalten. Hier beschreiben wir eine schnelle und reproduzierbare Methode zum Präparieren von adulten Zebrafischherzen.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Mutationen, die zu angeborenen Herzfehlern führen, profitieren von der in vivo Untersuchung der Herzstruktur während der Entwicklung, aber hochauflösende Strukturstudien im embryonalen Herzen der Maus sind technisch anspruchsvoll. In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Immunfluoreszenz- und Bildanalysemethode vor, um Kardiomyozyten-spezifische Strukturen im sich entwickelnden Mausherz zu beurteilen.

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Hier stellen wir ein Protokoll zum fluoreszierenden Antikörper-vermittelten Nachweis von Proteinen in ganzen Präparaten von Zebrafischembryonen und Larven vor.

Ganzer Berg Immunhistochemie in Zebrafisch Embryonen und Larven

Dieses Protokoll verwendet einen Immunfluoreszenz-Assay, um PM2,5-induzierteDNA-Schäden in den sezierten Herzen von Zebrafischembryonen nachzuweisen.

Verwendung von Immunfluoreszenz zum Nachweis von PM2,5-induziertenDNA-Schäden in Zebrafisch-Embryoherzen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Diese Studie etabliert eine empfindliche, immunfluoreszenzbasierte Bildgebungsmethode zur Quantifizierung der globalen DNA-Methylierung in einzelnen embryonalen Herzen von Zebrafischen. Dieser Ansatz überwunde die Herausforderung begrenzten Gewebematerials und umging die Notwendigkeit der Bisulfit-Umwandlung.

Nachweis der globalen DNA-Methylierung in den Herzen von Zebrafischlarven

Lernen Sie eine schnelle Immunfärbemethode für dissezierte Zebrafisch-Embryonenherzen. Diese Technik ermöglicht hochauflösende Bildgebung zellulärer Strukturen bei deutlich reduzierter Bearbeitungszeit.

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