Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Kinetik der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand zu messen, wenn beide Moleküle an den Oberflächen der miteinander interagierenden Zellen verankert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die roten Blutkörperchen, die als Adhäsionssensoren fungieren, mit Liganden funktionalisiert und die rezeptorhaltigen Zellen vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird die Mikropipettenkammer zusammengesetzt und Adhäsionstests durchgeführt, um die Adhäsionsereignisse aufzuzeichnen.

Anschließend wird die Kurve der Adhäsionswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit von der Kontaktzeit der Zellen aufgetragen und mit dem Modell angepasst. Um die kinetischen Parameter abzuschätzen, werden Ergebnisse gewonnen, die die effektive zweidimensionale Bindungsaffinität und die Dissoziationsrate, die aus den Daten ermittelt wurden, zeigen. Woher stammt nun die Idee für diesen Assay?

Die Menschen untersuchen die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand. In der Regel werden Rupturkräfte gemessen, und genau das tun wir ebenfalls. Doch eines Tages fragten wir uns, ob wir nicht einfach das binäre Ergebnis messen könnten – null für keine Adhäsion und eins für Adhäsion – und daraus die kinetischen Messwerte anhand dieser Null-Eins-Messungen ableiten könnten, um den Mikropipettenfrequenz-Assay zu zeigen. Dr. Veronica Zana Zina, Wissenschaftlerin in meinem Labor, wird Ihnen das Experiment vorführen.

Rote Blutkörperchen, die aus Vollblut isoliert wurden, werden für den Adhäsionsfrequenztest biotinyliert. Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den isolierten roten Blutkörperchen, pipettieren Sie 10 Mikroliter Pellet der roten Blutkörperchen in mehrere Vials und geben Sie die entsprechende Menge PBS zu jedem Vial hinzu, um mehrere Konzentrationen der Biotinylierung der roten Blutkörperchen vorzubereiten. Fügen Sie danach 10 Mikroliter 0,1-molarem Boreacht-Puffer zu jedem Vial hinzu.

Dann eine berechnete Menge Biotin-Lösung zu jedem Gefäß hinzufügen und sofort verwirbeln. Jedes Röhrchen mit roten Blutkörperchen für mehrere Sekunden in ein 50-Milliliter-Konischgefäß geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren. Nach 30 Minuten EAS-45-Puffer zu jedem Röhrchen hinzufügen und zwei Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Den Waschschritt mit EAS-45-Puffer insgesamt dreimal durchführen, wobei der Schritt zweimal wiederholt wird.

Schließlich 100 Mikroliter EAS-45-Puffer zu jedem Röhrchen hinzufügen und bei vier Grad Celsius lagern, um die Liganden auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen zu funktionalisieren. Wie im vorherigen Schritt beschrieben, werden die roten Blutkörperchen 30 Minuten lang mit einer gesättigten Konzentration von Strep-TTR bei vier Grad Celsius inkubiert und anschließend dreimal zwei Minuten lang mit EAS-45-Puffer bei 2000 Umdrehungen pro Minute gewaschen. Danach entweder die roten Blutkörperchen direkt mit dem biotinylierten Liganden inkubieren oder die roten Blutkörperchen zuerst mit dem entsprechenden biotinylierten Erfassungsantikörper und anschließend mit den Liganden inkubieren. Der in diesem Video gezeigte Protokollschritt verwendet den biotinylierten Erfassungsantikörper.

Mikropipetten werden aus borosilikatglasernen Kapillarröhrchen mit niedrigem Schmelzpunkt hergestellt. Ziehen Sie zunächst die Kapillarröhrchen mit einem Mikropipettenzieher. Schneiden Sie anschließend mit einem Mikromanipulator und einer Mikroschmiede die Spitze der Mikropipette auf die gewünschte Öffnungsgröße zu.

Der erforderliche Durchmesser liegt gewöhnlich zwischen einem und fünf Mikrometern, abhängig von der Größe der Zellen, die in der Studie verwendet werden sollen. Um die Zellkammer vorzubereiten, verwenden Sie zwei Stücke Deckglas für Mikroskope, die auf die gewünschte Größe zugeschnitten sind, entfernen Sie den Staub von den Deckgläsern mit einer Druckluftspraydose, geben Sie das Medium für die Zellkammer hinzu und versiegeln Sie die Kammer von beiden Seiten mit Mineralöl, um einer Verdunstung des Mediums vorzubeugen. Dies würde die Osmolarität während des Experiments verändern.

Das in diesem Assay verwendete Mikropipettensystem besteht aus drei Subsystemen: einem Abbildungssystem zur Beobachtung, Aufzeichnung und Analyse der Bewegungen der in die Mikropipette aspirierten Zelle, einem Mikromanipulationssystem zur Auswahl von Zellen aus der Zellkammer und einem Drucksystem zum Aspirieren der Zellen in Mikropipetten. Das zentrale Element des Abbildungssystems ist ein inverses Mikroskop mit einem 100-fachen Öl-Immersionobjektiv. Objektivbilder werden von einer CCD-Kamera erfasst und an einen Videorekorder übermittelt.

Ein Video-Timer ist mit dem System gekoppelt, um die Zeit zu verfolgen. Nachdem die Mikropipette mit entionisiertem Wasser gefüllt wurde, platzieren Sie sie in der Halterung auf einem mechanischen Antrieb, der am Mikroskop befestigt ist. Die Mikropipette kann mit einem hydraulischen Dreiaxen-Mikromanipulator fein positioniert werden.

Einer der Mikropipettenhalter ist an einem computerprogrammierten piezoelektrischen Translator befestigt. Dies ermöglicht eine präzise Bewegung der Pipette im Adhäsionstestzyklus. Das Druckregelungssystem dient zur Steuerung des Unterdrucks.

Während des Experiments verbindet eine hydraulische Leitung den Mikropipettenhalter mit einem Flüssigkeitsreservoir. Ein feinmechanischer Positionierer ermöglicht eine präzise Einstellung der Höhe des Reservoirs. Nachdem die Kammer zusammengesetzt ist, werden Mikropipetten positioniert, die Zellen in die Kammer injiziert, um den Assay zu starten, die wechselwirkenden Zellen mittels der jeweiligen Pipetten aspiriert und der elektrische PSO-Translator verwendet, um die roten Blutkörperchen kontrolliert in und aus dem Kontakt mit dem Neutrophilen zu bewegen, wobei Fläche und Dauer des Kontakts gesteuert werden.

Ein Adhäsionsereignis wird beobachtet, wenn sich die rote Blutkörperchen beim Zellenseparationsvorgang verlängern; kein Adhäsionsereignis entspricht keiner Verlängerung der roten Blutkörperchen. Notieren Sie die beobachteten Adhäsionsereignisse, indem Sie für eine Adhäsion eine Eins oder für keine Adhäsion eine Null in einer Spalte einer Excel-Tabelle eintragen.

Zeichnen Sie die Adhärenzfrequenz in Abhängigkeit von der Kontaktzeit unter Verwendung von mindestens drei verschiedenen Zellpaaren für jede Kontaktzeit auf. Um einen Mittelwert und SEM als Kontrolle zu erhalten, nehmen Sie die Kurve der unspezifischen Bindung auf, indem Sie rote Blutkörperchen verwenden, die mit entsprechenden Liganden beschichtet sind, oder indem Sie die Liganden oder Rezeptoren mit spezifischen Funktionsblockern blockieren. Mithilfe monoklonaler Antikörper kann die spezifische Adhärenzfrequenz an jedem Zeitpunkt der Kontaktzeit berechnet werden, indem die unspezifische Adhärenzfrequenz subtrahiert wird.

Die Daten zur spezifischen Adhäsionsfrequenz in Abhängigkeit von der Kontaktzeit werden durch ein probabilistisches Modell angepasst, das eine bimolekulare Vorwärtsreaktion und eine unimolekulare Rückreaktion in einem einzigen Schritt zwischen einer einzigen Spezies von Rezeptoren und einer einzigen Spezies von Liganden beschreibt. In dieser Gleichung ist KA die 2D-Affinität. KA ist die 2D-Dissociationsrate.

MR und ML sind die jeweiligen Rezeptor- und Ligandendichten, und AC ist die Kontaktfläche. Die Kurvenanpassung besitzt zwei Parameter, ac, k, a, und Koff, da AC und KA zusammengefasst werden und kollektiv als effektive 2D-Affinität bezeichnet werden; das Produkt daraus mit der Ablösegeschwindigkeit ist die effektive 2D-Anlagerate: AC Kon = AC KA × Koff. Hier ist ein Beispiel zur Bestimmung des Integrins alpha L beta zwei gezeigt.

Oberflächendichte auf Neutrophilen. Neutrophile wurden zunächst mit einem Mikrogramm pro Milliliter E-Selectin-Ig inkubiert und anschließend mit sättigenden Konzentrationen eines mit Phycoerythrin konjugierten anti-humanen CD11a-Monoklonalen Antikörpers oder eines entsprechenden Maus-IgG als Kontrolle versetzt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurden die Proben gewaschen und mit einem Durchflusszytometer unter standardisierten Bedingungen gemessen.

Helle PE-Kalibrierperlen. Panel A zeigt Fluoreszenz-Histogramme von Kalibrierperlen zusammen mit denen von E-Selectin-IG-behandelten oder unbehandelten Zellen. Die spezifische CD11a-Monoklonalantikörper-Färbung ist durchgezogen dargestellt, und die entsprechende Isotypkontrollantikörper-Färbung ist gestrichelt dargestellt.

Abbildung B zeigt den Prozess der Dichtequantifizierung. Der Logarithmus zur Basis 10 wurde für die mittlere fluoreszierende Intensität jedes der vier Kügelchen berechnet. Kalibrier-Spitzenwert aus Abbildung A und für die chargenspezifischen PE-Moleküle pro Kügelchen.

Eine lineare Regression von log 10 PE-Molekülen pro Kügelchen gegen log 10 Fluoreszenz wurde für die erneut ausgewählten eingedrungenen Zellen aufgetragen. Log 10 fi beträgt 3,99, angegeben durch den blauen Vollkreis, und 2,23, angegeben durch den blauen offenen Kreis, für den spezifischen monoklonalen Antikörper bzw. den Kontrollantikörper. Als die lineare Gleichung für X gelöst wurde, wurde die Gesamtzahl der Alpha-L-Beta-2- oder Neutrophilen mit 9.587 berechnet.

Die Oberflächendichte wurde mit 43 Bindungsstellen pro Quadratmikrometer berechnet, unter Verwendung eines Neutrophilendurchmessers von 8,4 Mikrometern. Der nächste Graph zeigt die laufende Adhärenzfrequenz fi für spezifische Bindung nach einer Sekunde und zehn Sekunden. Die Kontaktzeiten wurden aus wiederholten Adhärenztestzyklen zwischen mit ICAM-1 beschichteten roten Blutkörperchen und humanen Neutrophilen, die das Integrin αLβ2 exprimieren, ermittelt.

Im Gegensatz dazu ist hier die Laufadhärenzfrequenz fi für unspezifische Bindung bei einer Kontaktzeit von einer Sekunde und zehn Sekunden dargestellt, gemessen in wiederholten Adhäsionstestzyklen zwischen mit humanem IgG beschichteten roten Blutkörperchen und humanen Neutrophilen, die das Integrin alpha L beta zwei exprimieren. Dieses letzte Diagramm veranschaulicht die Kinetik der Bindungswahrscheinlichkeiten von I A eins an das Neutrophilen-Integrin alpha L beta zwei; die für drei Zellpaare bei jeder Kontaktzeit gemessenen Werte wurden gemittelt und in Abhängigkeit von der Kontaktzeit aufgetragen, um unspezifische Bindung auszuschließen. Es wurden zwei verschiedene Bedingungen verwendet.

Eine rote Blutkörperchen, die mit dem anti-TFC-Erfassungsantikörper beschichtet und mit humanem IgG anstelle von ICAM inkubiert wurden, sowie zwei neutrophile Granulozyten, die an nicht mit dem Erfassungsantikörper beschichtete rote Blutkörperchen binden. Die unspezifische Bindung, aufgezeichnet als humanes IgG-Kontrollkurve, wurde verwendet, um eine spezifische Adhäsionswahrscheinlichkeitskurve zu erhalten. Unter Verwendung der zuvor gezeigten Gleichung zur Korrektur unspezifischer Bindung.

Die korrigierte Kurve der spezifischen Adhäsionswahrscheinlichkeit wurde mit der Modellanpassung gefittet. Die Kurve der spezifischen Adhäsionswahrscheinlichkeit ergab die effektive Bindungsaffinität. Ein CKA entspricht 1,4 mal 10 hoch minus vier Mikrometer hoch vier und koff entspricht 0,3 s hoch minus eins.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Kinetik der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand misst, wenn beide Moleküle an den Oberflächen der I-Interaktionszellen verankert sind. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die anfänglichen Tests so durchgeführt werden sollten, dass die Ligand-Dichte im Bereich liegt, bei dem die Adhäsionsfrequenz im mittleren Bereich liegt. Außerdem ist zu beachten, dass der Umgang mit Blut und bestimmten Reagenzien für spezifische Behandlungen, beispielsweise Natriumazid und DM, äußerst gefährlich sein kann. Daher sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, wie beispielsweise das sorgfältige Lesen der Sicherheitsdatenblätter der Reagenzien und das Tragen von Handschuhen während der Durchführung dieses Verfahrens.