Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Kinetik der Rezeptor-Liganden-Interaktion zu messen, wenn beide Moleküle auf den Oberflächen der interagierenden Zellen verankert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die roten Blutkörperchen, d.h. die Adhäsionssensoren mit Liganden, funktionalisiert und rezeptortragende Zellen vorbereitet werden. In einem zweiten Schritt wird die Mikropipettenkammer zusammengebaut und es werden Adhäsionstests durchgeführt, um die Adhäsionsereignisse zu erfassen.

Als Nächstes wird die Kurve der Adhäsionswahrscheinlichkeit im Vergleich zur Kontaktzeit der Zellen dargestellt und an das Modell angepasst. Um die kinetischen Parameter abzuschätzen, werden Ergebnisse erhalten, die die aus den Daten geschätzte zweidimensionale effektive Bindungsaffinität und Off-Rate zeigen. Woher nehmen wir also die Idee zu diesem Assay?

Menschen untersuchen die Interaktion zwischen Rezeptor und Bein. Meistens messen wir Bruchkräfte und wir machen dasselbe, aber eines Tages dachten wir, wir könnten einfach das binäre Ergebnis Null für keine Adhäsion und eins für Adhäsion messen und die Messung für die Kinetik aus diesen Null-Eins-Messungen ableiten, um den Mikrorohrfrequenz-Assay zu zeigen. Dr. Veronica Zana Zina, eine Forscherin meines Labors, wird Ihnen das Experiment zeigen.

Aus Vollblut isolierte rote Blutkörperchen werden für den Adhäsionsfrequenz-Assay biotinyliert. Um dieses Verfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie das Röhrchen mit den isolierten roten Blutkörperchen, aliquotieren Sie 10 Mikroliter Pellet der roten Blutkörperchen in jedes von mehreren Fläschchen und fügen Sie die entsprechende Menge PBS zu jedem Fläschchen hinzu, um mehrere Biotin-Hochtemperaturkonzentrationen der roten Blutkörperchen herzustellen. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter 0,1 molare Bohrung acht Puffer in jedes Fläschchen.

Geben Sie dann sofort eine berechnete Menge Biotinlösung in jedes Fläschchen und jeden Vortex. Legen Sie jedes Fläschchen mit roten Blutkörperchen einige Sekunden lang in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie es nach 30 Minuten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator, geben Sie EAS 45-Puffer in jedes Fläschchen und zentrifugieren Sie es zwei Minuten lang bei 2000 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie die Wäsche mit EAS 45 Puffer zweimal für insgesamt drei Wäschen.

Geben Sie schließlich 100 Mikroliter EAS 45-Puffer in jedes Fläschchen und lagern Sie es bei vier Grad Celsius, um die Liganden auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen zu funktionalisieren, indem Sie im vorherigen Schritt rote Blutkörperchen mit einer gesättigten Konzentration von Streptokokken TTR für 30 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren und dreimal mit EAS 45-Puffer für zwei Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute waschen. Danach werden die roten Blutkörperchen entweder direkt mit dem biotinylierten Liganden inkubiert oder die roten Blutkörperchen mit dem entsprechenden biotinylierten Fängerantikörper inkubiert, gefolgt von der Inkubation mit Liganden. Das in diesem Video gezeigte Protokoll verwendet den biotinylierten Fängerantikörper.

Mikropipetten werden unter Verwendung von Kapillarrohren aus Silikatglas mit dem Axtschmelzpunkt hergestellt. Verwenden Sie zunächst einen Mikropipettenzieher, um die Kapillarröhrchen zu ziehen. Verwenden Sie anschließend einen Mikromanipulator mit einer Mikroschmiede, um die Spitze der Mikropipette auf die gewünschte Öffnung zu schneiden.

Der erforderliche Durchmesser liegt in der Regel zwischen einem und fünf Mikrometern, abhängig von der Größe der Zellen, die in der Studie verwendet werden sollen. Zur Vorbereitung der Zellkammer verwenden Sie zwei Stücke Mikroskop-Deckglas, die auf die gewünschte Größe zugeschnitten sind, reinigen Sie den Staub von den Deckgläsern mit einem Luftstaubwedel, fügen Sie das Medium der Zellkammer hinzu und verschließen Sie die Kammer von beiden Seiten mit Mineralöl, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden. Dadurch ändert sich die Osmolarität während des Experiments.

Das in diesem Assay verwendete Mikropipettensystem besteht aus drei Subsystemen, einem bildgebenden Subsystem zum Beobachten, Aufzeichnen und Analysieren der Bewegungen der mit Mikropipetten aspirierten Zelle, einem Mikromanipulationssubsystem, um die Auswahl von Zellen aus der Zellkammer zu ermöglichen, und einem Drucksubsystem zum Aspirieren der Zellen in Mikropipetten. Das Herzstück des bildgebenden Subsystems ist ein inverses Mikroskop mit einer 100-fachen Ölimmersion. Objektive Bilder werden von einer Kamera eines Ladungskopplergeräts erfasst und an einen Videokassettenrekorder gesendet.

Ein Video-Timer ist an das System gekoppelt, um die Zeit im Auge zu behalten. Nachdem Sie die Mikropipette mit entionisiertem Wasser gefüllt haben, legen Sie sie in ihre Halterung auf einem mechanischen Antrieb, der am Mikroskop montiert ist. Die Mikropipette kann mit einem dreiachsigen hydraulischen Mikrom-Manipulator fein positioniert werden.

Einer der Mikropipettenhalter ist auf einem computerprogrammierten piezoelektrischen Übersetzer montiert. Dadurch kann die Pipette präzise und in einem Haftfestigkeitstestzyklus bewegt werden. Das Subsystem zur Druckregelung wird zur Steuerung der Saugleistung verwendet.

Während des Experiments verbindet eine Hydraulikleitung den Mikropipettenhalter mit einem Flüssigkeitsreservoir. Ein feinmechanischer Positionierer ermöglicht eine präzise Manipulation der Höhe des Behälters. Nachdem die Kammer zusammengebaut ist, werden Mikropipetten eingestellt, die Zellen in die Kammer injiziert, um den Assay zu starten, die interagierenden Zellen mit den jeweiligen Pipetten aspiriert und mit dem elektrischen PSO-Translator die roten Blutkörperchen mit kontrollierter Kontaktfläche und -zeit in den Kontakt mit den Neutrophilen hinein- und wieder herausgefahren.

Ein adianes Ereignis wird beobachtet, wenn sich die roten Blutkörperchen nach der Zelltrennung verlängern, ein Ereignis ohne Adhäsion entspricht keiner Elongation der roten Blutkörperchen. Zeichnen Sie die beobachteten Adhäsionsereignisse auf, indem Sie eins für Adhäsion oder Null für keine Adhäsion hinzufügen. In einer Spalte einer Excel-Tabelle.

Zeichnen Sie die Kurve zwischen Adhäsionshäufigkeit und Kontaktzeit auf, indem Sie für jede Kontaktzeit mindestens drei verschiedene Zellpaare verwenden. Um einen Mittelwert und SEM als Kontrolle zu erhalten, zeichnen Sie die unspezifische Bindungskurve auf, indem Sie rote Blutkörperchen verwenden, die mit einem relevanten Liganden beschichtet sind, und/oder die Liganden oder Rezeptoren durch ihre spezifische funktionelle Blockade blockieren. Bei monoklonalen Antikörpern kann die spezifische Adhäsionsfrequenz zu jedem Kontaktzeitpunkt durch Entfernen der unspezifischen Adhäsionsfrequenz berechnet werden.

Die Daten zur spezifischen Adhäsionshäufigkeit im Verhältnis zur Kontaktzeit werden durch ein probabilistisches Modell angepasst, das eine Vorwärts- und eine erste Ordnung zweiter Ordnung beschreibt. Umgekehrt die einstufige Wechselwirkung zwischen einer einzelnen Art von Rezeptoren und einer einzelnen Art von Liganden In dieser Gleichung ist KA die 2D-Affinität. KA ist die 2D-Off-Rate.

MR und ML sind die jeweiligen Rezeptor- und Ligandendichten und AC ist die Kontaktfläche. Die Kurvenanpassung hat zwei Parameter, ac, k, a und K aus, da AC und KA zusammengefasst und gemeinsam als effektive 2D-Affinität bezeichnet werden. Das Produkt mit der Aus-Rate ist die effektive 2D-Einschaltrate AC K auf gleich AC KA mal K aus. Hier ist ein Beispiel für die Bestimmung von Integrin alpha L beta zwei dargestellt.

Standortdichte auf Neutrophilen. Neutrophile wurden zuerst inkubiert, ein Mikrogramm pro Milliliter E-Selektin-IG und dann wurden gesättigte Konzentrationen von PE-konjugiertem Anti-Human-CD 11, einem monoklonalen Antikörper oder einem relevanten Maus-IgG-Antikörper als Kontrolle verabreicht. Nach 30 Minuten Inkubationszeit wurden die Proben gewaschen und auf einem Durchflusszytometer mit Standardmenge abgelesen.

Helle PE-Kalibrierperlen. Panel A zeigt Fluoreszenzhistogramme von Kalibrierkügelchen zusammen mit denen von E-Selektin-IG-behandelten oder unbehandelten Zellen. Die spezifische monoklonale Antikörperfärbung CD 11 A ist in durchgezogenen Kurven dargestellt und die relevante Isotyp-Match-Kontroll-Antikörperfärbung ist in gestrichelten Kurven dargestellt.

Panel B zeigt den Prozess der Dichtequantifizierung. Log 10 wurde für die mittlere Fluoreszenzintensität jeder von vier Kügelchen berechnet. Kalibrierungs-Peakwert von Panel A und für die chargenspezifischen PE-Moleküle pro Kugel.

Eine lineare Regression von log 10 PE-Molekülen pro Beads gegen log 10 Fluoreszenz wurde für reselect intrudierte Zellen aufgetragen. Log 10 fi ist gleich 3,99 mit dem blauen durchgezogenen Kreis und 2,23 mit dem blauen offenen Kreis für den spezifischen monoklonalen Antikörper bzw. den Kontrollantikörper. Als die lineare Gleichung für X gelöst wurde, wurde die Gesamtzahl der alpha L beta zwei oder Neutrophilen mit 9.587 berechnet.

Die Oberflächendichte wurde mit 43 Stellen pro Mikrometer zum Quadrat berechnet, wobei 8,4 Mikrometer als Neutrophilendurchmesser verwendet wurden. Das nächste Diagramm zeigt die laufende Adhäsionsfrequenz fi für eine spezifische Bindung bei einer Sekunde und 10 Sekunden. Die Kontaktzeiten, gemessen aus wiederholten Adhäsionstestzyklen zwischen ICAM one beschichteten roten Blutkörperchen und menschlichen Neutrophilen, die Integrin alpha L beta two exprimieren.

Im Gegensatz dazu ist hier die laufende Adhäsionsfrequenz fi für unspezifische Bindung bei einer Sekunde und zehn Sekunden Kontaktzeit gemessen, gemessen aus wiederholten Adion-Testzyklen zwischen humanen IgG-beschichteten roten Blutkörperchen und humanen Neutrophilen, die Integrin alpha L beta two exprimieren. Dieses abschließende Diagramm veranschaulicht die Kinetik von I, A, eins, Bindung an neutrophiles Integrin, alpha, L, beta, zwei Adhäsionswahrscheinlichkeiten, die für drei Zellpaare zu jeder Kontaktzeit gemessen wurden, wurden gemittelt und gegen die Kontaktzeit aufgetragen, um die unspezifische Bindung zu kontrollieren. Es wurden zwei unterschiedliche Bedingungen verwendet.

Ein rotes Blutkörperchen, das mit dem Anti-TFC-Capture-Antikörper beschichtet und mit humanem IgG anstelle von ICAM inkubiert wurde, ein IG und zwei Neutrophile, die an rote Blutkörperchen binden, die nicht mit dem Capture-Antikörper beschichtet sind. Die unspezifische Bindung, die als humane IgG-Kontrollkurve aufgezeichnet wurde, wurde verwendet, um eine spezifische Adhäsionswahrscheinlichkeitskurve zu erhalten. Verwendung der zuvor gezeigten Gleichung für die unspezifische Bindungskorrektur.

Die korrigierte Kurve der spezifischen Adhäsionswahrscheinlichkeit wurde mit der Modellanpassung angepasst. Die spezifische Adhäsionswahrscheinlichkeitskurve ergab die effektive Bindungsaffinität. Ein CKA ist gleich 1,4 mal 10 mal minus vier Mikrometer hoch und koff gleich 0,3 s minus eins.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Interaktionskinetik von Rezeptorliganden gemessen werden kann, wenn beide Moleküle auf den Oberflächen der I-Interaktionszellen verankert sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die ersten Trainingseinheiten zu erinnern, die Ligandenseitendichten reichen so ein, dass die Adhäsion der Frequenz im mittleren Bereich liegt, und denken Sie daran, dass die Arbeit mit Blut und einigen der Regionen für eine bestimmte Behandlung, z. B. Natrium und DM, äußerst gefährlich sein kann. Daher sind Vorsichtsmaßnahmen wie das sorgfältige Lesen des Sicherheitsdatenblatts der Reagenzien und das Tragen von Handschuhen bei der Durchführung dieses Verfahrens erforderlich.