Name: Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Erfahren Sie, wie man mit dem Adhäsionsfrequenz-Assay die Kinetik von Rezeptor-Ligand-Interaktionen an Zelloberflächen misst. Diese Methode nutzt funktionalisierte Erythrozyten als Sensoren zur Analyse von Bindungsaffinität und Off-Rate.

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Diese Studie wurde vom NIH gewährt R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 und R01GM096187 unterstützt.

1. RBCs Isolierung aus Vollblut <ol><li> Bereiten Sie EAS-45-Lösungen. Wägen Sie alle Zutaten aus Tabelle I und lösen sich in 100-200ml VE-Wasser. Wasser hinzu, bis 1000ml Lösung zu machen und pH-Wert auf 8,0. Filter und Aliquot von 50ml. Einfrieren bei -20 ° C für die Lagerung. </li></ol> Hinweis: Schritt 1.2 sollte durch einen geschulten Arzt, wie eine Krankenschwester durchgeführt werden, mit einem Institutional Review Board genehmigten Protokoll. <ol start="2"><li> Draw 3-5 ml Blut aus der V. mediana cubiti in eine 10ml Röhrchen mit EDTA und vorsichtig mischen das Blut mit EDTA sofort und gründlich zu vermeiden Blutgerinnung. </li><li> Prozess Blutprobe so schnell wie möglich. Alle folgenden Schritte außer Zentrifugation sollte unter der Haube zu halten Vorbereitung sterile durchgeführt werden. Übertragen Sie die Blut zu einem 50ml Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 10 ml kalt und steril Histopaque 1077 und Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Zweimal wiederholen. </li><li> Fügen Sie 10ml kalte und sterile PBS, Zentrifuge für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die 4-mal (insgesamt 5 mal). </li><li> Waschen mit sterilem EAS-45 (5min @ 1000rpm, 4 ° C) zweimal. In den letzten Waschen bewegen RBCs in eine neue sterile 15ml Tube. </li><li> Resuspendieren RBCs in10ml EAS-45. </li></ol> 2. RBCs Biotinylierung <ol><li> Nehmen Sie den Schlauch mit Erythrozyten aus Schritt 1. Entfernen Sie alle Überstand nach Zentrifugation für 5min @ 1000rpm, 4 ° C. Setzen Sie 10 &amp;mgr; l von RBC Pellet jeweils mehrere Ampullen und fügen entsprechende Menge PBS in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II zum Beispiel zur Herstellung von sechs verschiedenen RBCs Biotinylierung Konzentrationen). </li><li> Machen Sie frische Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 Verdünnungen nach Tabelle II. </li><li> Add 10 &amp;mgr; l 0,1 M Boratpuffer in jedes Fläschchen. </li><li> Hinzufügen des berechneten Menge an Biotin-Lösung in jedes Fläschchen (siehe Tabelle II als Beispiel) und Vortex sofort. </li><li> Platzieren Sie jede RBC Fläschchenin einem 50ml konischen Rohr und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie jede Flasche 3-mal mit 800μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm. </li><li> Add 100 &amp;mgr; von EAS-45 auf jeder Flasche und lagern bei 4 ° C. In jedem 1μl der endgültigen Lösung sollte nun ~ 1mln von RBC werden. </li></ol> 3. Funktionalisierung der Biotin-linked-Liganden * auf RBCs <ol><li> Bereiten 2mg/ml Streptavidin-Lösung nach den Anweisungen des Herstellers. Aliqouted Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden </li><li> Mix eine gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 2,7 (10 &amp;mgr; l) mit Streptavidin-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei 4 ° C. </li><li> 3 x waschen mit 500μl der EAS-45 für 2min @ 2000rpm. Add 15μl EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung. </li><li> Mix gleiche Menge an roten Blutkörperchen von Schritt 3,3 (10 &amp;mgr; l) mit 20μg/ml Ligand-Lösung, Vortex sofort und inkubieren am Rotator für 30min bei Raumtemperatur. </li><li> Wash zweimal mit 500μl der EAS-45 / 1% BSA für 2min @ 2000rpm. Fügen Sie 15μl von EAS-45 / 1% BSA für die Lagerung. </li></ol> * Wenn Ihr Protein hat keine Biotin Link können Sie eine der kommerziell erhältlichen Kits für Protein Biotinylierung (z. B. Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-Biotinylierung Kit) oder biotinylierten Fänger-Antikörper, als Zwischenschritt, wie gezeigt in dem Video. 4. Die Quantifizierung von Rezeptor und Ligand Dichten <ol><li> Inkubieren Ligand-beschichteten Erythrozyten aus Schritt 3, und in ein anderes Gefäß, Rezeptor-tragenden Zellen mit sättigenden Konzentrationen der jeweiligen mAbs für 30min bei Raumtemperatur. Inkubieren in separaten Fläschchen Zellen mit irrelevanten Isotyp-Antikörper für die Steuerung. Wenn der primäre Antikörper nicht fluoreszenzmarkierten sind, mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper inkubieren nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie die Proben in Schritt 4.1 von Flow cytometery zubereitet mit entsprechenden fluoreszierenden calibration Perlen. Berechnen Sie die Dichte wie in Abb. gezeigt. 1. </li></ol> 5. Vorbereitung für Mikropipette und Zellkammer <ol><li> Pull-Mikropipetten aus Kapillaren mit PN-30 Narishige 'Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller oder Sutter Instruments Micropipette Puller. </li><li> Verwenden Sie Mikromanipulator mit microforge an der Spitze des gezogenen Mikropipette auf die gewünschte Größe (in der Regel den erforderlichen Durchmesser reicht von 1-5 um je nach Größe der Zellen in der Studie verwendet werden) einstellen. </li><li> Bereiten Sie die Zelle Kammer, indem Mikroskop Deckglas auf die gewünschte Größe. Seal die Kammer mit Mineralöl von beiden Seiten bis mittlere Verdunstung zu vermeiden, um die Osmolarität während des Experiments ändern. </li><li> Fügen Sie die Rezeptor-und Ligand-tragenden Zellen in die Kammer. </li></ol> 6. Micropipette Haftung Frequenz-Test <ol><li> Saugen Sie die interagierenden Zellen, die durch jeweilige Pipetten und Einsatz computer-programmierte piezoelectr ic Übersetzer der RBC in und aus dem Kontakt-Laufwerk mit der anderen Zelle mit kontrolliertem Kontakt Raum und Zeit. Detect Haftung Ereignisse durch die Beobachtung RBC Dehnung auf Zellseparation. </li><li> Wiederholen Sie den Kontakt-Rückzug-Zyklus 50-100 mal für eine bestimmte Einwirkzeit. Notieren Sie sich die beobachteten Ereignisse Haftung durch den Zusatz "1" für die Adhäsion oder "0" für keine Haftung in eine Spalte der Excel-Tabelle. Sie können ein Aufnahmegerät, zB digitale Medien oder Videoband, für den mikroskopischen Bildern. </li><li> Notieren Sie sich die Haftung Frequenz gegenüber Berührung Zeit-Kurve mit mindestens drei verschiedenen Zell-Paare für jeden Kontakt Zeit, um einen Mittelwert und SEM erhalten. </li><li> Notieren Sie sich die unspezifische Bindung Kurve die Kontrolle über RBCs mit irrelevanten Liganden (zB BSA) und / oder Sperrung der Liganden oder Rezeptoren mit ihren spezifischen funktionellen Blockade mAbs beschichtet. Spezifische Haftung Frequenz bei jedem Kontakt Zeitpunkt kann durch Entfernen der unspezifischen Adhäsion Frequenz 1 berechnet werden. </li></ol>ove_title "&gt; 7. Datenanalyse <ol><li> Setzen Sie die spezifische Adhäsion Frequenz P ein Vergleich Kontaktzeit t Daten von einem probabilistischen Modell (Gleichung 1), dass ein zweiter Ordnung nach vorne und erster Ordnung umzukehren, Single-Step-Interaktion zwischen einem einzelnen Arten von Rezeptoren und einer einzigen Art von Liganden 1 beschreibt : <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 1"> wo K eine ist die 2D effektive Bindungsaffinität, k off ist die Off-Rate, sind m r und m l die jeweiligen Rezeptoren und Liganden Dichten in Schritt 4 gemessen und A c ist die Kontaktfläche. Die Kurve-fit hat zwei Parameter, A c K a und k off, wie A c und K a sind zusammengeworfen und als kollektiv als effektive 2D-Affinität. Sein Produkt mit dem off-Rate ist die effektive 2D on-rate: A c k on = A c K a x k off. Die spezifische Adhäsion Frequenz P a wird durch Subtraktion der unspezifischen Adhäsion Fraktion (P unspezifische) aus der Summe gemessen Haftung (P gemessen) 1,21 berechnet: <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 2"></li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Bestimmung der Integrin α L β 2 Website Dichte auf Neutrophilen. Neutrophile wurden zunächst mit 1μg/ml von E-Selektin-Ig für 10min inkubiert, um die experimentellen Bedingungen in Zahlen 3,4 oder ohne E-Selektin-Ig verwendet übereinstimmen, und dann mit sättigenden Konzentrationen (10μg/ml) von PE-konjugierten anti -Mensch-CD11a mAb (Clone HI111, siehe Tabelle der spezifischenReagenzien und Geräte) oder irrelevant Maus IgG1 für die Steuerung, gewaschen und sofort analysiert. Die Proben wurden auf BD LSR Durchflusszytometer mit Standard QuantiBRITE PE Kalibrierung Perlen zu lesen. Panel A zeigt Fluoreszenz-Histogramme der Kalibrierung Perlen (rosa) zusammen mit denen von E-Selektin-Ig behandelt wurden (blaue Farbe) oder unbehandelten Zellen (grüne Farbe). Spezifische CD11a mAb Färbung ist in durchgezogenen Kurven und irrelevant Isotyp-Kontroll-Antikörper-Färbung ist gestrichelt dargestellten Kurven gezeigt. Zellen, die mit E-Selektin-Ig (Präsenz in allen Waschschritte und in FACS-Puffer) behandelt wurden, keinen Einfluss auf die CD11a Dichte wie aus dem Vergleich mit unbehandelten Zellen gesehen. Panel B zeigt den Prozess der Dichte Quantifizierung. Log10 wurde für die mittlere Fluoreszenzintensität (FI) der einzelnen Spitzenwert von vier Kalibrierung bead Histogramme von Panel berechnet A (rosa Kreise) und für die viel-spezifischen PE-Moleküle pro Perle (vom Hersteller). Eine lineare Regression von Log10 PE-Moleküle pro Perle gegen Log10 fluoreszENCE wurde aufgezeichnet. Für E-Selektin behandelten Zellen der Log10 FI (y)-Werte gleich 3,99 (blue solid Kreis) und 2,23 (blue offener Kreis) für spezifische mAb und Kontroll-Antikörper, respectivly. Wir lösten das lineare Gleichung für x (Werte sind als grüne und blaue Kreise auf Panel B dargestellt) x = log10 PE / Zelle und als PE:. MAb-Verhältnis war 1:1, war die Gesamtzahl der α L β 2 auf Neutrophilen berechnet als 9587. Flächendichte berechnet wurde auf 43 Moleküle / um 2, mit 8.4μm wie die neutrophilen Durchmesser 22. Dichte von ICAM-1 wurde in ähnlicher Weise durch flow cytometery mit PE-Anti-Human-CD54 mAb, die 65 mol / &amp;mgr; m 2 erreicht gemessen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2 Micropipette System Schaltpläne. Unsere Mikropipette wurde im Haus montiert und besteht aus drei Teilsystemen: ein bildgebendes Subsystem, damit man beobachten, record und analysieren Bewegungen der Mikropipette-Saugmotor Zelle, eine Mikromanipulation Subsystem, damit man die Zellen aus der Zelle Kammer zu wählen, und ein Druck-Subsystem, damit man die Zellen in Mikropipetten absaugen. Das zentrale Stück der Imaging-Subsystem Mikroskop invertiert (Olympus IMT-2 IMT2) mit einem 100x Öl-Immersion 1,25 NA Objektiv. Das Bild wird auf einem Videorecorder über eine Belastung Coupled Device (CCD)-Kamera gesendet werden. Ein Video-Timer ist mit dem System gekoppelt, den Überblick über Zeit zu halten. Jede Mikropipette kann durch einen mechanischen Antrieb auf das Mikroskop angebracht und fein mit einem Drei-Achsen-hydraulischen Mikromanipulator positioniert manipuliert werden. Mechanische Manipulatoren aus Newport könnte auch verwendet werden. Einer der Mikropipette Inhaber auf einem piezoelektrischen Übersetzer montiert ist, wird der Fahrer, die von einem Computer LabView-Code (auf Anfrage) und das Signal übersetzt durch eine DAQ-Karte über einen Spannungs-Verstärker (hausgemacht), um den Piezo-Aktuator gesteuert. Dies ist einSorgt dafür, man die Pipette exakt und reproduzierbar zu bewegen in einer Adhäsion Testzyklus. Die Druckregelung Subsystem wird verwendet, um Saug während des Experiments zu kontrollieren. Ein hydraulischer Linie verbindet die Mikropipette Halter mit einem Flüssigkeitsbehälter. Eine feine mechanische Stellungsregler ermöglicht die Höhe des Behälters genau manipuliert werden. Mikropipetten werden mit Hilfe KIMAX Schmelzpunkt Borosilikatglas Kapillaren (mit einem Außendurchmesser von 1,0 ± 0,07 mm und einem Innendurchmesser von 0,7 ± 0,07 mm. Erstens, die Mikropipetten von Kapillaren gezogen werden mit PN-30 Narishige 'Magnetic Glas-Mikroelektrode Horizontal Puller (Sutter Instruments Micropipette Puller ist ein weiterer Puller Option). Zweitens Microforge System (erbaut im Haus) wird verwendet, um die Mikropipetten auf die gewünschte Größe Öffnung geschnitten. Handelsregister Modelle Microforge Systeme sind ebenfalls verfügbar. Um Schwingungen der Mikropipetten während des Experiments, das Mikroskop zu vermeidenopa, zusammen mit der Mikromanipulatoren, basiert auf einer Luftfederung Tisch gelegt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3 Running Haftung Frequenz F i für bestimmte (A) und unspezifische (B) Bindung an 1s (rot) und 10s (blau) Kontaktzeiten von wiederholten Haftung Testzyklen zwischen RBC mit ICAM-1 (A) oder Higg beschichtet gemessen (B ) mit humanen Neutrophilen Ausdruck Integrin α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), wobei i den Prüfzyklus Index, X i ist gleich "1" (Adhäsion) oder "0" (keine Haftung). F n (n = 50) wurde als beste Schätzung für die Haftung Wahrscheinlichkeit verwendet. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3519/3519fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4 Kinetik derICAM-1-Bindung an neutrophilen Integrin α L β 2 ( <img alt="Platz" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Platz"> ). Adhesion Wahrscheinlichkeit gemessen, wie in Abbildung 3 für drei Zellpaaren an jedem Kontaktpunkt Mal gezeigt wird gemittelt und aufgetragen gegen Kontaktzeit. Die Kammer Medium wurde HBSS mit 1mM jeder Ca 2 + und Mg 2 + und 1μg/ml dimerer E-Selektin-Ig zu regulieren α L β 2-Bindung. Zur Erfassung ICAM-1-Ig auf Erythrozyten, ein Zwischenschritt wurde hinzugefügt, um Erythrozyten mit 10μg/ml Fänger-Antikörper (biotinylierter Ziege-Anti-Human-Fc-Antikörper, eBioscience) nach dem Streptavidin Inkubationsschritt inkubieren. Zur Kontrolle unspezifischer Bindung zwei verschiedenen Bedingungen wurden verwendet: 1) RBCs beschichtet mit anti-human-Fc Fänger-Antikörper inkubiert und mit humanen IgG anstelle von ICAM-1-Ig (O) und 2) Neutrophile Bindung an Erythrozyten nicht mit der beschichteten Fänger-Antikörper (Δ). 10μg/ml IgG wurde dem Medium aufgenommen zu minimieren Bindung von E-Selektin-Ig in Lösung des Capture-Antikörper auf der Oberfläche RBC. Die unspezifische Bindung als menschliche IgG Regelkurve aufgenommen wurde verwendet, um eine spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve zu erhalten ( <img alt="Platz" src="/files/ftp_upload/3519/3519sq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Platz"> ) Mit Gl. 2. Fitting spezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeit Kurve mit Gl. 1 (durchgezogene Linie) wieder wirksam Bindungsaffinität A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 und k off = 0,3 s -1. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagens </th><th> MW (g / mol) </th><th> Konzentration (mM) </th><th> Menge (g) </th></tr><tr><td> Adenin </td><td> 135,13 </td><td> 2 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> D-Glucose (Dextrose) </td><td> 180,16 </td><td> 110 </td><td> 19,82 </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> 182,17 </td><td> 55 </td><td> 10,02 </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> 58,44 </td><td>50 </td><td> 2,92 </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic (Na HPO ) </td><td> 141,95 </td><td> 20 </td><td> 2,84 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 146,15 </td><td> 10 </td><td> 1,46 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. EAS-45-Puffer Vorbereitung (1L). <table border="1"><tbody><tr><td> 25 mg Biotin-XHS in 550 ul DMF </td><td> 0,1 M Biotin-Lösung </td></tr><tr><td> 1:10 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF </td><td> 0,01 M Biotin-Lösung </td></tr><tr><td> 1:100 Verdünnung von 0,1 Biotin w / DMF </td><td> 0,001 Biotin-Lösung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Vorbereitung der Biotin-Lösung. <table border="1"><tbody><tr><th> Biotin Endkonzentration (M) </th><th> 4 </th><th> 10 </th><th> 20 </th><th> 50 </th><th> 100 </th><th> 160 </th></tr><tr><td> RBCs Pellet Lager (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1x PBS (ul) </td><td> 179,2 </td><td> 178 </td><td> 176 </td><td> 179 </td><td> 178 </td><td> 176,8 </td></tr><tr><td> 0,1 M Boratpuffer (ul) </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0,01 M Biotin-Lösung (ul) </td><td></td><td></td><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3,2 </td></tr><tr><td> 0,001 Biotin-Lösung (ul) </td><td> 0,8 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Biotinylierung von RBC.

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<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
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<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
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<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um erfolgreich mit der Mikropipette Haftung Frequenz Assay man mehrere kritische Schritte in Betracht ziehen sollten. Stellen Sie zunächst sicher, um die spezifische Wechselwirkung für die Rezeptor-Ligand-System von Interesse aufnehmen. Unspezifische Kontrollmessungen (vgl. Abb.. 3, 4) gewährleisten die Spezifität. Idealerweise sollten unspezifische Adhäsion Wahrscheinlichkeiten unter 0,05 für jeden Kontakt Zeitdauern zu sein und einen signifikanten Unterschied zwischen der spezifischen und unspezifischen Haftung Wahrsc...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog # </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17-517Q </td><td> Verdünnen auf 1x mit VE-Wasser vor dem Gebrauch </td></tr><tr><td> Vacutainer EDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td> Erythrozyten isoliert </td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 10771 </td><td> Erythrozyten isoliert </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2786 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> D-Glucose (Dextrose) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 6360 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Sodium Phosphate, Dibasic (Na &amp; # x2082; HPO ₄) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S374 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G5763 </td><td> EAS-45 Vorbereitung </td></tr><tr><td> Biotin-X-NHS </td><td> Calbiochem </td><td> 203188 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Dimethylformamid (DMF) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 20673 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Boratpuffer (0,1 M) </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 11455-90 </td><td> RBCs Biotinylierung </td></tr><tr><td> Streptavidin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21125 </td><td> Ligand Funktionalisierung </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0336 </td><td> Ligand Funktionalisierung </td></tr><tr><td> Quantibrite PE Beads </td><td> BD Biosciences </td><td> 340495 </td><td> Dichte Quantifizierung </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Immunocytometry Systems </td><td> BD LSR II </td><td> Dichte quantification </td></tr><tr><td> Kapillarrohr 0,7-1.0mm x 30 &quot; </td><td> Kimble Glass Inc. </td><td> 46485-1 </td><td> Micropipette ziehen </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2629-1 </td><td> Kammeranordnung </td></tr><tr><td> Mikroskop Deckglas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12 bis 544-G </td><td> Kammeranordnung </td></tr><tr><td> PE α-human CD11a Clone HALLO 111 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0119-71 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> PE anti-human CD54 </td><td> eBioscience </td><td> 12-0549 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-PE </td><td> eBioscience </td><td> 12-4714 </td><td> Reagenz für Abb.1 </td></tr><tr><td> hydraulischen Mikromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MO-303 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> Mechanische Manipulator </td><td> Newport </td><td> 461-xyz-m, SM-13, DM-13 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> piezoelektrische Übersetzer </td><td> Physik Instrumente </td><td> P-840 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> Version 8.6 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> DAQ-Karte </td><td> National Instruments </td><td> USB-6008 </td><td> Micropipette System </td></tr><tr><td> Optische Tisch </td><td> Kinetics Systeme </td><td> 5200 Series </td><td> Micropipette System </td></tr></tbody></table>

adhesion frequency-assay für in situ kinetics analyse der cross-junktionaler molecular interactions an der zell-zell-schnittstelle

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Die Mikropipette Adhäsionsassay wurde 1998 entwickelt, um zweidimensionale (2D)-Rezeptor-Ligand-Bindung Kinetik 1 zu messen. Der Test verwendet eine menschliche rote Blutzellen (RBC) als Haftvermittler Sensor und präsentierenden Zelle für eine der wechselwirkenden Moleküle. Das Unternehmen beschäftigt Mikromanipulation der RBC in Kontakt mit einer anderen Zelle, dass die anderen interagieren Molekül drückt mit präzise kontrollierten Raum und Zeit, um Bindung zu ermöglichen bringen. Die Haftung Veranstaltung ist als RBC Dehnung beim Ziehen der beiden Zellen voneinander entdeckt. Durch die Steuerung der Dichte des Liganden auf der RBC Oberfläche immobilisiert, ist die Wahrscheinlichkeit der Adhäsion in Mid-Range zwischen 0 und 1 gehalten. Die Haftung Wahrscheinlichkeit ist von der Frequenz der Haftung Ereignisse in eine Folge von wiederholtem Kontakt Zyklen zwischen den beiden Zellen für eine bestimmte Einwirkzeit geschätzt. Durch Variation der Einwirkzeit erzeugt eine verbindliche Kurve. Der Einbau einer probabilistischen Modell für die Rezeptor-Ligand-Reaktionskinetik 1, um die BindungKurve gibt die 2D-Affinität und off-Rate. Der Test wurde validiert mit Wechselwirkungen von Fcy Rezeptoren mit IgG Fc 1-6, Selektine mit Glykokonjugat Liganden 6-9, Integrine mit Liganden 10-13, homotypical Cadherin binden 14, T-Zell-Rezeptor und Korezeptor mit Peptid-MHC-Komplexe 15 - 19. Die Methode wurde verwendet, um Vorschriften von 2D-Kinetik von biophysikalischen Faktoren, wie die Membran microtopology 5, Membrananker 2, molekulare Orientierung und Länge 6, Träger Steifigkeit 9, Krümmung 20 und Impingement Kraft 20, sowie biochemische Faktoren zu quantifizieren, wie Modulatoren des Zytoskeletts und Membranmikroumgebung wo die interagierende Moleküle befinden und die Oberfläche Organisation dieser Moleküle 15,17,19. Die Methode wurde auch t verwendeto Studie der gleichzeitigen Bindung von zwei Rezeptor-Ligand-Arten 3,4 und trimolekulare Interaktionen 19 mit einem modifizierten Modell 21. Der große Vorteil der Methode ist, dass es zu studieren von Rezeptoren in ihrer Muttersprache Membran-Umgebung ermöglicht. Die Ergebnisse könnten erheblich von denen unter Verwendung gereinigter Rezeptoren 17. Es ermöglicht auch Erforschung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen in einem Sub-Sekunden-Zeitskala mit zeitlicher Auflösung die weit über die typischen biochemischen Methoden. Zur Veranschaulichung der Mikropipette Haftung Frequenz-Methode zeigen wir, Kinetik Messung von ICAM 1 (ICAM-1) auf Erythrozyten Bindung an Integrin α L β 2 auf Neutrophilen mit dimeren E-Selektin in die Lösung α L β 2 aktivieren funktionalisiert.

Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

Der Mikropipetten-Adhäsionsassay wurde 1998 entwickelt, um die zweidimensionalen (2D) Rezeptor-Ligand-Bindungskinetiken zu messen1. Der Assay verwendet eine menschliche rote Blutzelle ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Kinetik der Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand zu messen, wenn beide Moleküle an den Oberflächen der miteinander interagierenden Zellen verankert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst die roten Blutkörperchen, die als Adhäsionssensoren fungieren, mit Liganden funktionalisiert und die rezeptorhaltigen Zellen vorbereitet werden. Im zweiten Schritt wird die Mikropipettenkammer zusammengesetzt und Adhäsionstests durchgeführt, um die Adhäsionsereignisse aufzuzeichnen.Anschließend wird die Kurve der Adhäsionswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit von der Kontaktzeit der Zellen aufgetragen und mit dem Modell angepasst. Um die kinetischen Parameter abzuschätzen, werden Ergebnisse gewonnen, die die effektive zweidimensionale Bindungsaffinität und die Dissoziationsrate, die aus den Daten ermittelt wurden, zeigen. Woher stammt nun die Idee für diesen Assay?Die Menschen untersuchen die Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Ligand. In der Regel werden Rupturkräfte gemessen, und genau das tun wir ebenfalls. Doch eines Tages fragten wir uns, ob wir nicht einfach das binäre Ergebnis messen könnten – null bei keiner Adhäsion

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In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Messung transzellulärer Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen durch den HEK-Zellaggregationsassay. In diesem Assay wird eine gleiche Anzahl von HEK-Zellen, die ein gewünschtes präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül exprimieren, und ein fluoreszierendes Protein mit HEK-Zellen gemischt, die ein postsynaptisches Zelladhäsionsmolekül und ein weiteres fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Wechselwirkung zwischen den...

Zellaggregationsassay zum Nachweis von Trans-Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen

Dieses Protokoll Bewertungen Elektro Zell-Substrat-Impedance Sensing, eine Methode zur Quantifizierung der Zellhaftung, Proliferation, Motilität und zellulären Antworten auf pharmakologische und toxische Stimuli erfassen und analysieren die Impedanzspektrum von adhärenten Zellen. Nachweis endothelialer Permeabilität und Bewertung der Zell-Zell-und Zell-Substrat-Kontakte sind hervorgehoben.

Elektro-Zell-Substrat-Impedance Sensing zur Quantifizierung der endothelialen Proliferation, Barrierefunktion und Beweglichkeit

Diese Präsentation demonstriert eine Methode, bei der die Elektroporation von adhärenten, kultivierten Zellen zur Untersuchung der interzellulären, junktionalen Kommunikation verwendet wird, während die Zellen auf einem Objektträger wachsen, der mit leitfähigem und transparentem Indium-Zinnoxid beschichtet ist.

Ein Funktionstest für Gap Junction-Prüfung; Elektroporation von adhärenten Zellen auf Indium-Zinn-Oxid

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.

Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Erfahren Sie, wie man mit dem Adhäsionsfrequenz-Assay die Kinetik von Rezeptor-Ligand-Interaktionen an Zelloberflächen misst. Diese Methode nutzt funktionalisierte Erythrozyten als Sensoren zur Analyse von Bindungsaffinität und Off-Rate.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle (Video) | JoVE Journal

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

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