Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

Dieses Experiment nutzt biophysikalische Techniken, um die Vernetzungskapazität des Tomaten-Cutins, eines schützenden Polymers, zu bewerten und den gezielten Abbau epikutikulärer und intrakutikulärer Wachse aus Fruchtcuticula zu überwachen. Die Isolierung der Cuticula aus der gesamten Frucht erfolgt durch enzymatische Behandlung der Tomatenhaut und der daran haftenden Zellwände. In einem zweiten Schritt wird eine Extraktion mit Ate eingesetzt, um die Fruchtcuticula vollständig zu entwachsen und so die molekulare Charakterisierung des isolierten Cutins zu erhalten.

Biopolyester wird mittels Festkörper-Kernspinresonanz analysiert. Die spektrale Analyse der Festkörper-NMR zeigt, dass es Unterschiede in den relativen Anteilen von sauerstoffhaltigen aliphatischen Gruppen, die zur Vernetzung befähigt sind, in Cutin aus Cuticula von Wildtyp- und gentechnisch veränderten Tomatenfrüchten gibt. Alternativ wird die gesamte Frucht mit Gummiarabikum überzogen und abgezogen, um epicuticuläre Wachse zu entfernen, und anschließend in Chloroform getaucht, um intracuticuläre Wachse aus der Fruchtcuticula zu entfernen.

Anschließend werden die teilweise entwachsten Kutikeln, die durch die gleiche enzymatische Behandlung wie die Tomatenhaut isoliert wurden, mittels Festkörper-NMR und Rasterkraftmikroskopie untersucht. Letztendlich wird die schrittweise Entfernung der epikutikulären und intrakutikulären Wachse sichtbar durch die Beobachtung eines kontinuierlich abnehmenden Wachspiks in den NMR-Spektren sowie durch Veränderungen im Oberflächenprofil der Fruchtkutikula, die mittels simultaner AFM-Bildgebung beobachtet werden. Oberirdische Organe von Pflanzen sind durch eine aus Wachsen und Polyestern bestehende Schutzschicht, die sogenannte Kutikula, geschützt. Wir stellen Protokolle vor, um die gezielte Entfernung von inneren und äußeren Wachsen aus den Fruchtkutikeln von Tomaten mithilfe der Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie und der Rasterkraftmikroskopie zu bewerten.

Diese Methoden können auch zur Beurteilung der Vernetzungskapazität von konstruierten kutikulären Materialien verwendet werden. Die Durchführung der Verfahren wird von drei Mitgliedern der Stark-Gruppe demonstriert: Dr. Ishish Chatterjee, der Doktorandin Shantani Sarkar und der ehemaligen Gymnasiastin Julia Tik. Eine weitere Demonstratorin ist Dr. Olivia Nisau, wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor unseres Kollegen aus dem Bereich Verfahrenstechnik, Dr. Alexander S. Um die enzymatische Isolierung der Tomatenhaut einzuleiten, geben Sie drei handelsübliche oder kultivierte Früchte in eine Schüssel, ziehen die Haut in großen Stücken ab und entsorgen das innere Perikarpgewebe.

Anschließend die Tomatenhäute mit entionisiertem Wasser waschen und sie unter Wasser in einem Becher aufbewahren, wobei die geschälten Tomatenhäute vollständig in einem gemäß der schriftlichen Anleitung zubereiteten Enzymcocktail eingetaucht werden. 24 Stunden bei 31 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Die Tomatenhäute mithilfe eines Büchnertrichters oder einer Küchensieb abtrennen und mit entionisiertem Wasser waschen.

Nachdem die Häute eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen getrocknet wurden, können die getrockneten Häute in einer beschrifteten und verschlossenen Flasche aufbewahrt werden. Für nachfolgende Entwachungsverfahren füllen Sie ein zentriertes Glas- oder Einwegtäfelchen etwa zur Hälfte mit der Tomaten-Cuticula-Probe, wobei Sie Pinzetten verwenden, um die Probe vorsichtig am Boden der Extraktionskolonne zu platzieren, die für die Feststoffextraktion verwendet wird. Setzen Sie den Aufbau der Soxhlet-Apparatur unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel gemäß dem schriftlichen Protokoll fort.

Überwachen Sie den Prozess eine Stunde lang und stellen Sie die Variac-Spannung so ein, dass sich im Reservoir etwa ein Tropfen pro Sekunde ansammelt und ein Siphonvorgang innerhalb der Socken des Apparats stattfindet. Wenn der Thimble gefüllt ist, nach einer 12-stündigen Extraktion, lassen Sie das Gerät abkühlen, senken Sie den Heizmantel ab und entfernen Sie den Extraktor und das Reservoir als eine Einheit, um das Lösungsmittel nach der Extraktion zu entsorgen. Kippen Sie die Säule, um das Abzapfen in das darunterliegende Kolben zu ermöglichen.

Heben Sie mit einer Pinzette den Extraktionskolbenknopf bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne an. Lassen Sie überschüssiges Lösungsmittel ablaufen und stellen Sie den Knopf auf eine saubere Oberfläche. Trennen Sie das Kolbenfläschchen ab und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Lösungsmittelbehälter.

Wiederholen Sie den Extraktionsvorgang für aufeinanderfolgende Lösungsmittel mit stetig abnehmender Polarität, wie Chloroform und Taxan, jeweils zwölf Stunden lang. Sobald die getrocknete Tomatenprobenprobe vollständig trocken ist, messen Sie die Masse und lagern Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubglas, das mit Parafilm versiegelt ist. Um die Probe für die NMR vorzubereiten, geben Sie vier bis sechs Milligramm vollständig entwachste Tomatenhaut, bekannt als Cutin, in einen 1,6-Millimeter-Fast-MAS-Zirkonia-Rotor unter Verwendung des vom Hersteller mitgelieferten Packwerkzeugs.

Nachdem die obere Kappe installiert wurde, sollte die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Tintenstift markiert werden, um die Drehzahlmessung zu ermöglichen. Die anfängliche Einrichtung des Festkörper-NMR-Experiments ist ein technisch anspruchsvoller Prozess, der unter der Leitung erfahrenen Personals erfolgen muss. Beginnen Sie damit, die Magnetfeldhomogenität einzustellen und die experimentellen Parameter mithilfe einer Modellverbindung gemäß dem schriftlichen Protokoll zu optimieren. Fügen Sie den sauberen und befüllten Rotor in die Sonde ein und platzieren Sie anschließend die Sonde in das Magnetfeld.

Erhöhen Sie die Spindeldrehzahl schrittweise auf bis zu 10 Kilohertz, um eine gute Probeneinpackung und die Fähigkeit des Rotors, stabil zu laufen, mit einer Abweichung von weniger als 20 Hertz zu überprüfen. Stellen Sie die Abstimm- und Anpassungskondensatoren der Sonde iterativ so ein, dass die Leistungsreflexion sowohl bei der Protonen- als auch bei der Kohlenstoff-13-NMR-Frequenz minimal ist. Stellen Sie die Versuchstemperatur auf 25 Grad Celsius ein.

Starten Sie das voroptimierte CPMA-Experiment, das der unter der Hartman-Han-Proton-Kohlenstoff-Anpassungsbedingung bei einer Spinfrequenz von 10 Kilohertz bestimmten Bedingung entspricht. Nach dem Erfassen von 4.096 Transienten konditionieren Sie das Spektrum mit exponentieller Linienverbreiterung von 50 bis 100 Hertz und führen eine Fourier-Transformation durch, um ein NMR-Spektrum der Signalamplitude in Abhängigkeit von der chemischen Abschirmung in Teilen pro Million zu erzeugen. Beziehen Sie die Kohlenstoff-13-chemischen Verschiebungen wie im Text beschrieben.

Erhöhen Sie die Rotordrehfrequenz auf 15 Kilohertz und wiederholen Sie die C-P-M-A-S-Messung, die der Hartman-Hahn-Anpassungsbedingung entspricht, die bei der Analyse der chemischen Verschiebung in Abhängigkeit von der Ladderdrehfrequenz des C-P-M-A-S-Kohlenstoffs bestimmt wurde. Die 13C-NMR-Spektren identifizierten die vorherrschenden funktionellen Gruppen in der vollständig entwachsenen DW-Tomaten-Cuticula: langkettige PHA, oxygenierte PHA, mehrfach gebundene und aromatische Verbindungen sowie Kohlenstoffausbeuten. Die oxygenierten Almo spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung kovalenter Bindungen zwischen den monomeren Einheiten des Cutin-Biopolymeren und tragen somit zur molekularen Architektur der Cutin-Matrix bei.

Unterschiede in den relativen Peakflächen, die im Spektralbereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass das mutierte Cutin im Vergleich zum Wildtyp-Apin einen relativ hohen Anteil an vernetzenden CHO-Struktureinheiten aufweist. Um eine gezielte Isolierung epicuticularer und intracuticularer Wachse zu beginnen.

Waschen Sie eine zweite Portion ganze Tomaten mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit Papiertüchern und Kim-Tüchern ab und legen Sie sie stielabwärts auf ein Stück Aluminiumfolie. Bestreichen Sie die ganzen Tomaten von oben nach unten mit einer 120 %igen wässrigen Gummiarabikumlösung.

Lassen Sie das Gummiarabikum eine Stunde lang auf der Fruchthaut trocknen, wodurch sich ein dünner Film bildet. Entfernen Sie diesen Film mit einer Pinzette, vermeiden Sie jedoch, die Tomatenhaut zu durchstechen. Eine weitere Behandlung des Films gemäß der im Text beschriebenen Vorgehensweise ergibt das epikutikuläre Wachs.

Die Tomaten bleiben physisch intakt. Tauchen Sie sie zweimal für zwei Minuten in Chloroform. Bei Raumtemperatur kann das intracuticuläre Wachs nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen werden, indem man die Tomaten schält und sie anschließend enzymatisch mit Cellulase und Pectinase sowie Puffer aus Natriumacetat behandelt, um Cellulose bzw. Pektin zu entfernen.

Mithilfe einer Säure-Extraktion kann anschließend, wie zuvor beschrieben, eine vollständige Entwachung der Tomaten durchgeführt werden. Die C-P-M-A-S-Experimente können mit natürlichen und teilweise entwachsenen Fruchthautproben wie im Text beschrieben wiederholt werden. Der Aufbau des Atomkraftmikroskops ist ein komplexer Prozess, der am besten unter anfänglicher Anleitung erfahrenen technischen Personals erfolgt. Eine Kraftmikroskopie beginnt damit, dass man das Rasterkraftmikroskop, abgekürzt SPM, einschaltet und sicherstellt, dass der Modus-Wahlschalter des Mikroskops auf den Kontakt-Atomkraftmikroskopie-Modus gestellt ist.

Heben Sie als Nächstes den SPM-Kopf manuell an, indem Sie die beiden vom Benutzer verstellbaren vorderen Knöpfe drehen. Lösen Sie den a FM-Spitzenhalter vom SPM-Kopf, indem Sie die Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes drehen. Entfernen Sie mit einer Pinzette den vorhandenen a FM-Konsolarm von seinem Halter.

Danach vorsichtig einen neuen Cantilever mit Siliziumnitridspitze aus der Verpackung nehmen und anstelle des alten Cantilevers einbauen. Mit einem Lichtmikroskop überprüfen, ob der neu installierte FM-Cantilever nicht beschädigt ist. Die Tomatenhautprobe mit doppelseitigem Klebeband an einem Probenhalter befestigen.

Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob die Cuticula-Probe flach und glatt bleibt. Nachdem Sie die Probe auf dem Puck platziert haben, setzen Sie die an den Puck gebundene Tomaten-Cuticula-Probe auf den magnetischen Bereich an der Oberseite des SPM-Scanners. Drehen Sie die Knöpfe so, dass die vorderen beiden manuellen Schrauben des Scanners hoch genug eingestellt sind, um die Zerstörung der AFM-Spitze zu vermeiden.

Wenn der Spitzenhalter in den SPM-Kopf eingesetzt wird, stellen Sie die motorisierte Hinterschraube ungefähr auf dieselbe Höhe wie die beiden vorderen Schrauben ein. Setzen Sie den Spitzenhalter erneut in den SPM-Kopf ein und befestigen Sie ihn, indem Sie die hintere Klemmschraube des Kopfes festziehen. Nachdem der Laser eingeschaltet wurde, richten Sie den Laserpunkt mit den mittleren und rechten Justierknöpfen für den Laser an der oberen Seite des Kopfes auf dem FM-Kantilever aus.

Überwachen Sie den reflektierten Laserstrahl auf einem Stück Papier, um den Laserpunkt exakt am Ende eines FM-Karäusels zu positionieren. Stellen Sie die Position des Laserpunkts so ein, dass das maximale Summensignal erreicht wird. Regeln Sie die Position des reflektierten Laserpunkts auf dem Photodetektor, indem Sie die Position des beweglichen Spiegels horizontal und vertikal justieren, um sicherzustellen, dass das einfallende Licht gleichmäßig von den vier Quadranten empfangen wird.

Der Detektor senkt eine FM-Spitze ab, indem die manuell bedienbaren vorderen Schrauben und die motorisierte hintere Schraube des SPM-Scanners zurückgefahren werden. Überwachen Sie visuell die Annäherung der FM-Spitze an die Probenoberfläche mit einem invertierten Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sich alle drei Schrauben auf derselben Höhe befinden.

Um Artefakte durch die Abbildung einer gekippten Probe zu vermeiden, führen Sie die Spitze an die Probe heran, ohne jedoch so nahe zu kommen, dass sie die Probenoberfläche berührt oder durchbricht. Das von dem A FM-Kanalhebel reflektierte Laserlicht wird über einen beweglichen Spiegel auf einen lichtempfindlichen Detektor gelenkt, um den Kontakt-A FM-Modus mit einer Siliziumnitrid-A FM-Sonde zu ermöglichen. Stellen Sie die Ausgangssignalspannung auf minus zwei Volt bei einem Sollwert von null Volt ein und justieren Sie das Differenzsignal durch Verstellen der Spiegelposition auf null Volt.

Verwenden Sie die Nano-Scope-Software. Klicken Sie auf das Mikroskop-Symbol und wählen Sie das entsprechende Profil aus. Stellen Sie mithilfe des Scan-Steuerungsfelds die Scan-Geschwindigkeit und die Scan-Größe ein.

Lassen Sie die A-FM-Spitze durch Klicken auf das „Spitze einfahren“-Symbol mit der Probenoberfläche in Kontakt treten. Durch die Steuerung der motorisierten Rückstellschraube der SPM-Basis senkt das Programm nun die Spitze, bis sie mit der Probenoberfläche in Kontakt kommt. Der Abtastvorgang startet automatisch, sobald die Spitze erfolgreich eingekoppelt wurde.

Überwachen Sie den Scanvorgang mithilfe der Bild- und Bereichsmodi der Software und passen Sie die Parameter schrittweise an, um die höchstmögliche Auflösung der Bilder gemäß dem schriftlichen Protokoll zu erreichen. Beginnen Sie beispielsweise mit einem großen Z-Achsen-Datenskalenwert. Reduzieren Sie dann den Z-Datenskalenwert sorgfältig, um den besten Kontrast der Oberflächenmerkmale im Bild zu erzielen.

Nehmen Sie das Bild auf, um die Datendatei zu speichern. Verarbeiten Sie die Daten mithilfe von Glättungsfunktionen, um Bildartefakte aufgrund von vertikalem Scandrift, Bildwölbungen und vertikalen Versätzen zwischen den Scanzeilen zu entfernen. Berechnen Sie abschließend die durchschnittliche Rauheit des Kohlenstoffs.

Die 13C-CP-MAS-NMR-Spektren zeigten eine kontinuierlich abnehmende Wachspitze bei 31 Teilen pro Million, was auf die schrittweise Entfernung von epikutikulären und intrakutikulären Wachsen aus dem Kutikula-Wachs-Komposit hinweist, wobei die grundlegende chemische Architektur des Cutin-Biopolymers erhalten bleibt. Eine Analyse mittels KFM (Kraftmikroskopie) zeigte Oberflächenunregelmäßigkeiten infolge der stufenweisen Extraktion epikutikulärer und intrakutikulärer Wachse aus der Fruchtkutikula, was auf Veränderungen in der Organisation des kutikulären Verbunds hindeutet. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann die schrittweise Entfernung von epikutikulären und intrakutikulären Wachsen aus den Tomatenfruchtkutikeln innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.

Bei der Festphasenextraktion zur vollständigen Extraktion der Fruchtkutikula ist es wichtig, nach Verwendung des Kontaktmoduls ein Panel von Lösungsmitteln mit unterschiedlicher Polarität einzusetzen. Ein FM-Protokoll ist hier dargestellt. Weitere FM-Experimente können zur Messung der Oberflächenelastizität der Kutikula verwendet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man systematisch Bestandteile aus dem Cutin-WAX-Verbund isoliert und die molekulare Charakterisierung sowie eine schnelle Oberflächenuntersuchung der Cuticula-Materialien mittels Festkörper-MR bzw. FM durchführt. Die in diesem Video veranschaulichten Techniken ermöglichen es Forschern der Pflanzenbiologie, die molekulare Zusammensetzung und supramolekulare Architektur natürlicher und technisch veränderter Pflanzengewebe zu bestimmen.