Name: Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Isolierung und biophysikalischen Untersuchung der Tomatenfruchtcuticula mit Festkörper-NMR und Rasterkraftmikroskopie. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Wachszusammensetzung und Vernetzungskapazität.

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Diese Arbeit wurde vom US National Science Foundation Zuschüsse # MCB-0741914 und MCB-0843627 unterstützt; weitere infrastrukturelle Unterstützung wurde am City College von New York vom National Institutes of Health 2 G12 RR03060-26 aus dem National Center for Research Resources zur Verfügung gestellt. Wir bedanken uns für das JKC Rose Gruppe in der Cornell University Pflanzenbiologie Abteilung für die Bereitstellung von M82 (Wildtyp) und CM15 (Mutante) Tomate Nagelhaut. Wir danken Dr. Spyros Monastiriotis aus dem CCNY Chemical Engineering Gruppe von Prof. Alexander Couzis für seine großzügige Hilfe bei den AFM-Experimente. Wir danken Frau Lauren Gohara für grafische Gestaltung unterstützt.

1. Enzymatische Isolierung von Tomato Schuppenschicht 5 <ol><li> Setzen Sie mehrere kommerzielle oder kultivierten Tomaten in eine Schüssel geben. Ziehen Sie die Haut von den Früchten in großen Teilen; entsorgen Sie den inneren Fruchtwand Gewebe. Waschen Sie die Tomaten-Skins mit VE-Wasser und bewahren sie unter Wasser in einem Becher. </li><li> Herstellen einer 50 mM pH 4,0 Natriumacetatpuffer (bei ​​31 ° C), indem 1,22 g Natriumacetat-Trihydrat (M r. 136,08 g / mol) und 2,34 ml Eisessig (17,485 M) in einem Becherglas, Zugabe von 200 ml VE-Wasser, und dann den pH-Wert bis 4,0 bei 31 ° C Vorbereiten einer Mischung, die 4 ml Pektinase (EC 3.2.1.15; 10 U ml -1 TCI America), 0,2 g Cellulase (EC 232.734.4; 1,3 Einheiten / mg Feststoff, Sigma Aldrich) und 13 mg NaN 3, und fügen Sie dann 196 ml Natriumacetat-Puffer auf die Enzym-Mischung zu 200 ml des fertigen Enzym-Cocktail zu erhalten. 5 vollständig einzutauchen den geschälten Tomaten Haut in der Enzym-Cocktail und inkubierenbei 31 ° C für 24 Stunden unter ständigem Schütteln (G24 Environmental Incubator Shaker, New Brunswick Scientific Co.). </li><li> Sammeln Sie die Tomatenhäuten mit einem Küchensieb oder Büchner-Trichter und waschen Sie sie mit VE-Wasser. Danach legen Sie sie in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur für eine Stunde. Schützen wir die getrockneten Tomaten Skins in einer verschlossenen Flasche etikettiert und für die anschließende Entparaffinierung Verfahren. </li></ol> 2. Ausgiebige Entwachsen durch Soxhlet-Extraktion 6 <ol><li> Die Ausrüstung für die abschließende Entparaffinierung verwendet besteht aus einer Wärmequelle (Heizmantel und Variac Controller), Rundkolben für eine Lösungsmittel-Reservoir, Soxhlet, Sinter-oder Einweg-Glas Fingerhut Extraktionshülse, Antiprellvorrichtung Chips und einem Kondensator (siehe Abb. 1). Beachten Sie, dass der schmale Siphon Arm (Teile 6 und 7 in Abb. 1) sehr empfindlich und anfällig für Brüche ist, der vorsichtig behandelt werden. </li><li> Setzen 0,5-1 g Tomate Haut (erhalten inSchritt 1.) in einem Mörser und mahlen die Probe zu einem groben Pulver mit einem Stößel, es sei denn die Proben für AFM-Messungen (Abschnitt 5) verwendet werden sollen. Füllen Sie ein Sinterglas-oder Einweg-Fingerhut etwa auf halber Strecke mit der Probe und mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig Platz an der Basis der Extraktionskolonne. </li><li> Dann wird der Kühler und wickeln ihn in Alufolie. Erhitzen Methanol-Lösungsmittel (ACS-Qualität) in Gegenwart von einigen Antiprellsensor Chips bis zum Kochen unter Rückfluss gekocht und leicht an den Wänden des Kolbens. Decken Sie die Lösungsmittel-Reservoir sowohl mit Glaswolle und Alufolie. Überprüfen Sie den Prozess für eine Stunde, tritt Einstellung der Variac Spannung, so dass das Reservoir sammelt etwa einem Tropfen pro Sekunde und Absaugen im Soxhlet-Apparat, wenn der Fingerhut voll ist. </li><li> Fahren Sie mit der Extraktion für 12 h, dann senken Sie den Heizmantel und lassen Sie das Gerät abkühlen. Entfernen der Haube und dem Reservoir als eine einzige Einheit, um das Lösungsmittel zu entsorgen. Verwenden Sie tweezeRS zu erhöhen Fingerhut bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne, abtropfen überschüssige Lösemittel aus, und platzieren Sie den Fingerhut auf einer sauberen Fläche. Kippen Sie die Extraktionskolonne zu ermöglichen Siphon in den Kolben unten. Ziehen Sie den Kolben und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Abfallbehälter Lösungsmittel Behälter. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für aufeinanderfolgende Lösungsmittel von immer mehr abnahm Polarität, zB Chloroform und Hexan für 12 h in jedem Fall. </li><li> Lassen Sie die Tomaten Cutin Probe im Inneren der Fingerhut, entweder durch Blasen eines Stickstoffgasstrom darüber oder indem man ihn in einem Vakuumofen bei Raumtemperatur trocknen. Schließlich messen die Masse der trockenen Probe und bewahren Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubdeckel-Glas mit Parafilm verschlossen. </li></ol> 3. Selektive Isolierung von epikutikulären und Intracuticular Wachse 3,4 <ol><li> Zuerst waschen ganze Tomaten (eine separate Charge von Tomaten von den in 1 beschrieben.) Mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit papER Handtücher und Kimwipes und legen sie stammen nach unten auf ein Stück Alufolie. </li><li> Malen Sie die ganze Tomaten mit 120% (w / w, Massenverhältnis) Gummiarabikum wässrigen Lösung in einer Top-Down-Mode und damit etwa eine Stunde für die Gummi Arabicum, um auf den Früchten die Haut trocknen, so dass ein dünner Film. Ziehen Sie diese Folie mit einer Pinzette vorsichtig ab, ohne Durchstechen der Haut Tomate. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. </li><li> Fügen Sie die Filme auf Fläschchen mit 1:1 (v / v) Chloroform-Wasser zugeben und 3 Minuten. Nach kräftigem Schütteln und Phasentrennung Pipette aus der Chloroform-Fraktionen und verdunsten sie in separaten Fläschchen aufgedeckt, so dass epikutikulären Wachs. Die Tomaten bleiben körperlich unversehrt. Man taucht sie in Chloroform für zwei Minuten bei Raumtemperatur und sammelt das intracuticular Wachs nach Verdampfen des Lösungsmittels. Nun, schälen Sie die Tomaten und behandeln sie enzymatisch (mit Cellulase und Pektinase in Natriumacetatpuffer) zu Cellulose und Pektin zu entfernen, bzw. (wie beschrieben in <li> Wenn gewünscht, führen erschöpfend Entparaffinierung auf diesen enzymatisch isolierte Kutikeln durch Soxhlet-Extraktion (siehe Schritt 2), mit drei Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität (Methanol, Chloroform, bzw. Hexan). </li></li></ol> 4. Molekulare Charakterisierung von Tomatenfrucht Cutin durch Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning Solid-State Nuclear Magnetic Resonance (CPMAS Festkörper-NMR) 6 <ol><li> Platz 4-6 mg voll entwachste Tomate Nagelhaut (Zuschaltungen) in einem 1,6 mm Zirkonoxid fastMAS Rotor mit der vom Anbieter gelieferten Verpackung Werkzeug. (Entweder Boden entwachste Tomate Nagelhaut oder sehr kleine Stücke von teilweise entwachst Nagelhaut geeignet sind.) Stellen Sie sicher, dass die Probe gleichmäßig ist gepackt, aber nicht zu fest, im Rotor. Nach dem Anlegen der oberen Kappe, malen die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Filzstift-Tinten auf Messungen der Spin-Rate zu erleichtern. </li><li> Passen Sie die Shim des NMR-Spektrometers für minimale spektrale Linienbreite auf halber Höhe einRunde Kalibrierung des Protons (1 H) und Kohlenstoff (13 C) 90 ° Impulsbreiten mit einem Standard-Verbindung, wie Adamantan. </li><li> Mit Glycin oder Glutamin als Modell-Verbindungen, erhalten maximale Signalintensität durch die Optimierung aller Parameter (Hartmann-Hahn-Matching Leistungsstufen, 1 H - 13 C Kontaktzeit, heteronuklearen 1 H-Entkopplung Stärke) der Kreuzpolarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) Experiment. Für Spektren bei einer 1 H-Frequenz von 600 MHz erworben empfohlenen Bedingungen sind 10 kHz oder 15 kHz dreht Frequenz, eine 3-Sekunden Verzögerung zwischen den Aufnahmen und SPINAL heteronuklearen Protonenentkopplung 7 bei einer magnetischen Feldstärke entspricht einer Frequenz von 185 kHz. </li><li> Legen Sie die Cutin gepackten Rotor in die Sonde. Legen Sie dann die Sonde in den Magneten. Erhöhen Sie die Schleuderdrehzahl bis zu 10 kHz allmählich auf Probe für eine gute Verpackung und Rotor Stabilität zu überprüfen. Überprüfen Sie die Endspinnverfahren Stabilität des Rotors innerhalb± 20 Hz. </li><li> Passen Sie den Tuning-und Matching-Kapazitäten der Sonde iterativ zu minimalen Leistung Reflexion sowohl 1 H und 13 C-NMR-Frequenzen zu erreichen. Stellen Sie den experimentellen Temperatur auf 25 ° C (oder Raumtemperatur). </li><li> Starten Sie den voroptimierte CPMAS Experiment entsprechend der Hartmann-Hahn-Matching Zustand am 10 kHz Spinnen Frequenz bestimmt. </li><li> Erwerben 4096 Transienten, Bedingung ist das Spektrum mit exponentiellen (Lorentz) Linienverbreiterung von 50-100 Hz, und führen Sie eine Fourier-Transformation, eine NMR-Spektrum von Signalintensität vs chemischen Abschirmung (ppm) zu generieren. </li><li> Verweis der 13 C-chemischen Verschiebungen von außen mit Adamantan Satz bei 38,4 ppm (-CH 2 - Gruppe) 8 als Standard. </li><li> Erhöhen der Rotorspinnmaschine Frequenz 15 kHz und wiederholen Sie die CPMAS (Schritte von 4,6 bis 4,8) entsprechend der Hartmann-Hahn-Anpassungsbedingung an diesem letzteren dreht Frequenz bestimmt. </li><li> Repebei den Experimenten CPMAS (Schritte von 4,1 bis 4,9) mit natürlichen (wachsartige) und teilweise entwachste Obst Nagelhaut Proben. </li></ol> 5. Probing the Tomato Cuticle Oberfläche mit einem Rasterkraftmikroskop (Digital Instruments Nanoscope IIIa; Verfahren variiert leicht unter den Mikroskopen) 6 <ol><li> Schalten Sie den Rastersondenmikroskop (SPM) (Abb. 2) und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop-Modus-Schalter, um den Kontakt Atomic Force Microscopy (AFM)-Modus eingestellt ist. </li><li> Manuelles erhöhen SPM Kopf durch Drehen seiner zwei frei einstellbaren vorderen Knöpfe. Nehmen Sie das AFM tipholder aus dem SPM Kopf durch Drehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um die vorhandene AFM-Cantilever von der tipholder zu entfernen, dann schnappen Sie sich einen neuen sorgfältig Siliziumnitrid Cantilever (AFM) aus der Verpackung, und installieren Sie sie in die Stelle der alten Ausleger. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die neu installierte AFM-Cantilever nicht zerbrochen ist. </li><li> Bringen the Tomaten Cuticula Probe (ein Abschnitt teilweise entwachst Tomaten Cuticula ~ 10 mm × 10 mm) auf eine Scheibe aus Edelstahl (Probe Puck) mit doppelseitigem Klebeband. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop zu überprüfen, ob die Cuticula Oberfläche eben und glatt nach der Platzierung der Probe auf den Puck bleibt. </li><li> Setzen Sie den Puck mit der Tomate Nagelhaut Probe auf die magnetische Region an der Spitze des SPM-Scanner. </li><li> Stellen Sie die beiden vorderen Schrauben manuelle Einstellung des Scanners hohen indem Sie die Knöpfe, stellen Sie den Motor wieder Stellschraube auf etwa dem gleichen Niveau wie die anderen beiden vorderen Schrauben. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben gesetzt sind hoch genug, um nicht zu unterbrechen die AFM-Spitze beim Aufsetzen des tipholder in das SPM Kopf. </li><li> Setzen Sie die tipholder in das SPM Kopf und befestigen Sie ihn durch Anziehen der Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes. </li><li> Nach dem Einschalten des Lasers, richten Sie den Laserpunkt auf der AFM-Cantilever über die zentrale (y) und rechts (x) Laser-Einstellknöpfe auf der Oberseite des Kopfes.Überwachen des reflektierten Laserstrahls auf ein Blatt Papier, um den Laserpunkt genau am Ende des Kraftsensors positionieren. </li><li> Die Position des beweglichen Spiegels iterativ unter Verwendung der Photodetektor Einstellknöpfe auf den maximalen Signalpegel (SUM-Signal) zu erreichen, damit sichergestellt wird, dass der reflektierte Laserstrahl wird gleichmäßig durch die vier Quadranten der Photodetektor empfangen. </li><li> Senken Sie die AFM-Spitze durch Zurückziehen der manuellen Einstellung vorderen Schrauben und den motorisierten zurück Stellschraube des SPM Scanner, optisch überwacht das Vorgehen der AFM-Spitze in Richtung der Probenoberfläche mit einem inversen Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass alle drei Schrauben auf dem gleichen Niveau sind, um Artefakte aus Abbildung eines gekippten Probe zu vermeiden. Bringen Sie die Spitze an die Probe, aber nicht so nahe, dass die Spitze berührt oder durchbricht der Probenoberfläche. </li><li> An dieser Stelle reflektiert das Laserlicht aus der AFM-Cantilever wird abprallen den beweglichen Spiegel auf den Photodetektor. Für die Kontakt-AFM-Modus mit einem Silikoncon-Nitrid-AFM-Spitze, Stellen Sie das Ausgangssignal (Vertical Deflection) Spannung bis -2 V für eine 0 V Sollwert und der DIFF-Signal (vertikal / horizontal Unterschied) auf 0 V durch Einstellen der Position des Spiegels. </li><li> Mit dem Nanoscope Software, auf dem Mikroskop-Symbol klicken und wählen Sie das entsprechende Profil (Kontakt Modus AFM). </li><li> Mit der "Scan-Steuerungen-Einstellungen", stellen Sie die Abtastrate und die Scan-Format z. B. 10 Mikron Scan-Format und 2 Hz Abtastrate. </li><li> Lassen Sie die AFM-Spitze zur Probenoberfläche durch Klicken auf die Spitze eingreifen-Symbol zu engagieren. Durch die Steuerung der motorisierten hintere Schraube der SPM-Basis, wird das Programm jetzt zu senken, bis sie die Spitze der Probenoberfläche einrastet. Der Scan-Vorgang beginnt automatisch, sobald die Spitze erfolgreich engagiert hat. </li><li> Überwachen Sie den Scan-Vorgang mit den beiden Bild-Modi und Umfang der Software, Anpassung der Parameter wie Sollwert, integralen Verstärkung, Proportionalverstärkung, Scan-Format, Abtastrate, Linien und Muster / Linie iterativ, um die höchste zu erreichenauflösende Bilder. Starten Sie den Scanvorgang mit einem großen Sortiment z-Achse (Daten-Skala); dann vorsichtig reduzieren die Daten Skalenwert zu den besten Kontrast von Oberflächenstrukturen auf das Bild zu beobachten. Minimieren des Auftretens von weißen Bereichen in dem gescannten Bild, so dass die Höhe der Oberflächenmerkmale die verfügbare Z-Achse Bereich überschreitet anzuzeigen. </li><li> Nehmen Sie das Bild, um die Daten-Datei zu speichern, dann bearbeiten Sie die Daten mit Abflachung Funktionen zur Bild-Artefakte aufgrund der vertikalen (Z)-Scanner Drift-, Bild-Bögen und vertikalen Versatz zwischen Scan-Linien zu entfernen; 9 Schließlich berechnen die durchschnittliche Rauheit. Nach dem Speichern der Daten, schieben Sie der AFM-Spitze durch die Umkehr der Wirkung des Computer-gesteuerten Motor Schraube, die verwendet werden, um ihm aufzunehmen. Die Bildverarbeitung kann im Offline-Modus Bildanalyse und / oder durchgeführt werden, über einen anderen Computer. </li><li> Verwenden Sie die vorderen Unterseite grau Metall-Knöpfe des Düsenstock um die x-und y-Positionen der Scan-Bereich zu ändern, dann wiederholen Sie die Messung an fünf Standorten Probegen zu prüfen, Reproduzierbarkeit und ersetzt den AFM-Cantilever, wenn die Bildqualität verschlechtert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Chemische Verschiebung Analyse der CPMAS 13 C-NMR-Spektren (Abb. 3) identifiziert die wichtigsten funktionellen Gruppen in der erschöpfend entwachste Tomate Kutikula (Cutin). Die wichtigsten Kohlenstoff-Einheiten in der Cutin Biopolyester wurde festgestellt, dass langkettige Aliphaten (0-45 ppm), mit Sauerstoff angereichert Aliphaten (45 bis 110 ppm), mehrfach verklebt und Aromaten (110-160 ppm) und Carbonyle (160 bis 220 sein ppm). Die mit Sauerstoff angereicherten Alkylgruppen (CHO + CH 2 O) spielen eine wichtige Rolle bei der Festlegung kovalente Verbindungen zwischen den monomeren Einheiten der Cutin Biopolymer, wodurch die molekulare Architektur des Cutin Matrix. Unterschiede in der relativen Peak-Flächen im spektralen Bereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet nahe, dass die Mutante Cutin eine relativ große Menge der Querverbindung bildenden CHO structura hat l-Einheiten im Vergleich zu den Wildtyp-Cutin; sorgfältige quantitative Messungen durch direkte Polarisation (DPMAS) NMR-Methoden 5 unterstützen diese Folgerung (Daten nicht gezeigt). CPMAS 13 C-NMR-Spektren zeigten auch eine schrittweise abnehmenden Wachs-Peak bei 31 ppm (Abb. 4), welche die sequenzielle Entfernung von epi-und intracuticular Wachse aus der Cutin-Wachs-Verbund unter Beibehaltung der wichtigsten chemischen Architektur der Cutin Biopolymer. Parallel AFM-Bild-Analyse (Abb. 5) ergab, Unregelmäßigkeiten der Oberfläche durch die schrittweise Gewinnung von epi-und intracuticular Wachse aus der Frucht Nagelhaut, was bedeutet, Veränderungen in der Organisation der Kutikula der Montage. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg"> . Abbildung 1 Soxhlet-Apparat (Bild Quelle: Wikipedia). "/&gt; Abbildung 2. A) Rastersondenmikroskop. B) SPM Kopf (in Anlehnung an die AFM-Trainingshandbuch von Digital Instruments zur Verfügung gestellt). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg"> Abbildung 3. 150 MHz CPMAS 13 C-NMR-Spektren von erschöpfend entwachst roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut (Zuschaltungen) von Wildtyp-(M82) und Mutante (CM15) zeigen Resonanzen mit chemischen Verschiebungen entsprechend den funktionellen Gruppen eines vernetzten Hydroxyfettsäure Polyestermasse und auch einige mehrfach gebundenen Einheiten. Alle Spektren wurden mit einer 10 kHz-Frequenz Spinnen erworben. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg"> Abbildung 4. 150 MHz 13 CCPMAS NMR-Spektren von kommerziellen roten reifen Tomaten Obst Nagelhaut zeigen Veränderungen der Zusammensetzung auf sequenzielle Entfernung epikutikulären intracuticular und Wachse von Gummi Arabicum mechanische Extraktion und einer two-Minuten-Chloroform-Dip, beziehungsweise. Alle Spektren wurden mit einer 15 kHz-Frequenz Spinnen erworben. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg"> Abbildung 5. AFM-Aufnahmen und Rauheit Schätzungen für die teilweise entwachst kommerzielle Tomate Schuppenschicht in Abbildung 4 nach der stufenweise Abbau der epikutikulären (links) und intracuticular (rechts) Wachse beschrieben.

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<li>Last, J. A., Russell, P., Nealey, P. F., Murphy, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Applications+of+Atomic+Force+Microscopy+to+Vision+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The Applications of Atomic Force Microscopy to Vision Science.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6083-6094 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hierin beschriebenen Protokollen für detaillierte molekulare und mikroskaligen Charakterisierung eines komplexen hartnäckigen Pflanzenmaterial zu ermöglichen, ohne dass destruktive chemischen Abbau. Um die Vermischung der Cutin Biopolyester mit verschiedenen Lipide (Wachse), die die Organisationsstruktur der Kutikula der Montage, 10 haben wir durchgeführt und überwacht werden Verfahren zur selektiven Entfernung von epikutikulären intracuticular und Wachse aus der heterogenen Mischung kutikularen kontrollieren zu untersuchen. Solid-State-13 C-NMR wurde zur Gewinnung von Wachs molekularen Komponenten zu messen, und Rasterkraftmikroskopie diente dazu, die gleichzeitige Veränderungen in der Oberflächenrauheit zu untersuchen. 6,11 Um die Vernetzung der Fähigkeiten Zuschaltungen aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen vergleichen Mutant Tomatenfrüchten wurde Solid-State-13 C-NMR auch genutzt, um die relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten zu schätzen. Eine Reihe von Design-Merkmals dieses Protokoll zeichnen. Als das Wachs Materialien umfassen eine Vielzahl von Lipiden, die Frucht Behandlung Kutikula mit einer Reihe von Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Polaritäten ist wichtig, abschließend Entparaffinieren zu erreichen. Darüber hinaus können Entwachsen von 8 Stunden bis 24 Stunden, je nach der Art der Cuticula Proben variieren. Um epikutikulärer Wachse konsequent Auszug aus dem intakten Frucht Kutikula, ist es zwingend notwendig, um die Klebstoffbeschichtung gleichmäßig auf der Oberfläche. Solid-State-CPMAS 13 C NMR-12 ist eine schnelle qualitative Methode zur Identifizierung verschiedener struktureller Komponenten des sehr heterogenen und unlöslichen pflanzlichen Biopolymeren unter Wahrung ihrer Muttersprache physikalischen Eigenschaften; 13 traditionelle Lösungs-NMR können auch verwendet werden, um die extrahierten Wachsmischungen zu charakterisieren. Wenn quantitative Abschätzung der funktionellen Gruppen ist für den intakten Pflanze Polymere, 5 High-Fidelity-Direkt-Polarisation Rotation im magischen Winkel (D gewünschtenPMAS) 13 C-NMR 5,14 ist als ergänzendes Verfahren verwendet werden. Genaue Quantifizierung der funktionellen Gruppen erfordert eine sorgfältige Optimierung der recycle mal, Anregungspuls Längen, und die Stärke der heteronuklearen Entkopplung. Der 15 heteronucleare Entkopplung für ein 1 H Feldstärke im Bereich von 50 kHz bis 185 kHz kann mit Hilfe des TPPM 16 oder eingestellt werden SPINAL 7 Methoden. Zusätzlich zu diesen Parametern, hängt die Empfindlichkeit der Messungen CPMAS auf dem Spin-Lock-Zeit und Hartmann-Hahn-Anpassungszustand. 15 In anstelle von herkömmlichen CPMAS, kann eine abgeschrägte Amplitude CP (RAMP-CP)-Technik implementiert werden, um das Kreuz zu maximieren -Polarisationseffizienz durch Variieren der Amplitude linear 1 H (~ 20-50%) oder tangential, während die Amplitude der Feldstärke 13 C konstant während der Spin-Lock-Periode (oder umgekehrt). 17,18 Durchführung der Messungen an CPMAS mindestens zwei verschiedene Rotor-Spinnerei Frequenzen ist zwingend notwendig, um Rotationsseitenbanden von den wichtigsten spektralen Spitzen zu unterscheiden. Concurrent AFM-Messungen im Kontakt-Modus durchgeführt, ermöglichen die direkte Bildgebung der Kutikula Oberflächenbeschaffenheit mit hohen Scan-Geschwindigkeiten und eine hohe Auflösung, 19 zum Beispiel während der sequentiellen Entfernung der wachsartigen Bestandteile. Betriebssystem AFM im Tapping (berührungslos)-Modus kann als Alternative zur Charakterisierung von Oberflächen von empfindlichen &quot;weichen&quot; pflanzlichen Materialien verwendet werden, vermeiden mögliche Schäden durch seitliche (Scher-) Kräfte und Kratzen der Probenoberfläche. 5,20 In beiden Fällen , der Aufnahme von mehreren Bildern von der gleichen Stelle auf der Oberfläche dient dazu, jede Oberfläche Schäden durch &quot;Probe-Oberflächen-Wechselwirkungen&quot; im AFM-Messungen identifizieren. 6,21 Für eine optimale Reproduzierbarkeit, sollte AFM-Sonden mit Federkonstanten für weiche Oberflächen kutikularen sein verwendet, und die Konstanz der Temperatur und Luftfeuchtigkeit sollten beibehalten werden. 6,15,20 </sbis&gt; Während der Festkörper-NMR ein molekulares Profil Ensemble-Mittelwert (bulk) Eigenschaften in Tomaten-Frucht Nagelhaut bietet, bietet atomic force Bildgebung eine ergänzende nicht-invasive Sonde 22,23 für die Verfolgung der Oberflächentopographie dieser exquisit komplexen makromolekularen Anordnungen. 1,2

<table><tbody><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pektinase</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15; 10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;, im Kühlschrank lagern</td></tr><tr><td>Cellulase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4; 1,3 Einheiten/mg, im Kühlschrank lagern</td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Extrem gefährlich</td></tr><tr><td>Inkubator/Schüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Modell Nr. G24</td><td>Herstellernr. M1036-000G</td></tr><tr><td>Vakuumofen</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>Variac-Regler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinterglas-Thiel (85 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Extraktions-Thiel (80 mm/25 mm)</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>Glaswolle</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>Papiertücher</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim-Tücher</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Gummiarabikum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1,6-mm-fastMAS-Zirkonia-Rotor</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR-Spektrometer</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>Standard-Bohrungsmagnet</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>Modellverbindung für CPMAS</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>Modellverbindung für CPMAS</td></tr><tr><td>Adamantan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>Zur Kalibrierung des 90&amp;#x00B0;-Impulses in der NMR</td></tr><tr><td>Multimodales Rasterkraftmikroskop (Nanoscope IIIA)</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope-Software</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>Version 5.30r3sr3 (2005)</td></tr><tr><td>AFM-Sonde (nichtleitende Siliziumnitridspitze)</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>Modell NP-20</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Puck</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obstmesser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B&amp;#252;chner-Trichter</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und biophysikalische untersuchung der cuticula

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

Die Nagelhaut, eine hydrophobe Schutzschicht auf den oberirdischen Teilen von Landpflanzen, Funktionen als vielseitiger Schutzwall um verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren und regelt auch die Wassermenge aus der äußeren Umgebung. 1 A Biopolyester (Cutin) und langkettigen Fettsäuren ( Wachse) bilden den wichtigsten strukturellen Rahmen der Kutikula, die funktionelle Integrität der Kutikula ist abhängig von der äußeren &#39;epikutikulären&#39; Schicht als auch die Mischung, bestehend aus dem Biopolymer und Cutin &#39;intracuticular&#39; Wachse 2 Im Folgenden stellen wir ein umfassendes Protokoll zu beschreiben. Wachse erschöpfend Auszug aus kommerziellen Tomate (Solanum lycopersicum) Obst oder Nagelhaut zu epikutikulären und intracuticular Wachse sequenziell und selektiv zu entfernen, aus der Kutikula Composite. Verfahren nach Jetter und Schäffer (2001) wurde zum schrittweisen Extraktion epikutikulärer und intracuticular Wachse aus der Frucht Cuticula ausgebildet. 3,4 Bei dieser AnwendungProzess der sequentiellen Wachs entfernen, Solid-State-Kreuz-Polarisation Magic-Angle-Spinning (CPMAS) 13 C-NMR-Spektroskopie wurde parallel mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) verwendet und bietet auf molekularer Ebene strukturelle Profile der Schüttgüter durch Informationen über die ergänzt die mikro-Topographie und Rauheit der Oberflächen Kutikula. Um die Vernetzung der Fähigkeiten entwachste Nagelhaut aus kultivierten Wildtyp-und Single-Gen-Mutante Tomatenfrüchten auszuwerten, wurde MAS 13 C-NMR verwendet, um die relativen Anteile von Sauerstoff aliphatische (CHO und CH 2 O) chemischen Einheiten zu vergleichen. Ausführliche Entparaffinieren durch schrittweise Soxhlet-Extraktion mit einer Reihe von Lösungsmitteln von unterschiedlicher Polarität bietet ein wirksames Mittel zur Wachs-Einheiten auf der hydrophoben Eigenschaften der aliphatischen und aromatischen Bestandteilen-Isolat, unter Beibehaltung der chemischen Struktur des Cutin Biopolyester. Die mechanische Gewinnung von epikutikulärer Wachse und Selective Entfernung von intracuticular Wachse, wenn sie von komplementären physikalischen Methoden überwacht, bietet eine beispiellose Mittel, um die Kutikula Anordnung zu untersuchen: Dieser Ansatz zeigt die supramolekulare Organisation und strukturelle Integration verschiedener Arten von Wachsen, die Architektur des Cutin-Wachsmatrix, und die chemische Zusammensetzung der einzelnen Bestandteile. Darüber hinaus enthüllt Solid-State-13 C-NMR Unterschiede in den relativen Zahlen von CHO und CH 2 O chemischen Einheiten für Wildtyp und Mutante roten reifen Tomaten Früchte. Die NMR-Techniken bieten außergewöhnliche Werkzeuge zur Fingerabdruck die molekulare Struktur der Kutikula Materialien, die unlöslichen, amorphen und chemisch heterogen sind. Als nicht-invasive-selektive Oberfläche bildgebendes Verfahren, AFM liefert ein effektives und direktes Mittel, um die strukturelle Organisation der Kutikula der Montage auf der nm-Längenskala um zu sondieren.

Oberirdischen Pflanzenteile werden durch die Kutikula, einem supramolekularen Biopolyester-Wachs Montage geschützt. Wir präsentieren Protokolle, um die selektive Entfernung von epi-und intracuticular Wachsen aus Tomatenfrucht Nagelhaut auf molekularer und Micro-Bereich durch Festkörper-NMR-und Rasterkraftmikroskopie, bzw. zu überwachen und die Vernetzung von technischen Kapazität kutikularen Biopolyester beurteilen.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

Die Kutikula, eine hydrophobe Schutzschicht auf den oberirdischen Teilen landlebender Pflanzen, fungiert als vielseitige Verteidigungsbarriere gegen verschiedene biotische und ...

Dieses Experiment nutzt biophysikalische Techniken, um die Vernetzungskapazität des Tomaten-Cutins, eines schützenden Polymers, zu bewerten und den gezielten Abbau epikutikulärer und intrakutikulärer Wachse aus Fruchtcuticula zu überwachen. Die Isolierung der Cuticula aus der gesamten Frucht erfolgt durch enzymatische Behandlung der Tomatenhaut und der daran haftenden Zellwände. In einem zweiten Schritt wird eine Extraktion mit Ate eingesetzt, um die Fruchtcuticula vollständig zu entwachsen und so die molekulare Charakterisierung des isolierten Cutins zu erhalten.Biopolyester wird mittels Festkörper-Kernspinresonanz analysiert. Die spektrale Analyse der Festkörper-NMR zeigt, dass es Unterschiede in den relativen Anteilen von sauerstoffhaltigen aliphatischen Gruppen, die zur Vernetzung befähigt sind, in Cutin aus Cuticula von Wildtyp- und gentechnisch veränderten Tomatenfrüchten gibt. Alternativ wird die gesamte Frucht mit Gummiarabikum überzogen und abgezogen, um epicuticuläre Wachse zu entfernen, und anschließend in Chloroform getaucht, um intracuticuläre Wachse aus der Fruchtcuticula zu entfernen.Anschließend werden die teilweise entwachsten Kutikeln, die durch die gleiche enzymatische Behandlung wie die Tomatenhaut isoliert wurden, mittels Festkörper-NMR und Rasterkraftmikroskopie untersucht. Letztendlich wird die schrittweise Entfernung der epikutikulären und intrakutikulären Wachse sichtbar durch die Beobachtung eines kontinuierlich abnehmenden Wachspiks in den NMR-Spektren sowie durch Veränderungen im Oberflächenprofil der Fruchtkutikula, die mittels simultaner AFM-Bildgebung beobachtet werden. Oberirdische Organe von Pflanzen sind durch eine aus Wachsen und Polyestern bestehende Schutzschicht, die sogenannte Kutikula, geschützt. Wir stellen Protokolle vor, um die gezielte Entfernung von inneren und äußeren Wachsen aus den Fruchtkutikeln von Tomaten mithilfe der Festkörper-Kernspinresonanzspektroskopie und der Rasterkraftmikroskopie zu bewerten.Diese Methoden können auch zur Beurteilung der Vernetzungskapazität von konstruierten kutikulären Materialien verwendet werden. Die Durchführung der Verfahren wird von drei Mitgliedern der Stark-Gruppe demonstriert: Dr. Ishish Chatterjee, der Doktorandin Shantani Sarkar und der ehemaligen Gymnasiastin Julia Tik. Eine weitere Demonstratorin ist Dr. Olivia Nisau, wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor unseres Kollegen aus dem Bereich Verfahrenstechnik, Dr. Alexander S. Um die enzymatische Isolierung der Tomatenhaut einzuleiten, geben Sie drei handelsübliche oder kultivierte Früchte in eine Schüssel, ziehen die Haut in großen Stücken ab und entsorgen das innere Perikarpgewebe.Anschließend die Tomatenhäute mit entionisiertem Wasser waschen und sie unter Wasser in einem Becher aufbewahren, wobei die geschälten Tomatenhäute vollständig in einem gemäß der schriftlichen Anleitung zubereiteten Enzymcocktail eingetaucht werden. 24 Stunden bei 31 Grad Celsius unter kontinuierlichem Schütteln inkubieren. Die Tomatenhäute mithilfe eines Büchnertrichters oder einer Küchensieb abtrennen und mit entionisiertem Wasser waschen.Nachdem die Häute eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen getrocknet wurden, können die getrockneten Häute in einer beschrifteten und verschlossenen Flasche aufbewahrt werden. Für nachfolgende Entwachungsverfahren füllen Sie ein zentriertes Glas- oder Einwegtäfelchen etwa zur Hälfte mit der Tomaten-Cuticula-Probe, wobei Sie Pinzetten verwenden, um die Probe vorsichtig am Boden der Extraktionskolonne zu platzieren, die für die Feststoffextraktion verwendet wird. Setzen Sie den Aufbau der Soxhlet-Apparatur unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel gemäß dem schriftlichen Protokoll fort.Überwachen Sie den Prozess eine Stunde lang und stellen Sie die Variac-Spannung so ein, dass sich im Reservoir etwa ein Tropfen pro Sekunde ansammelt und ein Siphonvorgang innerhalb der Socken des Apparats stattfindet. Wenn der Thimble gefüllt ist, nach einer 12-stündigen Extraktion, lassen Sie das Gerät abkühlen, senken Sie den Heizmantel ab und entfernen Sie den Extraktor und das Reservoir als eine Einheit, um das Lösungsmittel nach der Extraktion zu entsorgen. Kippen Sie die Säule, um das Abzapfen in das darunterliegende Kolben zu ermöglichen.Heben Sie mit einer Pinzette den Extraktionskolbenknopf bis knapp unter den Hals der Extraktionskolonne an. Lassen Sie überschüssiges Lösungsmittel ablaufen und stellen Sie den Knopf auf eine saubere Oberfläche. Trennen Sie das Kolbenfläschchen ab und gießen Sie den Abfall in einen beschrifteten Lösungsmittelbehälter.Wiederholen Sie den Extraktionsvorgang für aufeinanderfolgende Lösungsmittel mit stetig abnehmender Polarität, wie Chloroform und Taxan, jeweils zwölf Stunden lang. Sobald die getrocknete Tomatenprobenprobe vollständig trocken ist, messen Sie die Masse und lagern Sie sie bei Raumtemperatur in einem Schraubglas, das mit Parafilm versiegelt ist. Um die Probe für die NMR vorzubereiten, geben Sie vier bis sechs Milligramm vollständig entwachste Tomatenhaut, bekannt als Cutin, in einen 1,6-Millimeter-Fast-MAS-Zirkonia-Rotor unter Verwendung des vom Hersteller mitgelieferten Packwerkzeugs.Nachdem die obere Kappe installiert wurde, sollte die Hälfte der Kappe mit einem schwarzen Tintenstift markiert werden, um die Drehzahlmessung zu ermöglichen. Die anfängliche Einrichtung des Festkörper-NMR-Experiments ist ein technisch anspruchsvoller Prozess, der unter der Leitung erfahrenen Personals erfolgen muss. Beginnen Sie damit, die Magnetfeldhomogenität einzustellen und die experimentellen Parameter mithilfe einer Modellverbindung gemäß dem schriftlichen Protokoll zu optimieren. Fügen Sie den sauberen und befüllten Rotor in die Sonde ein und platzieren Sie anschließend die Sonde in das Magnetfeld.Erhöhen Sie die Spindeldrehzahl schrittweise auf bis zu 10 Kilohertz, um eine gute Probeneinpackung und die Fähigkeit des Rotors, stabil zu laufen, mit einer Abweichung von weniger als 20 Hertz zu überprüfen. Stellen Sie die Abstimm- und Anpassungskondensatoren der Sonde iterativ so ein, dass die Leistungsreflexion sowohl bei der Protonen- als auch bei der Kohlenstoff-13-NMR-Frequenz minimal ist. Stellen Sie die Versuchstemperatur auf 25 Grad Celsius ein.Starten Sie das voroptimierte CPMA-Experiment, das der unter der Hartman-Han-Proton-Kohlenstoff-Anpassungsbedingung bei einer Spinfrequenz von 10 Kilohertz bestimmten Bedingung entspricht. Nach dem Erfassen von 4.096 Transienten konditionieren Sie das Spektrum mit exponentieller Linienverbreiterung von 50 bis 100 Hertz und führen eine Fourier-Transformation durch, um ein NMR-Spektrum der Signalamplitude in Abhängigkeit von der chemischen Abschirmung in Teilen pro Million zu erzeugen. Beziehen Sie die Kohlenstoff-13-chemischen Verschiebungen wie im Text beschrieben.Erhöhen Sie die Rotordrehfrequenz auf 15 Kilohertz und wiederholen Sie die C-P-M-A-S-Messung, die der Hartman-Hahn-Anpassungsbedingung entspricht, die bei der Analyse der chemischen Verschiebung in Abhängigkeit von der Ladderdrehfrequenz des C-P-M-A-S-Kohlenstoffs bestimmt wurde. Die 13C-NMR-Spektren identifizierten die vorherrschenden funktionellen Gruppen in der vollständig entwachsenen DW-Tomaten-Cuticula: langkettige PHA, oxygenierte PHA, mehrfach gebundene und aromatische Verbindungen sowie Kohlenstoffausbeuten. Die oxygenierten Almo spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung kovalenter Bindungen zwischen den monomeren Einheiten des Cutin-Biopolymeren und tragen somit zur molekularen Architektur der Cutin-Matrix bei.Unterschiede in den relativen Peakflächen, die im Spektralbereich zwischen 45 und 100 ppm beobachtet wurden, deuten darauf hin, dass das mutierte Cutin im Vergleich zum Wildtyp-Apin einen relativ hohen Anteil an vernetzenden CHO-Struktureinheiten aufweist. Um eine gezielte Isolierung epicuticularer und intracuticularer Wachse zu beginnen.Waschen Sie eine zweite Portion ganze Tomaten mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie sie mit Papiertüchern und Kim-Tüchern ab und legen Sie sie stielabwärts auf ein Stück Aluminiumfolie. Bestreichen Sie die ganzen Tomaten von oben nach unten mit einer 120 %igen wässrigen Gummiarabikumlösung.Lassen Sie das Gummiarabikum eine Stunde lang auf der Fruchthaut trocknen, wodurch sich ein dünner Film bildet. Entfernen Sie diesen Film mit einer Pinzette, vermeiden Sie jedoch, die Tomatenhaut zu durchstechen. Eine weitere Behandlung des Films gemäß der im Text beschriebenen Vorgehensweise ergibt das epikutikuläre Wachs.Die Tomaten bleiben physisch intakt. Tauchen Sie sie zweimal für zwei Minuten in Chloroform. Bei Raumtemperatur kann das intracuticuläre Wachs nach dem Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen werden, indem man die Tomaten schält und sie anschließend enzymatisch mit Cellulase und Pectinase sowie Puffer aus Natriumacetat behandelt, um Cellulose bzw. Pektin zu entfernen.Mithilfe einer Säure-Extraktion kann anschließend, wie zuvor beschrieben, eine vollständige Entwachung der Tomaten durchgeführt werden. Die C-P-M-A-S-Experimente können mit natürlichen und teilweise entwachsenen Fruchthautproben wie im Text beschrieben wiederholt werden. Der Aufbau des Atomkraftmikroskops ist ein komplexer Prozess, der am besten unter anfänglicher Anleitung erfahrenen technischen Personals erfolgt. Eine Kraftmikroskopie beginnt damit, dass man das Rasterkraftmikroskop, abgekürzt SPM, einschaltet und sicherstellt, dass der Modus-Wahlschalter des Mikroskops auf den Kontakt-Atomkraftmikroskopie-Modus gestellt ist.Heben Sie als Nächstes den SPM-Kopf manuell an, indem Sie die beiden vom Benutzer verstellbaren vorderen Knöpfe drehen. Lösen Sie den a FM-Spitzenhalter vom SPM-Kopf, indem Sie die Klemmschraube an der Rückseite des Kopfes drehen. Entfernen Sie mit einer Pinzette den vorhandenen a FM-Konsolarm von seinem Halter.Danach vorsichtig einen neuen Cantilever mit Siliziumnitridspitze aus der Verpackung nehmen und anstelle des alten Cantilevers einbauen. Mit einem Lichtmikroskop überprüfen, ob der neu installierte FM-Cantilever nicht beschädigt ist. Die Tomatenhautprobe mit doppelseitigem Klebeband an einem Probenhalter befestigen.Verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob die Cuticula-Probe flach und glatt bleibt. Nachdem Sie die Probe auf dem Puck platziert haben, setzen Sie die an den Puck gebundene Tomaten-Cuticula-Probe auf den magnetischen Bereich an der Oberseite des SPM-Scanners. Drehen Sie die Knöpfe so, dass die vorderen beiden manuellen Schrauben des Scanners hoch genug eingestellt sind, um die Zerstörung der AFM-Spitze zu vermeiden.Wenn der Spitzenhalter in den SPM-Kopf eingesetzt wird, stellen Sie die motorisierte Hinterschraube ungefähr auf dieselbe Höhe wie die beiden vorderen Schrauben ein. Setzen Sie den Spitzenhalter erneut in den SPM-Kopf ein und befestigen Sie ihn, indem Sie die hintere Klemmschraube des Kopfes festziehen. Nachdem der Laser eingeschaltet wurde, richten Sie den Laserpunkt mit den mittleren und rechten Justierknöpfen für den Laser an der oberen Seite des Kopfes auf dem FM-Kantilever aus.Überwachen Sie den reflektierten Laserstrahl auf einem Stück Papier, um den Laserpunkt exakt am Ende eines FM-Karäusels zu positionieren. Stellen Sie die Position des Laserpunkts so ein, dass das maximale Summensignal erreicht wird. Regeln Sie die Position des reflektierten Laserpunkts auf dem Photodetektor, indem Sie die Position des beweglichen Spiegels horizontal und vertikal justieren, um sicherzustellen, dass das einfallende Licht gleichmäßig von den vier Quadranten empfangen wird.Der Detektor senkt eine FM-Spitze ab, indem die manuell bedienbaren vorderen Schrauben und die motorisierte hintere Schraube des SPM-Scanners zurückgefahren werden. Überwachen Sie visuell die Annäherung der FM-Spitze an die Probenoberfläche mit einem invertierten Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sich alle drei Schrauben auf derselben Höhe befinden.Um Artefakte durch die Abbildung einer gekippten Probe zu vermeiden, führen Sie die Spitze an die Probe heran, ohne jedoch so nahe zu kommen, dass sie die Probenoberfläche berührt oder durchbricht. Das von dem A FM-Kanalhebel reflektierte Laserlicht wird über einen beweglichen Spiegel auf einen lichtempfindlichen Detektor gelenkt, um den Kontakt-A FM-Modus mit einer Siliziumnitrid-A FM-Sonde zu ermöglichen. Stellen Sie die Ausgangssignalspannung auf minus zwei Volt bei einem Sollwert von null Volt ein und justieren Sie das Differenzsignal durch Verstellen der Spiegelposition auf null Volt.Verwenden Sie die Nano-Scope-Software. Klicken Sie auf das Mikroskop-Symbol und wählen Sie das entsprechende Profil aus. Stellen Sie mithilfe des Scan-Steuerungsfelds die Scan-Geschwindigkeit und die Scan-Größe ein.Lassen Sie die A-FM-Spitze durch Klicken auf das „Spitze einfahren“-Symbol mit der Probenoberfläche in Kontakt treten. Durch die Steuerung der motorisierten Rückstellschraube der SPM-Basis senkt das Programm nun die Spitze, bis sie mit der Probenoberfläche in Kontakt kommt. Der Abtastvorgang startet automatisch, sobald die Spitze erfolgreich eingekoppelt wurde.Überwachen Sie den Scanvorgang mithilfe der Bild- und Bereichsmodi der Software und passen Sie die Parameter schrittweise an, um die höchstmögliche Auflösung der Bilder gemäß dem schriftlichen Protokoll zu erreichen. Beginnen Sie beispielsweise mit einem großen Z-Achsen-Datenskalenwert. Reduzieren Sie dann den Z-Datenskalenwert sorgfältig, um den besten Kontrast der Oberflächenmerkmale im Bild zu erzielen.Nehmen Sie das Bild auf, um die Datendatei zu speichern. Verarbeiten Sie die Daten mithilfe von Glättungsfunktionen, um Bildartefakte aufgrund von vertikalem Scandrift, Bildwölbungen und vertikalen Versätzen zwischen den Scanzeilen zu entfernen. Berechnen Sie abschließend die durchschnittliche Rauheit des Kohlenstoffs.Die 13C-CP-MAS-NMR-Spektren zeigten eine kontinuierlich abnehmende Wachspitze bei 31 Teilen pro Million, was auf die schrittweise Entfernung von epikutikulären und intrakutikulären Wachsen aus dem Kutikula-Wachs-Komposit hinweist, wobei die grundlegende chemische Architektur des Cutin-Biopolymers erhalten bleibt. Eine Analyse mittels KFM (Kraftmikroskopie) zeigte Oberflächenunregelmäßigkeiten infolge der stufenweisen Extraktion epikutikulärer und intrakutikulärer Wachse aus der Fruchtkutikula, was auf Veränderungen in der Organisation des kutikulären Verbunds hindeutet. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann die schrittweise Entfernung von epikutikulären und intrakutikulären Wachsen aus den Tomatenfruchtkutikeln innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.Bei der Festphasenextraktion zur vollständigen Extraktion der Fruchtkutikula ist es wichtig, nach Verwendung des Kontaktmoduls ein Panel von Lösungsmitteln mit unterschiedlicher Polarität einzusetzen. Ein FM-Protokoll ist hier dargestellt. Weitere FM-Experimente können zur Messung der Oberflächenelastizität der Kutikula verwendet werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man systematisch Bestandteile aus dem Cutin-WAX-Verbund isoliert und die molekulare Charakterisierung sowie eine schnelle Oberflächenuntersuchung der Cuticula-Materialien mittels Festkörper-MR bzw. FM durchführt. Die in diesem Video veranschaulichten Techniken ermöglichen es Forschern der Pflanzenbiologie, die molekulare Zusammensetzung und supramolekulare Architektur natürlicher und technisch veränderter Pflanzengewebe zu bestimmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).

Isolierung von Maus epidermalen Keratinozyten und ihrer In-Vitro-Clonogenen Kultur

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Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Es wird ein Protokoll für die bequeme Isolierung und Anreicherung von Drüsen-, Kopfstiel- und sitzenden Trichomen aus Cannabis sativa vorgestellt. Das Protokoll basiert auf einer trockenen, nicht pufferartigen Extraktion von Trichomen, bei der nur flüssiger Stickstoff, Trockeneis und Nylonsiebe verwendet werden, und eignet sich für die RNA-Extraktion und transkriptomische Analyse.

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Der vorliegende Artikel zielt darauf ab, detaillierte und adäquate Protokolle für die Isolierung pflanzenassoziierter endophytischer Pilze, die Langzeitkonservierung von Isolaten, die morphologische Charakterisierung und die Gesamt-DNA-Extraktion für die anschließende molekulare Identifizierung und metagenomische Analyse bereitzustellen.

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Erfahren Sie Methoden zur Isolierung und biophysikalischen Untersuchung der Tomatenfruchtcuticula mit Festkörper-NMR und Rasterkraftmikroskopie. Diese Techniken ermöglichen die Analyse von Wachszusammensetzung und Vernetzungskapazität.

Isolierung und biophysikalische Untersuchung der Cuticula

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