Name: Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Erfahren Sie die Erkennung und Isolierung zirkulierender Melanomzellen mittels photoakustischer Flowmetrie. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht eine frühzeitige Identifizierung metastasierender Erkrankungen.

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Wir erkennen die Unterstützung des Department of Biological Engineering und Christopher S. Bond Life Sciences Center der University of Missouri. Wir erkennen an Zuschüssen aus Missouri Life Sciences Research Board 09-1034 und NIH R21CA139186-0. Wir danken auch den Life Sciences Undergraduate Research Opportunity Program an der University of Missouri, der University of Missouri Molekulare Zytologie Core, und der University of Missouri College of Engineering für die finanzielle Unterstützung.

1. Blut Probenvorbereitung <ol><li> Zeichnen Sie ca. 10 ml Vollblut aus einer Stage IV Cancer Patient in zwei 5 ml Vacutainer. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Minuten bei 3.000 Umdrehungen pro Minute (rpm). </li><li> Die Blutprobe wird in drei verschiedenen Schichten zu trennen: die unterste Schicht besteht aus den Erythrozyten, die mittlere Schicht, auch genannt der Buffy-Coat, enthält Leukozyten und Melanom-Zellen, und die oberste Schicht enthält Plasma und Thrombozyten. Entfernen Sie so viel Plasma wie möglich, ohne den Buffy-Coat. </li><li> Legen Sie 250 ul Histopaque 1077 in zwei 1 mL Wintrobe Röhren. </li><li> Mit einem 9 &quot;Pasteur Pipette, extrahieren Sie die verbleibende Plasma, das gesamte Buffy-Coat, und sogar die oberste Schicht der Erythrozyten, achten Sie darauf, &lt;500 ul zu sammeln. </li><li> Legen Sie die Lösung der Spitze der Histopaque Schicht und zentrifugieren Wintrobe Röhren in 15 ml konische Röhrchen für 10 Minuten bei 3000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Das Blut wird wiedertrennen, aber dieses Mal den Erythrozyten wird durch die Histopaque getrennt werden, erlaubt eine einfache Extraktion der Buffy-Coat. Verwenden Sie eine 9 &quot;Pasteur Pipette auf die gesamte Buffy-Coat erhalten und legen Sie es in ein 2 ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Suspend der Buffy-Coat in 1,5 ml PBS mit 2% v / v Tween 20. </li></ol> 2. Flusskammer Construction <ol><li> Erhalten Sie Acryl-Zylinder, 20 mm Außendurchmesser, 17 mm Innendurchmesser und 8 mm hoch. Bohren Sie drei 5 mm Durchmesser Löcher durch die Seite des Zylinders bei 90 Grad-Winkel voneinander ab. Cut drei Stücke von Polymer-Schlauch (1,6 mm Innendurchmesser, 5 mm Außendurchmesser), und legen Sie sie in die gebohrten Löcher. </li><li> Stretch Parafilm über den unteren Rand der Acryl-Ring, um eine wasserdichte Abdichtung zu machen. Der Parafilm bildet eine flache Schüssel mit der Acryl-Ring und die Acrylamid-Lösung, die eine Strömungskammer Form halten wird. </li><li> Suspend einem 1,6 mm Durchmesser Draht durch die Schlauchstücke, dass gegenüber sindeinander, um sicherzustellen, dass der Draht allein sichtbar durch die Mitte des Rings. Füllen Sie das dritte Stück Schlauch mit einem 1,6 mm Draht mit einem Durchmesser und Position der Röhre 1 mm von der abgehängten Draht. Diese Drähte zu verhindern Acrylamid vom Betreten des Schlauch. Nach dem Acrylamid erstarrt, die Drähte werden extrahiert werden, wobei ein zylindrischer Strömungsweg und einen Ort, eine optische Faser Position konzentriert sich auf den Strömungsweg. </li><li> 5 ml vorbereitet Acrylamid [20 g Acrylamid (Sigma Aldrich), 0,7 g Bisacrylamid (Sigma Aldrich), 100 ml destilliertem Wasser], um einen kleinen Becher. Messen Sie 0,02 g Ammoniumpersulfat (Sigma) und fügen Sie ihn in das Becherglas. Mix mit einem Rührstab für 3 Minuten. Add 20 uL tetramethylethylenediamene (Fisher Scientific) in das Becherglas. Schnell gießen Sie die Mischung in die Acryl-, Befüllen an die Spitze. Nach ein paar Sekunden, wird die Lösung Gel, wodurch eine Strömungskammer Form. Ziehen Sie das Kabel aus, was sicher nicht auf die Acrylamid-Gel zu stören. Der Fluss Chamber ist nun einsatzbereit. </li></ol> 3. Photoakustische Flowmetrie Set-up <ol><li> Akustisch Paar eine Polyvinylidenfluorid piezoelektrischen Wandler (Panametrics), um eine Flusskammer mit Ultraschall-Gel direkt über dem Strömungsweg. </li><li> Mit einem Bajonett Neill-Concelman (BNC)-Kabel, schließen Sie den Sensor an den Eingang eines RITEC Broadband Receiver-640A (Tiefpassfilter: out, Hochpassfilter: 1 MHz, Eingangsimpedanz: 50 Ohm, Verstärkung: 35 dB). Verbinden Sie den Ausgang des Filters mit dem Oszilloskop (Tektronix TDS 2024B). Zum Auslösen des Oszilloskops ist eine Photodiode (Thorlabs) in der Nähe des Wandlers eingestellt und wird in das Oszilloskop mit einem BNC-Kabel eingesteckt. </li><li> Ein T-Stecker (Small Parts) ist es, einen Arm des Flusses Kammer befestigt. Zwei Spritzenpumpen (Braintree Scientific) auf die anderen Zweige der Stecker angeschlossen. Eine Spritze enthält Luft, während die andere die Zellsuspension in Teil 1 hergestellt enthalten wird. Stellen Sie den Durchfluss zu100 ul / Minute. </li><li> Extrahieren Sie die kleinen Schlauch der Flusskammer, bis eine kleine Luftblase bildet, und legen Sie eine 1 mm Kerndurchmesser optische Faser mit einem 0,37 numerischer Apertur in diesem Slot. Füllen Sie die Tasche mit Wasser-Schnittstelle Signale zu reduzieren und erhöhen die Menge des Laserlichts angewendet, um den Fluss Weg. Aufgrund der numerischen Apertur der optischen Faser und kurze Entfernung zu den Strömungsweg, wird der Laser nur bestrahlen ein Schluck Probe jederzeit sichergestellt, dass die Probe direkt vor der Laser die gleiche Probe zu schaffen photoakustischen Signale. Die Laserenergie sollte ca. 28 mJ / cm 2 mit einem Spot-Größe von 7 mm 2. </li><li> Drehen Sie die beiden Spritzenpumpen auf. Wenn die beiden nicht mischbaren Flüssigkeiten der T-Kreuzung erreichen sie in homogene Schnecken und Strom an den Wandler partitioniert werden. </li><li> Bestrahlen die fließende Probe mit einem Nanosekunden gepulsten Laser zu photoakustische Wellen in der Melanom-Zellen zu erzeugen. Da Melanin ist ein broadbund optische Absorber können alle sichtbaren Laser-Wellenlänge verwendet werden. </li><li> Wenn ein Signal auf dem Oszilloskop, wenn eine Schnecke befindet sich auf dem Wandler enthält die slug Melanom, und sollte durch das System bis zum Ablegen in eine Sammlung Fläschchen verfolgt werden. </li></ol> 4. Immunzytochemie <ol><li> Nehmen Sie die gefangenen Schnecken zu einem Cytospin 4 Zentrifuge (Thermo Scientific), um sie zu Glasträger zu fixieren. Legen Sie Glasträger in Cytofunnels (Shandon EZ Einzelzimmer Cytofunnel mit Brown Filter Karte Thermo Scientific) und laden Sie sie in die Cytospin 4 Zentrifuge. Legen Sie 100 ul 1% Rinderserumalbumin (Sigma) in PBS in jedes Trichter und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten, um die aufgenommenen Zellen Stick an die Glasträger. </li><li> Nach Zentrifugation, fügen Sie die Zellproben, die Cytofunnels und dann Zentrifuge bei 600 rpm für 3 Minuten. Dann sprühen die Folien mit einem Ethanol-Fixiermittel. </li><li> Waschen Sie die Folien in PBS für 10 Minuten zweimal. </li><li&gt; So blockieren Sie eine unspezifische Bindung, inkubieren jede Folie mit einer Mischung von 10 ul Ziegenserum (Sigma) und 90 &amp;mgr; l PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Inkubation, dekantieren die Folien und inkubieren mit dem Primärantikörper-Lösung für 1 Stunde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Jede Folie sollte 1% MART-1-Antikörper in Kaninchen angehoben, 1% CD-45 Antikörper in der Maus erhöht, 10% Ziegenserum und 89% PBS. </li><li> Nach der Inkubation der Objektträger in PBS für 10 Minuten dreimal. </li><li> Die Folien werden dann in einem zweiten Antikörper-Lösung, die Fluorophor an die Antikörper gebunden hat inkubiert. Die Mischung enthält 0,05% Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, 0,05% Ziege-anti-Maus-Antikörper, 0,1% Ziegenserum und 99% PBS. Die Folien sind in der Dunkelheit für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Nach der Inkubation, dekantieren Waschen der Objektträger in PBS für 5 Minuten dreimal. </li><li> Um Flecken für einen Kern, inkubieren Sie die Zellen mit 0,1 ug / ml DAPI (Invitrogen) für1 Minute. Dann abgießen die Folien und waschen in PBS. </li><li> Montieren Sie ein Deckglas über die Zelle Probe mit 20 mL einer Harz-Basis Eindeckmittel pro Folie. Deckglasränder mit klarem Nagellack, um die Folie zu erhalten. Jetzt die Folien sind bereit, mit einem Fluoreszenz-Mikroskop abgebildet werden. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die photoakustische Wellenformen von weißen Blutkörperchen und Melanomzellen werden hier gezeigt. Die weißen Blutkörperchen, die keine inhärente Pigmentierung, erzeugen keine photoakustische Wellen und manifestieren sich als eine flache Linie von elektronischem Rauschen (links). Die pigmentierten Melanomzellen produziert einen robusten photoakustischen Welle (rechts). <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Nach immunzytochemische Färbung zeigen kultivierten Melanomzellen DAPI Signale in blue während MART1 ist grün markiert. <img src="/files/ftp_upload/3559/3559fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Überlagerung Bilder für DAPI und MART1, wie in Abbildung 2, mit CD45 als ein Indikator für Leukozyten, zeigt diese Figur Melanomzellen unter mehreren weißen Blutkörperchen.

<ol><li>Pantel, K., Brakenhoff, R., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+metastatic+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4, 448-456 (2004).</li>
<li>Yu, M., Stott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of Cell Biology. 192, 373-373 (2011).</li>
<li>Detection of circulating melanoma cells in human blood using photoacoustic flowmetry. Weight, R. M., Dale, P. S., Viator, J. Annual International Conference of the IEEE, 2009, , IEEE. 106-109 (1985).</li>
<li>Weight, R. M., Dale, P. S., Lisle, A., Caldwell, C., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoacoustic+detection+of+metastatic+melanoma+cells+in+the+human+circulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Photoacoustic detection of metastatic melanoma cells in the human circulatory system.</a> Opt. Lett. 31, 2998-3000 (2006).</li>
<li>Gupta, A., Kumar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+geometry+on+droplet+formation+in+the+squeezing+regime+in+a+microfluidic+T-junction%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Effect of geometry on droplet formation in the squeezing regime in a microfluidic T-junction.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 8, 799-812 (2010).</li>
<li>Mocellin, S., Hoon, D., Ambrosi, A., Nitti, D., Rossi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of circulating tumor cells in patients with melanoma: a systematic review and meta-analysis.</a> Clinical Cancer Research. 12, 4605-4605 (2006).</li>
<li>Cristofanilli, M., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M., Reuben, J., Doyle, G., Allard, W., Terstappen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> New England Journal of Medicine. 351, 781-781 (2004).</li>
<li>Cristofanilli, M., Hayes, D., Budd, G., Ellis, M., Stopeck, A., Reuben, J., Doyle, G., Matera, J., Allard, W., Miller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+a+novel+prognostic+factor+for+newly+diagnosed+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 23, 1420-1420 (2005).</li>
<li>Ghossein, R., Scher, H., Gerald, W., Kelly, W., Curley, T., Amsterdam, A., Zhang, Z., Rosai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+localized+and+metastatic+prostatic+carcinoma%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells in patients with localized and metastatic prostatic carcinoma: clinical implications.</a> Journal of Clinical Oncology. 13, 1195-1195 (1995).</li>
<li>Loberg, R., Fridman, Y., Pienta, B., Keller, E., McCauley, L., Taichman, R., Pienta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+isolation+of+circulating+tumor+cells+in+urologic+cancers%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection and isolation of circulating tumor cells in urologic cancers: a review.</a> Neoplasia. 6, 302-302 (2004).</li>
<li>Viator, J. A., Gupta, S. K., Goldschmidt, B. S., Bhattacharyya, K., Raghuraman, R., Shukla, R., Dale, P. S., Boote, E., Katti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gold+nanoparticle+enhanced+prostate+cancer+cells+using+photoacoustic+flowmetry+with+optical+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Detection of gold nanoparticle enhanced prostate cancer cells using photoacoustic flowmetry with optical reflectance.</a> J. Biomed. Nanotech. 6, 187-191 (2010).</li>
</ol>

John A. Viator ist Gründer und Präsident von Viator Technologies Inc, ein Unternehmen gegründet, um photoakustische Technologien für die Verbesserung der menschlichen Gesundheit zu vermarkten.

Erkennen CTC ist immer noch eine forschungsintensive Bereich mit sehr wenigen klinischen Anwendungen durch das schwierige Problem der Isolierung der seltenen Tumorzellen. Viele andere Techniken werden für CTC Nachweis, einschließlich der RT-PCR, mikrofluidische Zelle zu erfassen, immunomagnetische zu erfassen, und andere Methoden 8-12 bewertet. Allerdings versprechen photoakustischen Detektion von CMC zeigt, wie es Etikett ist kostenlos und bietet eine schnelle und genaue Möglichkeit, um kleine, Licht absorbierenden Partikeln zu erfassen. Das Protokoll beschriebenen weißen Blutkörperchen zu isolieren ist hoch effizient, noch eine geringe Anzahl von roten Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind. Diese rouge kontaminierenden Zellen absorbieren auch Laserlicht, aber mit einer deutlich verringerten Niveau. Um sicherzustellen, dass die roten Blutkörperchen nicht mit unseren Melanom Detection System stören, wurden fünf gesunde Patientenproben durch das System eingeführt und keiner gab ein Signal, was darauf hinweist, dass rote Blutkörperchen vorhanden sind, bei ausreichend niedrigen Konzentrationen zuwerden nicht berücksichtigt. Eine Reihe von Konzentration Studien wurden durchgeführt unter Verwendung von kultivierten Melanomzellen und die photoakustische Flow System empfindlich auf 1 Zelle / ul (unveröffentlichte Daten) bewährt. Diese Studien sind im Gange und wird bald auch Studien mit Krebspatienten Proben. Diese photoakustischen Technik wird auch für den Einsatz in nicht-pigmentierten CTC, wie Brust-und Prostatakrebs durch das Anbringen exogene Chromophore ausgewertet. Wir haben Vorarbeiten mit Gold-Nanopartikeln auf Krebs cells13 durchgeführt. Diese Tests haben gezeigt, dass Nanopartikel können die notwendigen optischen Absorption liefern, um photoakustische Wellen erzeugen. Die übrigen technischen Herausforderung besteht darin, solche Partikel, um Krebszellen gezielt an.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> ABCD1234 </td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung und isolierung von zirkulierenden melanomzellen mit photoakustische flowmetrie

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Zirkulierender Tumorzellen (CTC) sind jene Zellen, die aus einer makroskopischen Tumor getrennt haben und die Verbreitung durch die Blut-und Lymphsystem, Saatgut Zweittumoren 1,2,3. CTC sind Indikatoren für metastasierte Erkrankung und deren Nachweis in Blutproben verwendet werden, um Krebs zu diagnostizieren und zu überwachen das Ansprechen eines Patienten auf die Therapie sein. Da CTC selten sind, bestehend aus etwa einer Tumorzelle unter Milliarden von normalen Blutzellen in fortgeschrittenen Krebspatienten, deren Nachweis und die Zählung ist eine schwierige Aufgabe. Wir nutzen die Anwesenheit von Pigment in den meisten Melanomzellen zu generieren photoakustische oder laserinduzierten Ultraschallwellen in einem benutzerdefinierten Durchflusszytometer für den Nachweis von zirkulierenden Melanomzellen (CMC) 4,5. Dieser Prozess beinhaltet die Trennung einer Vollblut-Probe durch Zentrifugation und Gewinnung der weißen Blutkörperchen Schicht. Wenn im Vollblut, wird CMC mit der weißen Blutkörperchen aufgrund ähnlicher Dichte zu trennen. Diese Zellen sind in resuspendiertPhosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und in die Durchflussmesser. Anstatt einen kontinuierlichen Fluss des Blutes Zellsuspension induzierten wir Zweiphasenströmung, um diese Zellen für eine weitere Studie zu erfassen. In zwei Phase-flow, zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen System an einer Kreuzung und bilden abwechselnd Schnecken von flüssigem 6,7 entsprechen. PBS suspendiert weißen Blutkörperchen und Luft bilden Mikroliter Schnecken, die nacheinander mit Laserlicht bestrahlt werden. Die Zugabe eines Tensids in die flüssige Phase ermöglicht eine einheitliche slug Bildung und der Anwender kann in verschiedenen Größen Schnecken durch die Veränderung der Volumenströme der beiden Phasen zu schaffen. Slugs von Luft und Schnecken von PBS mit weißen Blutkörperchen enthalten keine Licht-Absorber und damit nicht produzieren photoakustische Wellen. Allerdings absorbieren Nacktschnecken der weißen Blutkörperchen, die sogar einzelne CMCs enthalten Laserlicht und produzieren hochfrequente Schallwellen. Diese Schnecken, die photoakustische Wellen erzeugen werden abgetrennt und gesammelt für cytochemische Färbung für EichATION von CMC.

Wir haben ein Durchflusszytometer mit laserinduzierten Ultraschall zu erkennen zirkulierenden Melanomzellen als Frühindikator von Metastasen entwickelt.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Zirkulierende Tumorzellen (CTCs) sind Zellen, die sich von einem makroskopischen Tumor gelöst haben und über das Blut- und Lymphsystem gestreut sind, um ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein von Krebs vor der Bildung sekundärer Tumore nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blutproben von Patienten mit Melanom im Stadium vier gewonnen und getrennt werden. In einem zweiten Schritt wird das Blut in eine photoakustische Durchflusskammer eingebracht, die den Nachweis und die Isolierung von Melanomzellen ermöglicht.Anschließend werden die erfassten Zellen abgebildet, um das Vorhandensein nachgewiesener Melanomzellen zu bestätigen. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Systems, Melanomzellen präzise und schnell anhand von photoakustischen Wellenformen und Zellbildgebungsverfahren zu detektieren und zu isolieren. Der Hauptvorteil unserer Methode gegenüber bestehenden Verfahren zum Nachweis zirkulierender Melanomzellen, wie R-T-P-C-R, biomes Magnetic Cell Sorting und anderen Methoden, besteht darin, dass unsere Methode markierungsfrei ist und die Erfassung zirkulierender Melanomzellen ermöglicht, ohne deren Oberfläche zu verändern oder sie an einem Substrat zu fixieren.Um eine Probe zur Detektion von metastasierendem Krebs vorzubereiten, entnehmen Sie zunächst etwa 10 Milliliter Vollblut von einem Patienten mit Krebs im Stadium vier. Geben Sie das Blut in zwei Vakuumröhrchen zu je fünf Milliliter und zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 3000 U/min. Die Blutprobe trennt sich dabei in drei verschiedene Schichten. Die untere Schicht besteht aus den Erythrozyten.Die mittlere Schicht, auch Buffy-Coat genannt, enthält Leukozyten und Melanomzellen, und die oberste Schicht enthält Plasma und Thrombozyten. Entfernen Sie so viel Plasma wie möglich, ohne den Buffy-Coat zu stören. Geben Sie 250 Mikroliter seiner opaken 10 77 zu zweimilliliter-Tropfenröhren hinzu.Unter Verwendung einer neun Zoll langen Pasteurpipette das verbleibende Plasma, die gesamte Buffy-Coat-Schicht und die oberste Schicht der Erythrozyten entnehmen, wobei sichergestellt werden muss, dass weniger als 500 µL gesammelt werden. Die Lösung in zuvor vorbereitete Wind-Trobe-Röhrchen überführen.Das Blut wird sich erneut trennen, diesmal jedoch werden die Erythrozyten durch das Hispa getrennt, wodurch die einfache Gewinnung der Buffy-Schicht ermöglicht wird. Verwenden Sie eine neun Zoll lange Pesa-Pipette, um die gesamte Buffy-Schicht zu isolieren, und geben Sie sie in ein zwei Milliliter fassendes Eend-Orph-Röhrchen. Anschließend suspendieren Sie sie in 1,5 Milliliter PBS mit 2 % Volumen pro Volumen zwischen 20.Um eine Flusskammer herzustellen, beginnen Sie mit einem acht Millimeter langen Acrylzylinder mit einem Außendurchmesser von 20 Millimeter und einem Innendurchmesser von 17 Millimeter. Bohren Sie anschließend drei Löcher mit einem Durchmesser von jeweils fünf Millimeter durch die Seitenwand des Zylinders, wobei die Löcher in einem Winkel von jeweils 90 Grad zueinander angeordnet sind. Schneiden Sie danach drei Stücke aus Polymerrohr ab und bringen Sie sie in die gebohrten Löcher ein.Spannen Sie Parafilm über die Unterseite des Acrylringes, um eine wasserdichte Abdichtung zu erzeugen. Das Parafilm bildet gemeinsam mit dem Acrylring eine flache Schale, die die Acrylamidlösung aufnehmen kann, aus der eine Durchflusskammer entsteht. Führen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 1,6 Millimetern durch die gegenüberliegenden Tubing-Stücke hindurch, wobei sichergestellt sein muss, dass allein der Draht in der Mitte des Ringes bis zum dritten Tubing-Stück sichtbar ist.Fügen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 1,6 Millimetern ein und positionieren Sie das Röhrchen einen Millimeter vom hängenden Draht entfernt. Diese Drähte verhindern, dass Acrylamid in das Röhrchen gelangt. Bereiten Sie fünf Milliliter Acrylamid vor.Gießen Sie die Mischung anschließend schnell in den Acrylring und füllen Sie diesen bis zum Rand. Nach einigen Sekunden verklebt die Lösung. Zum Herstellen einer Flusskammerform ziehen Sie vorsichtig die Drähte heraus, wobei darauf zu achten ist, das Acrylamidgel nicht zu stören; es entsteht ein zylindrischer Durchflusskanal und eine Positionierstelle für eine optische Faser, die auf den Durchflusskanal fokussiert wird.Die Durchflusskammer ist nun betriebsbereit und kann unter Verwendung von Ultraschallgel akustisch genutzt werden. Koppeln Sie einen piezoelektrischen akustischen Wandler aus Polyvinylidenfluorid direkt über dem Durchflussweg an die Durchflusskammer an. Verbinden Sie den Wandler mithilfe eines Bayonet-Neill-Concelman- oder BNC-Kabels mit dem Eingang eines Breitbandempfängers.Verbinden Sie den Ausgang des Filters mit dem Oszilloskop, um das Oszilloskop zu triggern. Stellen Sie eine Photodiode in der Nähe des Wandlers auf und schließen Sie sie mit einem B-NNC-Kabel an das Oszilloskop an. Ziehen Sie das kleine Schlauchstück der Durchflusskammer so lange heraus, bis sich eine kleine Luftblase bildet, und koppeln Sie es mit dem Wandler. Danach die optische Faser einführen und die Tasche mit Wasser füllen, um Grenzflächensignale zu reduzieren und die Menge des auf den Durchflusspfad treffenden Laserlichts zu erhöhen. Aufgrund der numerischen Apertur der optischen Faser und des kurzen Abstands zum Durchflusspfad wird der Laser zu jedem Zeitpunkt nur einen Probentropfen bestrahlen, wodurch sichergestellt ist, dass die Probe direkt vor dem Laser identisch ist mit der Probe, die photoakustische Signale erzeugt.Befestigen Sie als Nächstes einen T-Anschluss an einen Arm der Durchflusskammer und zwei Spritzenpumpen an die anderen Abzweigungen des Anschlusses. Eine Spritze enthält Luft, während die andere die zuvor hergestellte Zellsuspension enthält. Starten Sie dann beide Spritzenpumpen.Wenn die beiden zulässigen Fluide die T-Kreuzung erreichen, werden sie in homogene Segmente aufgeteilt und strömen an dem Wandler vorbei. Bestrahlen Sie die fließende Probe mit einem Nanosekunden-Pulslaser, um photoakustische Wellen in den Melanomzellen zu erzeugen. Da Melanin ein breitbandiger optischer Absorber ist, kann jede sichtbare Laserwellenlänge verwendet werden.Ein Signal, das auf dem Oszilloskop erscheint, wenn sich ein Kolben über dem Wandler befindet, zeigt an, dass der Kolben Melanom enthält. Verfolgen Sie ihn durch das System, bevor Sie ihn in ein Sammelgefäß fallen lassen. Um Proben für die Immunzytochemie vorzubereiten, legen Sie Objektträger in Zytotrichter und laden Sie sie in die Zytoschleuder zur Zentrifugation, um die gebundenen Zellen am Objektträger haften zu lassen.Geben Sie 100 Mikroliter 1 % BSA in PBS in jeden Trichter. Zentrifugieren Sie dann bei 600 U/min für drei Minuten. Nach der Zentrifugation fügen Sie die Zellproben für die CyTOF-Trichter hinzu und zentrifugieren erneut bei 600 U/min für drei Minuten.Besprühen Sie die Objektträger mit einem Ethanol-basierten Fixans. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal je 10 Minuten in PBS, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Inkubieren Sie jeden Objektträger eine Stunde bei Raumtemperatur mit einer Mischung aus 10 µL Ziegenserum und 90 µL PBS.Nach der Inkubation gießen Sie die Objektträger ab und geben Sie primäre Antikörperlösung hinzu. Jeder Objektträger sollte 1 % Kaninchen-Mark, 1 % Maus-CD45 und 10 % Zieuserserum in PBS enthalten und eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert werden. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal je 10 Minuten in PBS.Dann inkubieren Sie die Objektträger im Dunkeln eine Stunde bei Raumtemperatur mit den geeigneten fluoreszierenden sekundären Antikörpern und gießen Sie die Flüssigkeit ab. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal je fünf Minuten in PBS, um die Kerne anzufärben. Danach inkubieren Sie die Zellen eine Minute lang mit 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DPI. Gießen Sie danach die Flüssigkeit ab und waschen Sie erneut in PBS.Verwenden Sie abschließend ein auf Harz basierendes Eindeckmedium, um einen Deckglaser über die Zellprobe zu legen, verschließen Sie den Deckglaser mit klarem Nagellack und nehmen Sie die Probe mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Die photoakustischen Wellenformen von weißen Blutkörperchen und Melanomzellen sind hier links dargestellt. Die weißen Blutkörperchen, die keine intrinsische Pigmentierung aufweisen, erzeugen keine photoakustischen Wellen und zeigen rechts eine flache Linie elektronischen Rauschens.Doch die pigmentierten Melanomzellen erzeugen eine starke photoakustische Welle. Nach der Immunzyto-, chemischen Färbung zeigen kultivierte Melanomzellen fleckige Signale in Blau, wobei eine markierte Zelle in Grün hervorgehoben ist, die Bilder für DPI und Mart-1 mit CD45 als Indikator für Leukozyten überlagernd. Diese Abbildung zeigt Melanomzellen unter mehreren weißen Blutkörperchen nach ihrer Entwicklung.Unsere Technik wird für Forscher auf dem Gebiet der Krebsdiagnose den Weg ebnen, das Phänomen der Metastasierung zu erforschen, um sowohl die Krebsdiagnose zu verbessern als auch letztendlich die tödliche Ausbreitung der Krankheit zu heilen.

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Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video beschreibt die Technik zur Isolierung von CD133-negativen und positiven Melanom-Stammzellen aus einer primären Melanomzelllinie mittels magnetisch aktivierter Zellsortierung. Die CD133-positiven Melanom-CSCs werden weiter untersucht, um die Mechanismen der Melanomtumorgenese zu verstehen.

Isolierung von Melanom-Stammzellen: Eine Methode zur Gewinnung von CD133-positiven und -negativen Melanomzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

In diesem Video präsentieren wir einen photoakustischen durchflusszytometrischen Nachweis von Eierstockkrebszellen, die Nanopartikel in einer zirkulierenden in vitro Durchflusskammer tragen. Bei dieser nicht-invasiven Technik gelingt es, zirkulierende Tumorzellen in einem Flusssystem unter Verwendung eines Kontrastmittels zu identifizieren.

Photoakustische In-vitro-Durchflusszytometrie: Eine nicht-invasive photoakustische Durchflusstechnik zum Nachweis von nanopartikelhaltigen, zirkulierenden Eierstockkrebszellen

Quelle: Kalva, S. K., et al., Gepulste Laserdioden-basierte photoakustische Desktop-Tomographie zur Überwachung des Ein- und Auswaschens von Farbstoff im kortikalen Gefäßsystem von Ratten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verwendung photoakustischer Bildgebung, um Veränderungen in den kortikalen Gefäßen einer anästhesierten Ratte zu beobachten. Der Prozess umfasst die Basisbildgebung, die Farbstoffinjektion und die Analyse der Farbstoffabsorption und -entfernung während...

Photoakustisches Monitoring der Farbstoffbewegung in kortikalen Blutgefäßen

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie...

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Wir beschreiben zwei komplementäre Methoden, die den Fluoreszenz-Ubiquitinations-Zellzyklus-Indikator (FUCCI) und Bildanalyse oder Durchflusszytometrie verwenden, um Zellen in den inneren G1-arretierten und äußeren proliferierenden Regionen von 3D-Sphäroiden zu identifizieren und zu isolieren.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Hier präsentieren wir ein Protokoll Material zu schätzen und die optischen Eigenschaften der Oberfläche der photoakustischen Effekt kombiniert mit interner Totalreflexion verwendet wird. Diese Technik abklingende Feld-basierte Photoakustik kann verwendet werden, um eine photo-akustischen Messsystem zu schaffen Materialien "Dicken, Bulk- und Dünnfilmbrechungsindizes zu schätzen, und erforschen ihre optischen Eigenschaften.

Abklingende Feld Basierend Photoakustik: Optische Objektbewertung an Oberflächen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Ein Protokoll wird vorgestellt, um zirkulierende Eierstocktumorzellen unter Verwendung eines maßgeschneiderten photoakustischen Strömungssystems und gezielter Folsäure-capped Kupfersulfid-Nanopartikel zu detektieren.

Ovarialkrebs-Erkennung mit photoakustischer Durchflusszytometrie

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Entwicklung eines Multiplex-Immunfluoreszenz-Antikörper-Panels für die DNA-Barcode-basierte Bildgebung von murinen FFPE-Melanomgeweben. Wir beschreiben auch eine Bildanalyse-Pipeline mit Open-Source-Tools zur Generierung von räumlichen Proteomik-Einblicken in die Immunmikroumgebung des Mausmelanomtumors.

DNA-Barcode-basierte Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse von FFPE-Proben von genetisch umprogrammierten murinen Melanomen

Erfahren Sie die Erkennung und Isolierung zirkulierender Melanomzellen mittels photoakustischer Flowmetrie. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht eine frühzeitige Identifizierung metastasierender Erkrankungen.

Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

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