Erkennung und Isolierung von zirkulierenden Melanomzellen mit Photoakustische Flowmetrie

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Vorhandensein von Krebs vor der Bildung sekundärer Tumore nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst Blutproben von Patienten mit Melanom im Stadium vier gewonnen und getrennt werden. In einem zweiten Schritt wird das Blut in eine photoakustische Durchflusskammer eingebracht, die den Nachweis und die Isolierung von Melanomzellen ermöglicht.

Anschließend werden die erfassten Zellen abgebildet, um das Vorhandensein nachgewiesener Melanomzellen zu bestätigen. Die Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Systems, Melanomzellen präzise und schnell basierend auf photoakustischen Wellenformen und Zellbildgebungsverfahren zu detektieren und zu isolieren. Der Hauptvorteil unserer Technik gegenüber bestehenden Methoden zum Nachweis zirkulierender Melanomzellen, wie R-T-P-C-R, Biomes Magnetic Cell Sorting und anderen Verfahren, liegt darin, dass unsere Methode markierungsfrei ist und die Erfassung zirkulierender Melanomzellen ermöglicht, ohne deren Oberfläche zu verändern oder sie an einem Substrat zu fixieren.

Um eine Probe zur Detektion von metastasierendem Krebs vorzubereiten, entnehmen Sie zunächst etwa 10 Milliliter Vollblut von einem Patienten mit Krebs im Stadium vier. Geben Sie das Blut in zwei Vakuumblutentnahmeröhrchen mit je fünf Milliliter und zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 3000 U/min. Die Blutprobe trennt sich dabei in drei verschiedene Schichten. Die untere Schicht besteht aus den Erythrozyten.

Die mittlere Schicht, auch Buffy-Coat genannt, enthält Leukozyten und Melanomzellen, und die oberste Schicht enthält Plasma und Thrombozyten. Entfernen Sie so viel Plasma wie möglich, ohne den Buffy-Coat zu stören. Geben Sie 250 Mikroliter seiner opaken 10 77 zu zwei-Milliliter-Tropfenröhren hinzu.

Unter Verwendung einer neun Zoll langen Pasteurpipette das verbleibende Plasma, die gesamte Buffy-Coat-Schicht und die oberste Schicht der Erythrozyten entnehmen, wobei sichergestellt werden muss, dass weniger als 500 µL gesammelt werden. Die Lösung in die zuvor vorbereiteten Wind-Trobe-Röhrchen überführen.

Das Blut wird sich erneut trennen, diesmal jedoch werden die Erythrozyten durch die hispa getrennt, wodurch die einfache Gewinnung der Buffy-Schicht ermöglicht wird. Verwenden Sie eine neun Zoll lange Pesa-Pipette, um die gesamte Buffy-Schicht zu isolieren, und geben Sie sie in ein zwei Milliliter fassendes eend-orph-Gefäß. Anschließend suspendieren Sie sie in 1,5 Milliliter PBS mit 2 % Volumen pro Volumen zwischen 20.

Um eine Flusskammer herzustellen, beginnen Sie mit einem acht Millimeter langen Acrylzylinder mit einem Außendurchmesser von 20 Millimeter und einem Innendurchmesser von 17 Millimeter. Bohren Sie anschließend drei Löcher mit einem Durchmesser von jeweils fünf Millimeter durch die Seitenwand des Zylinders, wobei die Löcher in einem Winkel von 90 Grad zueinander angeordnet sind. Schneiden Sie danach drei Stücke aus Polymerrohr ab und bringen Sie sie in die gebohrten Löcher ein.

Spannen Sie Parafilm über die Unterseite des Acrylringes, um eine wasserdichte Abdichtung zu erzeugen. Das Parafilm bildet gemeinsam mit dem Acrylring eine flache Schale, die die Acrylamidlösung aufnehmen kann, aus der eine Durchflusskammer entsteht. Führen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 1,6 Millimetern durch die gegenüberliegenden Tubing-Stücke hindurch, wobei sichergestellt sein muss, dass allein der Draht in der Mitte des Ringes bis zum dritten Tubing-Stück sichtbar ist.

Fügen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 1,6 Millimetern ein und positionieren Sie das Röhrchen einen Millimeter vom hängenden Draht entfernt. Diese Drähte verhindern, dass Acrylamid in die Tubing gelangt. Bereiten Sie fünf Milliliter Acrylamid vor.

Gießen Sie die Mischung anschließend schnell in den Acrylring und füllen Sie diesen bis zum Rand. Nach wenigen Sekunden geliert die Lösung. Zum Herstellen einer Flusskammerform ziehen Sie vorsichtig die Drähte heraus, wobei darauf zu achten ist, das Acrylamidgel nicht zu stören; so entsteht ein zylindrischer Flusskanal und ein Platz, um eine optische Faser zu positionieren, die auf den Flusskanal fokussiert ist.

Die Durchflusskammer ist nun betriebsbereit und kann unter Verwendung von Ultraschallgel akustisch genutzt werden. Koppeln Sie einen piezoelektrischen akustischen Wandler aus Polyvinylidenfluorid direkt über dem Durchflussweg an die Durchflusskammer an. Verbinden Sie den Wandler mithilfe eines Bayonet-Neill-Concelman- oder BNC-Kabels mit dem Eingang eines Breitbandempfängers.

Verbinden Sie den Ausgang des Filters mit dem Oszilloskop, um das Oszilloskop zu triggern. Stellen Sie eine Photodiode in der Nähe des Wandlers auf und schließen Sie sie mit einem B-NNC-Kabel an das Oszilloskop an. Ziehen Sie das kleine Schlauchstück der Durchflusskammer so lange heraus, bis sich eine kleine Luftblase bildet, und koppeln Sie es mit dem Wandler.

Bringen Sie dann die optische Faser ein und füllen Sie die Tasche mit Wasser, um Schnittstellensignale zu reduzieren und die Menge des auf den Durchflusspfad treffenden Laserlichts zu erhöhen. Aufgrund der numerischen Apertur der optischen Faser und des kurzen Abstands zum Durchflusspfad wird der Laser zu jedem Zeitpunkt nur einen Probentropfen bestrahlen, wodurch sichergestellt ist, dass die Probe direkt vor dem Laser identisch ist mit der Probe, die photoakustische Signale erzeugt.

Befestigen Sie anschließend einen T-Stück-Anschluss an einen Arm der Durchflusskammer und zwei Spritzenpumpen an die anderen Äste des Anschlusses. Eine Spritze enthält Luft, während die andere die zuvor hergestellte Zellsuspension enthält. Starten Sie dann beide Spritzenpumpen.

Wenn die beiden zulässigen Fluide die T-Kreuzung erreichen, werden sie in homogene Segmente aufgeteilt und strömen am Wandler vorbei. Bestrahlen Sie die strömende Probe mit einem Nanosekunden-Pulslaser, um photoakustische Wellen in den Melanomzellen zu erzeugen. Da Melanin ein breitbandiger optischer Absorber ist, kann jede sichtbare Laserwellenlänge verwendet werden.

Ein auf dem Oszilloskop erscheinendes Signal, wenn sich ein Kolben über dem Wandler befindet, zeigt an, dass der Kolben Melanom enthält. Verfolgen Sie ihn durch das System, bevor Sie ihn in ein Sammelgefäß fallen lassen. Um Proben für die Immunzytochemie vorzubereiten, legen Sie Objektträger in Zytotrichter und laden Sie sie in die Zytospin-Zentrifuge, um die gebundenen Zellen am Objektträger haften zu lassen.

Geben Sie 100 Mikroliter 1 % BSA in PBS in jeden Trichter. Zentrifugieren Sie anschließend drei Minuten bei 600 U/min. Nach der Zentrifugation fügen Sie die Zellproben für die CyTOF-Trichter hinzu und zentrifugieren erneut drei Minuten bei 600 U/min.

Besprühen Sie die Objektträger mit einem Ethanol-basierten Fixans. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal je 10 Minuten in PBS, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Inkubieren Sie jeden Objektträger mit einer Mischung aus 10 Mikrolitern Ziegenserum und 90 Mikrolitern PBS eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nach der Inkubation gießen Sie die Objektträger ab und geben Sie die Primärantikörperlösung hinzu. Jeder Objektträger sollte 1 % Kaninchenmark, 1 % Maus-CD45 und 10 % Zieuserserum in PBS enthalten und eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert werden. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal je 10 Minuten in PBS.

Anschließend die Objektträger im Dunkeln eine Stunde bei Raumtemperatur mit den geeigneten fluoreszierenden sekundären Antikörpern inkubieren und anschließend die Flüssigkeit abgießen. Danach die Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten mit PBS waschen, um die Kerne anzufärben, und die Zellen eine Minute lang mit 0,1 Mikrogramm pro Milliliter DPI inkubieren. Danach die Flüssigkeit von den Objektträgern abgießen und erneut mit PBS waschen.

Schließlich wird mit einem auf Harz basierenden Eindeckmedium ein Deckglas über die Zellprobe aufgebracht, das Deckglas mit klarem Nagellack versiegelt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Die photoakustischen Wellenformen von weißen Blutkörperchen und Melanomzellen sind hier links dargestellt. Die weißen Blutkörperchen, die keine intrinsische Pigmentierung aufweisen, erzeugen keine photoakustischen Wellen und erscheinen rechts als flache Linie elektronischen Rauschens.

Doch die pigmentierten Melanomzellen erzeugen eine starke photoakustische Welle. Nach immuncytochematischer Färbung zeigen kultivierte Melanomzellen fleckige Signale in Blau, wobei eine markierte Zelle in Grün hervorgehoben ist, die überlagerte Bilder für DPI und Mart-1 mit CD45 als Indikator für Leukozyten darstellt. Diese Abbildung zeigt Melanomzellen unter mehreren weißen Blutkörperchen nach ihrer Entwicklung.

Unsere Technik wird für Forscher auf dem Gebiet der Krebsdiagnose den Weg ebnen, das Phänomen der Metastasierung zu erforschen, um sowohl die Krebsdiagnose zu verbessern als auch letztendlich die tödliche Ausbreitung der Krankheit zu heilen.