Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Nanoporen in künstlichen Membranen für den Einsatz in Proteinabsorptionsstudien zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem Nanoporen mit Hilfe eines Stiels in eine Nitridmembran gebohrt werden. Dann wird die Nanopore in eine Kammer geladen und mit einer ionischen Lösung benetzt.

Diese Flüssigkeit bildet also eine Brücke von einer Seite der Nanopore zur anderen, um die Nanopore für Experimente bereit zu machen. Über ihn wird eine Spannung angelegt und es kann beobachtet werden, dass ein Strom von Ionen durch ihn hindurchfließt. Der letzte Schritt ist das Hinzufügen von Protein zur Nanoporenkammer.

Die Beobachtung langlebiger Blockaden des Ionenstroms durch die Nanopore zeigt schließlich die Absorption von Proteinen an den Seiten der Nanopore. Hallo, ich bin Dave Wicki. Ich bin Doktorand am Department of Physics der Syracuse University.

Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Absorption von Proteinen auf anorganischen Oberflächen geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Proteine, Nukleinsäurewechselwirkungen, Einzelmoleküle für die Spektroskopie und die Untersuchung von Molekülen auf engstem Raum angewendet werden. Beginnen Sie damit, den Vorbau auf eine Beschleunigungsspannung zu bringen.

Als nächstes wird ein SPI-Siliziumnitrid-Fenstergitter in den TEM-Probenhalter geladen. Reinigen Sie das Gitter 30 Sekunden lang mit Sauerstoffplasma, um Schmutz zu entfernen. Laden Sie vor dem Laden der Probe den Probenhalter in das TEM und lassen Sie das Vakuum nach unten pumpen.

Suchen Sie im Hellfeld-TEM-Modus das Nitridfenster, ein helles Quadrat auf dem Rohrogramm. Stellen Sie sicher, dass das TEM richtig ausgerichtet ist. Richten Sie dann die Probe aus und fokussieren Sie sie.

Versetzen Sie nun das System in den STEM-Modus und verwenden Sie einen Hot-Off-Detektor, um die Probe abzubilden und ihre Ausrichtung zu überprüfen. Stellen Sie den Monochromator, falls vorhanden, auf einen niedrigen Wert ein, um einen höheren Elektronenstrom für das Bohren zur Verfügung zu haben. Wählen Sie die geeignete Punktgröße zum Bohren der Nanopore basierend auf dem Durchmesser der Elektronensonde aus.

Mit ausgerichtetem Vorbau. Mit dem BROGRAM können Sie die Nitridmembran bei der gewünschten Vergrößerung perfekt fokussieren. Wenn sich die Probe bewegt, den Elektronenstrahl abtasten und warten, bis sich die Probe stabilisiert hat.

Dies kann bis zu einer Stunde dauern. Sobald sie stabilisiert ist, platzieren Sie die Elektronensonde auf der Probe und beginnen Sie mit dem Bohren der Nanopore. Das Bohren einer Nanopore mit einem TM erfordert die Untreue des Patienten.

Dabei handelt es sich um einen Prozess, bei dem Nitrid unter einer Elektronenstrahlsonde nach und nach dissipiert wird. Es ist wichtig, die Elektronensonde direkt über der Bohrstelle zu halten und zu bestätigen, dass die Nanopore vollständig gebohrt ist. Bevor Sie die Probe aus dem TEM entfernen, überprüfen Sie die Probe regelmäßig, indem Sie mit dem Hot-Off-Detektor scannen.

Wenn die Probe leicht driftet, stellen Sie die Position der Elektronensonde so ein, dass sie sich über der Nanopore befindet. Mit dem ROI-Gramm im Fokus verschwindet der schimmernde Nitridfilm. Wenn sich die Nanopore bildet, während das Roky Gramm unscharf ist, ist der ausgefranste Nagelsaum sichtbar.

Bilden Sie die Nanopore mit dem heißen Aus ab und erstellen Sie ein Intensitätsprofil des Bildes. Der Durchmesser der Nanopore kann anhand des dunkelsten Bereichs des Profils abgeschätzt werden. Mit der Elektronensonde kann die Nanopore bei Bedarf vergrößert werden.

Wenn es den gewünschten Durchmesser hat. Wechseln Sie in den TEM-Modus mit dem Monochromator in der Standardeinstellung. Verwenden Sie Hellfeld-TEM, um die Porengröße zu bestätigen.

Beginnen Sie mit der Zubereitung von Degas di Saline. Legen Sie die Lösung unter Vakuum und in ein Beschallungsbad für 20 Minuten Setzen Sie den zerbrechlichen Nanopore-haltigen Siliziumnitrid-Chip vorsichtig in einen 10-Milliliter-Pyrex-Schnabel. Stellen Sie dann den Becher in einen Abzug auf eine heiße Platte.

Reinigen Sie den Nanopore-Chip sehr sorgfältig mit Piranha-Lösung. Geben Sie zunächst drei Milliliter Schwefelsäure mit einer Glaspipette in den Behälter. Zweitens fügen Sie der Schwefelsäure vorsichtig einen Milliliter Wasserstoffperoxid mit hohem Gehalt hinzu.

Bitte treffen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen. Lassen Sie den Nanoporen-Chip 10 Minuten einweichen. Nehmen Sie dann mit einer Glaspipette die Piranha-Lösung aus dem Becherglas und entsorgen Sie sie ordnungsgemäß.

Füllen Sie anschließend das Becherglas mit dem deionisierten Wasser von Degas. Leeren Sie mit einer sauberen Glaspipette das Becherglas mit Wasser und wiederholen Sie diesen Waschgang mindestens fünfmal. Entfernen Sie mit einer sauberen Pinzette den Nanoporen-Chip und trocknen Sie ihn durch leichten Sog.

Versiegeln Sie den Nanoporen-Chip nach dem Trocknen sofort in der Kammer. Der Chip kann in der Kammer durch O-Ringe oder Silikondichtstoff gesichert werden. Füllen Sie die Kammer mit Kaliumchloridlösung.

Verbinden Sie die Silber- und Silberchlorid-Elektroden mit der Kammer. Elektroden können hergestellt werden, indem Silberdraht über Nacht in Bleichmittel eingeweicht wird. Legen Sie ein Transmembranpotential an die Elektroden an und überwachen Sie die Stromantwort mit einem Patch-Clamp-Verstärker.

Im Spannungsklemmen-Modus wird aus den Messungen ein Stromspannungsverlauf erstellt. Die Kurve sollte sehr linear sein. Bei Verwendung eines molaren Kaliumchlorids sollte der Leitwert der Nanopore seinem Durchmesser entsprechen.

Weist die Nanopore keine lineare IV-Kurve auf, ist der Leitwert zu niedrig oder der offene Strom der Nanopore nicht stabil. Dies deutet darauf hin, dass die Nanopore nicht richtig verheiratet ist und das Piha-Waschen wiederholt werden sollte. Es ist wichtig, dass sich die Flüssigkeit in der Nanopore befindet.

Wenn dieser Schritt nicht richtig durchgeführt wird, wird der Ionenstrom durch die Nanopore ein sehr großes Rauschen aufweisen und die Aufteilung der Proteine in die Nanopore wird drastisch reduziert. Beginnen Sie damit, eine gereinigte Probe des interessierenden Proteins in das Erdbad der Kammer zu geben. Warten Sie, bis die Probe gründlich diffundiert ist.

Wenden Sie eine Transmembranpotentialspannungsvorspannung an, deren Polarität der Gesamtladung des untersuchten Proteins entgegengesetzt ist. Ein angelegtes Potential von 200 Millivolt sollte groß genug sein, um es zu beobachten. Die meisten Proteinanalytenereignisse erscheinen als vorübergehende Stromablenkungen von der Basislinie.

Wenn kein Signal beobachtet wird, erhöhen Sie die Konzentration des Proteins in der Kammer. Höhere Spannungen verbessern das Signal-Rausch-Verhältnis und das Nitrid. Nanoporen können mehreren Volt standhalten.

Proteinabsorptionen erscheinen als langlebige Änderungen des Basisstroms der Nanopore. Typische Ergebnisse für Festkörper-Nanoporen sind wie folgt. Der offenporige Strom sollte sehr stabil sein.

Die IV-Eigenschaften der Nanopore sollten sehr linear sein. In einem molaren Kaliumchlorid, 10 molaren Kaliumphosphat pH 7,4, liefert die Steigung einer linearen Anpassung an die IV-Kurve die einheitliche Leitfähigkeit der Nanopore. Der Leitwert steht in direktem Zusammenhang mit dem Nanoporendurchmesser und sollte mit der Gleichung übereinstimmen.

Dieser Wert sollte mit einer Genauigkeit von 30 % übereinstimmen. Ist der Wert zu klein, ist die Pore wahrscheinlich nicht mit der Zugabe von Protein verheiratet. Es sollten schnelle Ereignisse folgen: Die Proteinabsorption ist ein langlebiger Stromabfall. Einige Proteine sind hochlabil und durchlaufen im Poreninneren eine strukturelle Umwandlung.

In diesem Fall wird der langlebige Spannungsabfall von schnellen Schwankungen begleitet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Festkörper-Nanoporen mit einem Rastertransmissionselektronenmikroskop herstellt und diese ausgeglichene SA-Proteinabsorption verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in einem Abzug mit Handschuhen, ein Laborkittel und eine chemische Schürze immer getroffen werden sollten, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.