Modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid-System, um Proteine interagieren mit dem Growth Factor Progranulin Identifizieren
17. Januar 2012
Wir haben die konventionelle Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, ein wirksames Instrument bei der Identifizierung genetischer Protein-Interaktion verändert. Diese Modifikation deutlich verkürzt den Prozess, reduziert den Arbeitsaufwand und vor allem, reduziert die Anzahl von Fehlalarmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz reproduzierbar und zuverlässig.
Dieses MY-Zwei-H-System verbessert das herkömmliche Hefe-Zwei-Hybrid-Protokoll, um die Anzahl falsch positiver Ergebnisse deutlich zu verringern. Bereiten Sie zunächst eine Transformation des Köder-Plasmids in Hefe im kleinen Maßstab vor. Nach der Validierung des Köderkonstrukts mittels eines Wettbewerbsinhibitor-Screens wird die cDNA-Bibliothek auf Minus-vier-Platten aufgebracht.
Fortfahren mit der Überprüfung positiver Klone mittels XGL- und Reaktionsassays. Anschließend die potenziell wechselwirkenden Proteine durch DNA-Sequenzierung und bioinformatische Analyse identifizieren. Letztlich erhöht dieses modifizierte Hefe-Zwei-Hybrid-System deutlich die Effizienz und den Erfolg des Screening-Verfahrens.
Das herkömmliche Hefe-Zwei-Hybrid-System ist bekannt dafür, falsch positive Ergebnisse zu liefern. Diese Anleitung zeigt das modifizierte Screening-Verfahren, das im Hinblick auf Zwei-Punkt-Interaktionen deutlich verbessert wurde. Beginnen wir also.
Inokulieren Sie 50 Milliliter YPD mit einer fünf Milliliter umfassenden Übernachtkultur von MAV 2 0 3. Inkubieren Sie zwei bis vier Stunden bei 30 Grad Celsius. Anschließend wird die Hefe durch Zentrifugation gewonnen, nach einem Waschschritt werden die Pellets in zwei Milliliter Lösung eins resuspendiert und zehn Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Bereiten Sie die DNA-Mischung für die Transformation vor. Geben Sie 100 Mikroliter Hefezellen hinzu und mischen Sie gründlich. Anschließend geben Sie 700 Mikroliter Lösung zwei hinzu und mischen erneut gründlich.
Zunächst 30 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren und anschließend eine Hitzeschockbehandlung durchführen. Die Zellen werden nun durch Zentrifugation gewonnen und das Pellet in 200 Mikrolitern autoklaviertem destilliertem Wasser resuspendiert. Serielle Verdünnungen der Suspension werden auf SD-LU-Platten ausgestrichen und bei 30 Grad Celsius zwei bis drei Tage inkubiert. Dieser Schritt bestätigt, dass das Bait-Plasmid die Transkription aktiviert und dass diese Selbstaktivierung durch Inhibitoren wie 3-AT, einen kompetitiven Inhibitor des Hiss3-Genprodukts, neutralisiert werden kann.
Zunächst wird das Bait-Plasmid in MAV203-Hefe transformiert. Die Reaktion wird auf SD-LU-Platten ausgestrichen und bei 30 Grad Celsius inkubiert. Um Kolonien auf dreifache, durch Selbstaktivierung induzierte Expression zu prüfen, werden mit Autoklaven-Pinzetten Kolonien von jeder Transformation auf SD-LU-His-Platten gepflückt, die zunehmende Konzentrationen von 3-AT enthalten, und die Platten bei 30 Grad Celsius inkubiert.
Eliminieren Sie Bait-Stämme, die auf Platten mit 100 Millimolar drei at wachsen, da sie für den zwei-Hybrid-Screen für re nicht geeignet sind. Wählen Sie für die verbleibenden Baits die niedrigste Konzentration von drei at, die das Zellwachstum hemmt, um sie bei der CD NA-Bibliotheksscreening zu verwenden. Suspendieren Sie mehrere isolierte Kolonien von Hefe, die das Bait-Plasmid enthalten, in 100 Mikrolitern destilliertem Wasser aus dem Autoklaven. Streichen Sie sie auf zwei 10 Zentimeter große SD LU-Platten auf.
Inkubieren Sie beide Platten bei 30 Grad Celsius. Kratzen Sie die Zellen ab und suspendieren Sie sie vollständig in 10 Milliliter. Autoklavieren Sie destilliertes Wasser und impfen Sie 500 Milliliter flüssiges YPD-Medium an.
Überprüfen Sie die Zelldichte durch Spektral- und Photometrie sowie durch Kultivierung bei 30 Grad Celsius. Fahren Sie fort mit der Zellernte durch Zentrifugation. Waschen Sie einmal mit 100 Milliliter, autoklaviertem destilliertem Wasser und einmal mit 50 Milliliter Lösung eins.
Suspenderen Sie das Pellet anschließend in 2,5 Milliliter Lösung eins. Geben Sie dann denaturierte, geschnittene Lachssperma-DNA sowie die CD-NA-Bibliothek hinzu, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Fügen Sie danach 15 Milliliter Lösung zwei, die 40 % Polyethylenglykol enthält, hinzu.
Vorsichtig mischen und 700 Mikroliter Aliquote in 25 Autoklaven aufteilen. Inkubieren Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen 30 Minuten lang in einem 30 °C warmen Wasserbad, gefolgt von einer Hitzeschockbehandlung von 15 Minuten in einem 42 °C warmen Wasserbad.
Die Zellen durch Zentrifugation gewinnen und jedes Pellet vorsichtig in 400 Mikroliter autoklaviertem destilliertem Wasser resuspendieren. Jedes Transformationsgemisch auf zwei Selektionsplatten ausplattieren und fünf bis 10 Tage bei 30 Grad Celsius inkubieren, um als Kontrolle die Transformationswirksamkeit der Reaktionsprobe abzuschätzen. Serielle Verdünnungen einer Reaktion.
Nach einer Inkubation für drei Tage bei 30 Grad Celsius die Anzahl der Gesamtkolonien bestimmen. Die Kolonien auf eine YPD-Platte übertragen und über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubieren. Anschließend eine runde Nitrocellulosemembran direkt auf die YPD-Platte legen und sicherstellen, dass keine Luftblasen entstehen.
Nach einer Minute überprüfen, ob alle Kolonien auf die Membranen übertragen wurden. Die Membran mit der Kolonienseite nach oben in ein Aluminiumfolienboot legen und 20 Sekunden lang auf die Oberfläche von flüssigem Stickstoff stellen. Anschließend einige Minuten in den flüssigen Stickstoff eintauchen.
Entfernen Sie nun die Membran, um sie aufzutauen. Bereiten Sie derweil eine Petrischale mit einer frischen XCA-Lösungsschicht auf Aman-Papier vor. Tauchen Sie dann die aufgetaute Membran vorsichtig ein und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.
Bis blaue Kolonien erscheinen. Die Transformation von Beute-, Klon- und Köderkonstrukt in Hefe kann weitere falsch positive Ergebnisse ausschließen. Isolieren Sie zunächst die Plasmid-DNA aus den Hefestämmen, die möglicherweise wechselwirkende Proteine enthalten.
Transformieren Sie die DNA in E. coli DH5α und selektieren Sie durch Wachstum auf LB-Ampicillin-Platten. Screenen Sie die Transformanten durch Restriktionsenzymanalyse. Koinfizieren Sie nun die Prey- und Bait-Plasmide in Hefe MAV203, plattieren Sie sie auf SC-Leu-Trp-Platten und inkubieren Sie für zwei bis drei Tage bei 30 Grad Celsius.
Wählen Sie drei verschiedene Kolonien aus, um die xal-Assay-Sequenz durchzuführen, die Plasmid-DNA der positiven Klone zu gewinnen und Gene mittels Bioinformatik zu identifizieren. In diesem Experiment wurde der Wachstumsfaktor Pro-Granulin von Rine als Köder verwendet, um eine Gehirn-cDNA-Bibliothek zu screenen, wobei 54 positive Klone erhalten wurden.
Kandidaten wurden aus 2,5 Millionen isoliert. Transformanten wurden mit dem Pro-Granulin-Bait getestet. Weitere Analysen mittels des Ex-Skull-Assays ergaben 23 positive Klonkandidaten für den Pro-Granulin-Bait.
Interessanterweise identifizierten bioinformatische Analysen von Sequenzierungsdaten TNF R zwei. Tatsächlich bestätigten weitere funktionelle Experimente Progranulin als neuen Liganden der TT NF-Rezeptoren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man diesen modifizierten Hybrid-Screen mit Ihrer gewünschten Base durchführt.
Vergessen Sie nicht, mit Handschuhen zu arbeiten, da einige verwendete Bereiche gefährlich sind. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein modifiziertes Hefe-Zwei-Hybrid-System vor, das den herkömmlichen Protokollansatz zur Identifizierung von Proteinwechselwirkungen verbessert. Der neue Ansatz verringert signifikant die Rate falsch-positiver Ergebnisse und erhöht die Zuverlässigkeit der Resultate.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Protein-Interaktionen
- Genetische Bildschirm
- Hefe-Zwei-Hybrid-System
Hintergrund
- Das Hefe-Zwei-Hybrid-System ist eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen.
- Konventionelle Methoden führen häufig zu einer hohen Anzahl falsch-positiver Ergebnisse.
- Die Verbesserung der Genauigkeit dieser Screenings ist entscheidend für zuverlässige biologische Erkenntnisse.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Probleme durch methodische Modifikationen zu beheben.
Zweck der Studie
- Den Hefe-Zwei-Hybrid-Protokoll zur Verbesserung der Genauigkeit modifizieren.
- Den Arbeitsaufwand und die Zeit für Screenings reduzieren.
- Eine reproduzierbare und zuverlässige Methode zur Identifizierung von Proteinwechselwirkungen bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer kleinen Transformation des Bait-Plasmids in Hefe.
- Überprüfung des Bait-Konstrukts mittels eines Screenings mit kompetitiven Inhibitoren.
- Screening der cDNA-Bibliothek auf Minus-vier-Platten.
- Bestätigung positiver Klone mit XGL- und Reaktions-Assays.
Hauptergebnisse
- Das modifizierte System reduziert die Anzahl falsch-positiver Ergebnisse signifikant.
- Es wurde eine erhöhte Wirksamkeit und Erfolgsrate im Screening-Prozess beobachtet.
- Mögliche wechselwirkende Proteine wurden durch DNA-Sequenzierung identifiziert.
- Die Befunde wurden durch bioinformatische Analysen gestützt.
Schlussfolgerungen
- Das modifizierte Hefe-Zwei-Hybrid-System ist ein zuverlässiges Werkzeug für die Untersuchung von Proteinwechselwirkungen.
- Dieser Ansatz verbessert die Gesamteffizienz genetischer Screenings.
- Zukünftige Anwendungen könnten von den verringerten Falsch-positiv-Raten profitieren.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Abbildung von Protein-Protein-Wechselwirkungen im Entdeckungsstadium ist entscheidend für die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominimierung in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung&D. Das modifizierte Hefe-Zwei-Hybrid-System (MY2H) ermöglicht eine zuverlässigere Identifizierung von Proteinpartnern, verringert falsch-positive Ergebnisse und beschleunigt die Gewinnung praktisch nutzbarer Erkenntnisse. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielkandidatennominierung und den frühen Phasen der Lead-Identifizierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung&D
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die systematische Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen zur funktionellen Zielvalidierung.
- Verringert mechanistische Unschärfen, indem falsch-positive Ergebnisse bei Interaktionsscreenings minimiert werden.
- Unterstützt eine zuverlässige Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Bindungspartnern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Bait-Konstrukte für nachgeschaltete Screening-Workflows vor.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von Assays durch Kontrollen mit kompetitiven Inhibitoren.
- Erleichtert das skalierbare Screening von cDNA-Bibliotheken zur Entdeckung von Interaktionen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Protein-Interaktionsbefunde mit krankheitsrelevanten Wegen, wenn die Köderauswahl krankheitsbedingt ist.
- Ermöglicht Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch Identifizierung therapeutisch nutzbarer Proteinpartner.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung auf Grundlage robuster Interaktionsdaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das MY2H-System befindet sich am Übergang zwischen früher Entdeckung und der Identifizierung von Leitstrukturen und bietet eine reproduzierbare Plattform zur Kartierung von Proteinwechselwirkungen vor nachgeschalteten Funktionsstudien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Identifizierung direkter Interaktoren von Wachstumsfaktoren oder krankheitsrelevanten Proteinen.
- Screening: Liefert validierte Ergebnisse mit geringer Rate falsch-positiver Befunde, die für weitere biochemische oder zelluläre Assays geeignet sind.
- Analytik: Stellt quantitative Koloniezahlen und sequenzverifizierte Treffer für den vergleichenden Datenabgleich bereit.
- Translationale Forschung: Verbindet Interaktionsdaten mit Krankheitsmodellen, wenn Köderproteine in pathologische Prozesse involviert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten, reproduzierbaren Arbeitsablauf, der an unterschiedliche Proteinziele innerhalb von Portfolioanalysen angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert die mechanistische Unsicherheit bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung von Proteininteraktionsanalysen.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung validierter Zielstrukturen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Hefegenetik, molekularer Klonierung und bioinformatischer Analyse.
- Benötigt Zugang zu Transformationsgeräten, selektiven Medien und Sequenzierungsinfrastruktur.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Validierung der Köderproteine und der Verwendung von Inhibitor-Kontrollen.
- Einsatz bei verschiedenen Köderproteinen möglich, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung für spezifische Konstrukte.
- Die Reduktion von falsch-positiven Ergebnissen hängt von strengen Kontroll- und Validierungsschritten ab.
