Name: Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen aus Mäuselunge mittels Kollagenase-Verdauung, magnetischer Zellseparation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht hochreine Präparationen für immunologische Studien.

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Die Autoren möchten sich an Marilyn Dietrich an der LSU Durchflusszytometrie Core Facility danken für ihre Hilfe bei der Zellsortierung und Peter Mottram für seine Unterstützung bei der Mikrophotographien. Diese Arbeit wurde von der Flight Attendant Medical Research Institute, die LSU-Competitive Research Program Award und den NIH / NIAID Grants P20 RR020159 und R03AI081171 finanziert.

1. Lung Perfusion und einzigen Zellsuspension <ol><li> Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin Narkose-Gemisch (in mg / Maus Ketamin 1,8, Xylazin 0,19) und Ausbluten über die Vena femoralis </li><li> Expose der Brusthöhle durch Schneiden und vorsichtig wieder die Außenhaut des Bauchfells. Fahren Sie mit dem Zwerchfell, indem die Rippen, um sowohl die Herz und Lunge aussetzen zu öffnen. </li><li> Perfundieren sanft die Lungen mit einer 5 ml Spritze mit EDTA-HBSS (1mM EDTA in Calcium / Magnesium-freien HBSS) gefüllt. Schließen Sie eine 25 G Nadel und legen Nadel in die rechte Herzkammer. Zur Vermeidung von Leckagen während der Injektion, sichern Sie die myokardiale Gewebe um die Nadel mit einer Pinzette. Vorsichtig injizieren Lösung bei konstantem Druck. Genaue Perfusion wird in Lunge Inflation und ein Farbumschlag nach rosa / weiß Ergebnis. </li><li> Entfernen Lymphknoten um eine mögliche Verunreinigung von diesem Gewebe zu verwerfen. </li><li> SammelnLungengewebe, in eine Petrischale übertragen auf Eis, und hacken sie in kleine Stücke mit einer Rasierklinge. </li><li> Transfer geerdet Gewebe in eine gentleMACS C Rohr mit 5 ml / Lunge Kollagenaseverdau Lösung (Kollagenase Typ 1A 0,5 mg / ml plus Typ IV Rinderpankreas DNase 20 pg / ml in HBSS mit 5% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). </li><li> Verwenden Sie die gentleMACS dissociator auf eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Wählen Sie Programm: m_lung_01. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 Minuten. Schütteln Rohr alle 5 Minuten, um Gewebeteile zu resuspendieren. Fahren Sie mit dem Programm m_lung_02. </li><li> Transfer-Probe auf eine 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C. Nach diesem Schritt zu halten alle Reagenzien und Zentrifugation bei 4 ° C zu einer Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen zu verhindern. </li><li> Überstand verwerfen und zu lysieren restlichen roten Blutkörperchen durch Zugabe von 2 ml ACK Lysepuffer für 1 Minute bei Raumtemperatur. Wash-Zellen mit 13ml kaltem PBS/0.5% BSA und Zentrifuge für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C. </li><li> Überstand resuspendieren gesamten Zellen in 5 ml kaltem PBS/0.5% BSA und pass gründliche einer 100 um Nylon-Mesh. </li><li> Bestimmen Sie die gesamte Zellzahl durch Trypanblau-Ausschluss-Farbstoff. </li></ol> 2. Magnetische Trennung und CD11c + Zellen Bereicherung <ol><li> Centrifuge einzigen Zellsuspension für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C und Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 400 ul der Trennung Puffer (PBS, 0,5% BSA und 2 mM EDTA) pro 10 8 insgesamt Zellen. Block Fc-vermittelte unspezifische Antikörper-Bindung durch anti-CD16/CD32 Antikörper (0.5μg / 10 6 Zellen) für 30 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Wash-Zellen mit 10 ml kaltem Trennpuffers und Zentrifuge für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C. Die Zellen in 400 ul der Trennung Puffer. </li><li> 100 l von CD11c MicroBeads pro 10 8 </sup&gt; insgesamt Zellen. Gut mischen und inkubieren für 15 Minuten in den Kühlschrank (2-8 ° C). </li><li> Wash-Zellen mit 10 ml kaltem Trennpuffers und Zentrifuge für 10 Minuten bei 200 x g bei 4 ° C und Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in 3 ml kaltem Trennpuffers. </li><li> Führen magnetische Trennung mit dem autoMACS Pro TM Separator, indem Sie das Programm posseld. Sammeln Sie die positiven Fraktion (0,5 ml). </li></ol> 3. Konventionelle dendritischen Zellen (CDC) Isolierung <ol><li> Inkubieren bereichert CD11c positive Zellsuspension mit anti-CD11c PE-Cy7 und anti-IA/IE (MHC-II)-FITC-Antikörper für 30 Minuten bei 4 ° C. Optimierte Konzentration von Antikörpern liegt bei 0,5 pg / 10 6 Zellen. </li><li> Wash-Zellen mit kaltem PBS/0.5% BSA und Zentrifuge für 10 Minuten bei 335 x g bei 4 ° C. Die Zellen in 0,5 ml PBS/0.5% BSA und leiten sie durch ein 40 um Nylon-Mesh. </li><li> Gehen Sie zurArt der Zellen mit Hilfe der FACS Aria Zellsortierer in der Reinheit Modus. 100 l des PBS/0.5% BSA, um die Sammlung Röhren, um eine Beschädigung der gereinigten Zellen verhindern. Halten Sie Ihre Zellen bei einer Kühltemperatur in der Zelle Sortierung. </li></ol> 4. Alternate-Protokoll für den Erhalt einer Zellsuspension und CD11c + Zellen Bereicherung <ol><li> Als Ersatz für die gentleMACS dissociator kann geerdet Lungengewebe aus Schritt 1.5 in ein 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml Kollagenase-Lösung pro Lunge und inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C übertragen werden Vortex-Zellen alle 15 Minuten, um Gewebeteile zu resuspendieren. Stören des Gewebes, indem die Probe 6-8 mal in und durch eine 3 ml Spritze verbunden, um eine 20 G Nadel. Vermeiden Sie Luftblasen während des Prozesses, da sonst die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigt wird. Sobald einzelne Zelle Suspension erhalten wird, weiter auf 1,8 Schritt. </li><li> Als Ersatz für die AutoMACSPro TM Trennungtor, magnetische Trennung für die Anreicherung der CD11c Zellen, kann auch durch das Bestehen der Zellsuspension manuell durch zwei MACS Säulen durchgeführt werden. Die Auswahl der entsprechenden Spalten ist abhängig von der Stichprobengröße. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Lung CDC als CD11c hallo / MHC-II hallo Zellpopulation identifiziert. Wie in Abb.. 1, vertreten cDC einen kleineren Prozentsatz von 1,4%, wenn zu einigen anderen Geweben wie Milz (4,8%) verglichen. Doch im Gegensatz zu Milz-, Express-Lungen-CD11c positive Zellen unterschiedliche Mengen an MHC-II, einschließlich einer Zellpopulation, anders als das der CDC. Nach der Single-Cell-Vorbereitung, wurde die Zelle Ausbeute von insgesamt Lungenzellen etwa 3,0 bis 3,8 x 10 7 Zellen / Lunge mit einer Tragfähigkeit von 60-70% aus, die ein wenig mehr als 1% cDC Teilmenge vertreten. Dieser Prozentsatz wurde nach der CD11c magnetische Trennung, wo die gesamte Lunge cDC ca. 10 t erhöht wurde erhöhtimes (&gt; 16%) aus dem ursprünglichen Präparat (Abb. 2A). Allerdings vertreten CD11c exprimieren geringe Mengen an MHC-II (CD11c hallo / MHC-II lo, Makrophagen) eine hohe Kontamination Zellpopulation (&gt; 70%), die mit der Lunge cDC Teilmenge gemischt wurde. Wie in Abb.. 2B, wurden diese Zellen nach der Zellsortierung Schritt bei der CDC Reinheit&gt; 96% erreicht eliminiert. Die übliche Rendite von CDC nach dem ganzen Verfahren wurde 5 x 10 4 Zellen / Lunge. Mikrophotographien zeigen morphologische Merkmale der CDC als abgerundete Zellen mit den typischen Dendriten (oberes Bild). Auf der anderen Seite, vertreten CD11c hallo / MHC-II lo eine morphologisch unterschiedliche Teilmenge, dass zelluläre Ausstülpungen, die typisch für Makrophagen (MΦ, unten) 12 sind zeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" /> Abbildung 1. Differential DC Frequenz in Maus Lunge und Milz. Lunge einend Milzgewebe von C57BL / 6 Mäuse wurden gesammelt und mit Kollagenase behandelt. Nach Kollagenaseverdau wurden die Zellen mit anti-Maus-CD11c-PE-Cy7 und anti-Maus-IA / IE-FITC gefärbt. Vertreter der Durchflusszytometrie Plots zeigen Prozentsätze der CDC (CD11c hallo / MHC-II hallo) in Lunge und Milz. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" /> Abbildung 2. Isolation von CDC aus Mauslunge. Mauslunge einzigen Zellsuspension wurde mit anti-CD11c Mikroperlen gekennzeichnet und durch eine automatische Zellseparator. A) Eine repräsentative Darstellung zeigt die Prozentsätze der CDC (CD11c hallo / MHC-II hallo) und Makrophagen (MΦ, CD11c hallo / MHC-II lo) Bevölkerung nach CD11c Bereicherung. Weitere Färbung der angereicherten Fraktion folgte mit Anti-Maus-CD11c-PE-Cy7 und anti-Maus-IA / IE-FITC. Doppel-positive Zellen wurden sortiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. ZuIdentifizierung ihrer Morphologie, Zellen wurden cytospun und mit einem modifizierten Wright-Giemsa-Färbung gefärbt. B) Repräsentative Plots zeigen Prozentsätze von CDC und MΦ nach cell sorting. Mikrofotografien zeigen ein repräsentatives Bild der Lunge cDC und Lunge MΦ. Balken = 20 um.

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
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<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
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<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Isolation der pulmonalen Maus DC ist eine wichtige Technik für die Untersuchung einer breiten Palette von Atemwegs-Reize. Das Verfahren zur Erlangung dieser Zellen enthält kritische Schritte, dass der Verlust von Zellen sowie die Lebensfähigkeit der Zellen und Reinheit zu verhindern. Perfusion der Lunge vor der Abholung wird dazu beitragen, die peripheren Zellen zu eliminieren, sowie verringern Verunreinigungen Erythrozyten. Der Einsatz der automatisierten Dissoziation kann advanteogus werden, wenn eine große Zahl von L...

<table width="200" border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> ACK Lysepuffer </td><td> Invitrogen </td><td> D6-0005DG </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11c (HL3) </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5580979 </td><td> PE-Cy7 konjugierte </td></tr><tr><td> Anti-Maus-IA / IE (269) </td><td> BD-Pharmingen </td><td> 553623 </td><td> FITC-konjugierten </td></tr><tr><td> Collangenase Typ 1A </td><td> Sigma </td><td> 9891-500MG </td><td></td></tr><tr><td> Zell-Siebe </td><td> BD Falcon </td><td> 352340, 352360 </td><td></td></tr><tr><td> CD11c (N418) Microbeads </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D5025-150KU </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes-Pufferlösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen 60 mm </td><td> BD Falcon </td><td> 351016 </td><td></td></tr><tr><td> GentleMACS ™ C Rohren </td><td> Miltenyi </td><td> 130-093-237 </td><td></td></tr><tr><td> Gentle MACS dissociator </td><td> Miltentyi </td><td> 130-093-235 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS-Pro ™ </td><td> Miltenyi </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> FASCS Aria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr></table>

isolierung von maus lung dendritischen zellen

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritische Zellen (DC) spielen eine fundamentale Rolle in der Sensorik eindringende Krankheitserreger 1,2 sowie in der Kontrolle von tolerogenen Antworten 3 in die Atemwege. Mindestens drei Teilmengen von Lungen-dendritische Zellen in Mäusen beschrieben worden: konventionelle DC (CDC) 4, plasmazytoide DC (pDC) 5 und die IFN-Produktion Killer DC (IKDC) 6,7. Die CDC Subset ist das prominenteste DC Teilmenge in der Lunge 8. Die gemeinsame Marker bekannt, DC Teilmengen zu identifizieren ist CD11c, eine Typ-I-Transmembran-Integrin (β2), die auch auf Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen und einigen B-Zellen 9 ist zum Ausdruck gebracht. In einigen Geweben, mit CD11c als Marker zur Maus DC identifizieren gilt, wie in der Milz, wo die meisten CD11c + Zellen stellen die CDC Subset, das hohe Niveau des Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II (MHC-II) zum Ausdruck bringt. Allerdings ist die Lunge ein heterogenes Gewebe, wo seinSeite DC Teilmengen gibt es einen hohen Prozentsatz von einer deutlichen Zellpopulation, die ein hohes Maß an CD11c drückt Kampf geringe MHC-II. Basierend auf der Charakterisierung und vor allem auf seinen Ausdruck F4/80, eine Milz-Makrophagen-Marker, die CD11c hallo MHC-II lo Lunge Zellpopulation Lungenmakrophagen 10 und in jüngerer Zeit identifiziert worden, wie ein potenzieller DC Vorstufe 11. Im Gegensatz zu Maus pDC, hat das Studium der spezifischen Rolle der CDC in den pulmonalen Immunantwort wurde durch das Fehlen einer spezifischen Markierung, die in die Isolation dieser Zellen helfen könnte begrenzt. Daher wird in dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zu hoch gereinigten Mauslunge cDC isolieren. Die Isolierung der pulmonalen DC Teilmengen stellt ein sehr nützliches Werkzeug, um Einblicke in die Funktion dieser Zellen in Reaktion auf die Erreger respiratorischer Erkrankungen sowie Umwelt-Faktoren, die die Immunantwort des Wirtes in der Lunge auslösen kann gewinnen.

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Dendritische Zellen (DC) der Lunge spielen eine grundlegende Rolle bei der Erkennung eindringender Pathogene 1,2 sowie bei der Steuerung tolerogener Antworten 3 in der ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine hochgereinigte Aufbereitung von dendritischen Zellen aus der Mauslunge zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst das Lungengewebe ohne die drainierenden Lymphknoten gesammelt wird. Anschließend wird eine Einzelzell-Suspension durch Kollagenase-Digestion gewonnen. Der nächste Schritt besteht darin, die CD11c-positiven Zellen mithilfe eines magnetischen Zellisolationssystems anzureichern. Anschließend wird der konventionelle dendritische Zell-Subset durch zytometrische Zellsortierung isoliert. Letztendlich können konventionelle dendritische Zellen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie und Lichtmikroskopie analysiert werden.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag die konventionelle dendritische Zell-Teilmenge bei der angeborenen Immunität und Infektionskrankheiten der Atemwege leistet. Den Ablauf wird Issa Lancelin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, sowie ich selbst demonstrieren. Nach der Tötung der Maus beginnen Sie damit, die äußere Haut des Peritoneums aufzuschneiden und vorsichtig zurückzuziehen, um die Brusthöhle freizulegen.Fahren Sie fort, indem Sie den Brustkorb öffnen, um Herz und Lunge freizulegen. Sobald Herz und Lunge freigelegt sind, kann das Perfusionsverfahren beginnen. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit E-D-T-A-H-B-S-S und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel an der Spritze.Danach die Nadel in den rechten Ventrikel einführen, um ein Austreten während der Injektion zu verhindern. Mit einer Pinzette das Myokardgewebe um die Nadel herum fixieren. Anschließend die Lösung langsam injizieren, wobei ein konstanter Druck aufrechterhalten werden muss.Eine genaue Perfusion führt zu einer Lungenaufblähung und einer Farbänderung in Rosa oder Weiß; um eine mögliche Kontamination auszuschließen, entfernen und entsorgen Sie die drainierenden Lymphknoten. Sammeln Sie dann das Lungen­gewebe und überführen das exzidierte Organ in eine Petrischale auf Eis. Füllen Sie ein Gentle Max C-Gefäß mit fünf Milliliter Lungenkollagenase-Dig­estionslösung und zerkleinern Sie die Lunge anschließend in kleine Stücke.Überführen Sie das Gewebe mit einem Rasiermesser unter leichter max-Dissociation in das Reagenzglas. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, wählen Sie das Programm M lung zero one. Inkubieren Sie anschließend die Probe 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie das Reagenzglas alle fünf Minuten, um die Gewebefragmente erneut in Suspension zu bringen. Fahren Sie danach mit Programm M lung zero two fort.Überführen Sie die Probe nun in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 335 ×g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 2 Milliliter eines CK-Lysepuffers zum Pellet, um die verbleibenden roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur für eine Minute zu lysieren. Waschen Sie die Zellen anschließend mit 13 Milliliter kalter PBS, die mit 0,5 % BSA ergänzt wurde.Nachdem das Überstand entfernt wurde, resuspendieren Sie dieses Pellet erneut in fünf Millilitern kalter PBS mit BSA und führen die Zellsuspension dann durch ein 100-Mikrometer-Nylonnetz. Abschließend bestimmen Sie die Gesamtzellzahl mittels Trypanblau-Ausschluss. Anstelle einer sanften Max-Dissociation füllen Sie ein 15-Milliliter-Kegelrohr mit fünf Millilitern Kollagenase-Lösung pro Lunge.Gebe das zerkleinerte Lungengewebe in das Röhrchen und inkubiere das Lungengewebe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Vortexe die Zellen alle 15 Minuten, um die Gewebefragmente erneut zu sedimentieren. Anschließend wird das verdauende Gewebe dadurch aufgeschlossen, dass die Probe sechs bis acht Mal durch eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel hindurchgezogen wird.Vermeiden Sie die Bildung von Blasen während des Verfahrens. Waschen Sie die Einzelzell-Suspension zunächst 10 Minuten lang bei 200 × g und vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 400 µL Puffer für die Trennung.Blockieren Sie die Fc-vermittelte unspezifische Antikörperbindung an insgesamt acht Zellen durch Zugabe von 0,5 Mikrogramm Anti-CD16/32-Antikörper zu den sechs Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der Zellen mit 10 Milliliter kaltem Separationspuffer resuspendieren Sie die Zellen in weiteren 400 Mikroliter Separationspuffer. Geben Sie dann 100 Mikroliter CD11c-Mikroperlen zu den acht Gesamtzellen, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie die Zell-Perlen-Lösung für 15 Minuten im Kühlschrank.Nachdem die ungebundenen Kügelchen mit 10 Milliliter kaltem Trennpuffer entfernt wurden, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in einem Milliliter kaltem Trennpuffer. Abschließend die Proben in den AutoMax pro-Separator geben und das P-O-S-S-E-L-D-Programm laufen lassen, um die CD11c-exprimierende Zellfraktion zu sammeln.Inkubieren Sie die angereicherte Suspension der CD11c-positiven Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit anti-CD11c-PEI-sieben und Antikörpern, die gegen die auf diesen Zellen vorhandenen MHC-Klasse-II-Moleküle gerichtet sind. Nach dem Waschen der Zellen mit kaltem PBS plus BSA resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter PBS plus BSA und filtrieren sie durch einen 40-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter. Geben Sie abschließend die gereinigten CD11c-positiven Zellen in ein FACS-Röhrchen zur späteren Quantifizierung in separaten leeren Röhrchen.Fügen Sie 100 Mikroliter PBS mit BSA zu Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen hinzu, um Schäden an den gereinigten Zellen zu verhindern, und sortieren Sie die gefilterte Zellsuspension mittels FACS. Halten Sie die gesammelten Zellen während des gesamten Zellsortierprozesses gekühlt. In diesen Dichtediagrammen befinden sich im Milzgewebe mehr als dreimal so viele konventionelle dendritische Zellen wie in der Lunge. Zusätzlich umfassen im Lungengewebe die CD11c-positiven Zellen eine Zellpopulation, die keine konventionellen dendritischen Zellen sind, wie durch die MHC-Klasse-II-niedrige Ereignisgruppe außerhalb des Tors für konventionelle dendritische Zellen dargestellt. Auf der linken Seite der Abbildung, wie in diesem Dichtediagramm zu sehen ist, erhöht die magnetische Trennung der gesamten Lungenzellen die Anzahl konventioneller dendritischer Zellen von etwa 1,5 % der Gesamtzellzahl auf etwa 16,5 %. CD11c-positive Makrophagen mit niedriger Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen machen jedoch weiterhin über 70 % der Gesamtzellpopulation aus und verunreinigen somit erheblich die Reinheit der angereicherten Teilpopulation konventioneller dendritischer Zellen der Lunge in diesem Schritt des Isolationsverfahrens. Die Sortierung mittels FACS hingegen verbessert die Reinheit konventioneller dendritischer Zellen auf über 96 %, wie in der Mikroaufnahme oben rechts zu erkennen ist. Die CD11c-hoch, MHC-Klasse-II-hoch exprimierenden konventionellen dendritischen Zellen sind rundliche Zellen mit den typischen Dendriten, während die in der Mikroaufnahme unten rechts sichtbaren CD11c-hoch, MHC-Klasse-II-niedrig exprimierenden Zellen zelluläre Ausstülpungen aufweisen, die eher einer makrophagenartigen Morphologie entsprechen.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Lungengewebe und die Einzelzellpräparation unter den angegebenen Temperaturen zu handhaben. Dies ist entscheidend für die Erhaltung der Zellviabilität und der Ausbeute konventioneller dendritischer Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Dendritische-Zell-Subpopulationen aus der Mauslunge isoliert.Die Isolierung von pulmonalen dendritischen Zellsubpopulationen stellt ein sehr nützliches Werkzeug dar, um Einblicke in die Funktionen dieser Zellen als Reaktion auf Atemwegspathogene und Umweltfaktoren zu gewinnen, die die Immunantwort des Wirts in der Lunge auslösen können.

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

In diesem Artikel wurden primäre Lungenendothelzellen aus neonatalen Mäusen isoliert und kultiviert.

Isolierung von primären Lungenendothelzellen der Maus

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellpopulationen in der Lunge von Mäusen durch magnetische T-Zell-Anreicherung und Peptid:Major Histocompatibility Complex (MHC)-Tetramere.

Identifizierung seltener antigenspezifischer T-Zellen aus der Lunge von Mäusen mit Peptid:Major-Histokompatibilitätskomplex-Tetrameren

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Erfahren Sie die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen aus Mäuselunge mittels Kollagenase-Verdauung, magnetischer Zellseparation und Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht hochreine Präparationen für immunologische Studien.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

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