Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine hochgereinigte Aufbereitung von dendritischen Zellen aus der Mauslunge zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zuerst das Lungengewebe ohne die drainierenden Lymphknoten gesammelt wird. Anschließend wird eine Einzelzell-Suspension durch Kollagenase-Digestion gewonnen.

Der nächste Schritt besteht darin, die CD11c-positiven Zellen mithilfe eines magnetischen Zellisolationssystems anzureichern. Anschließend wird der konventionelle dendritische Zell-Subset durch zytometrische Zellsortierung isoliert. Letztendlich können konventionelle dendritische Zellen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie und Lichtmikroskopie analysiert werden.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, beispielsweise welchen Beitrag die konventionelle dendritische Zell-Teilmenge bei der angeborenen Immunität und Infektionskrankheiten der Atemwege leistet. Den Ablauf wird Issa Lancelin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, sowie ich selbst demonstrieren. Nach der Tötung der Maus beginnen Sie damit, die äußere Haut des Peritoneums aufzuschneiden und vorsichtig zurückzuziehen, um die Brusthöhle freizulegen.

Fahren Sie fort, indem Sie den Brustkorb öffnen, um Herz und Lunge freizulegen. Sobald Herz und Lunge freigelegt sind, kann das Perfusionsverfahren beginnen. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit E-D-T-A-H-B-S-S und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel an der Spritze.

Danach die Nadel in den rechten Ventrikel einführen, um ein Austreten während der Injektion zu verhindern. Mit einer Pinzette das Myokardgewebe um die Nadel herum fixieren. Anschließend die Lösung langsam injizieren, wobei ein konstanter Druck aufrechterhalten werden muss.

Eine genaue Perfusion führt zu einer Lungenaufblähung und einer Farbänderung in Rosa oder Weiß; um eine mögliche Kontamination auszuschließen, entfernen und entsorgen Sie die drainierenden Lymphknoten. Sammeln Sie dann das Lungen­gewebe und überführen das exzidierte Organ in eine Petrischale auf Eis. Füllen Sie ein Gentle Max C-Gefäß mit fünf Milliliter Lungenkollagenase-Dig­estionslösung und zerkleinern Sie die Lunge anschließend in kleine Stücke.

Überführen Sie das Gewebe mit einem Rasiermesser unter leichter max-Dissociation in das Reagenzglas. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, wählen Sie das Programm M lung zero one. Inkubieren Sie anschließend die Probe 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie das Reagenzglas alle fünf Minuten, um die Gewebefragmente erneut in Suspension zu bringen. Fahren Sie danach mit Programm M lung zero two fort.

Überführen Sie die Probe nun in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 335 ×g und 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und geben Sie 2 Milliliter eines CK-Lysepuffers zum Pellet, um die verbleibenden roten Blutkörperchen bei Raumtemperatur für eine Minute zu lysieren. Waschen Sie die Zellen anschließend mit 13 Milliliter kalter PBS, die mit 0,5 % BSA ergänzt wurde.

Nachdem das Überstand entfernt wurde, resuspendieren Sie dieses Pellet erneut in fünf Millilitern kalter PBS mit BSA und führen die Zellsuspension dann durch ein 100-Mikrometer-Nylonnetz. Abschließend bestimmen Sie die Gesamtzellzahl mittels Trypanblau-Ausschluss. Anstelle einer sanften Max-Dissociation füllen Sie ein 15-Milliliter-Kegelrohr mit fünf Millilitern Kollagenase-Lösung pro Lunge.

Gebe das zerkleinerte Lungengewebe in das Röhrchen und inkubiere das Lungengewebe eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Vortexe die Zellen alle 15 Minuten, um die Gewebefragmente erneut zu sedimentieren. Anschließend wird das verdauende Gewebe dadurch aufgeschlossen, dass die Probe sechs bis acht Mal durch eine 3-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel hindurchgezogen wird.

Vermeiden Sie die Bildung von Blasen während des Verfahrens. Waschen Sie die Einzelzell-Suspension zunächst 10 Minuten lang bei 200 × g und vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 400 µL Puffer für die Trennung.

Blockieren Sie die Fc-vermittelte unspezifische Antikörperbindung an insgesamt acht Zellen durch Zugabe von 0,5 Mikrogramm Anti-CD16/32-Antikörper zu den sechs Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Waschen der Zellen mit 10 Milliliter kaltem Separationspuffer resuspendieren Sie die Zellen in weiteren 400 Mikroliter Separationspuffer. Geben Sie dann 100 Mikroliter CD11c-Mikroperlen zu den acht Gesamtzellen, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie die Zell-Perlen-Lösung für 15 Minuten im Kühlschrank.

Nachdem die ungebundenen Kügelchen mit 10 Milliliter kaltem Trennpuffer entfernt wurden, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren das Zellpellet in einem Milliliter kaltem Trennpuffer. Abschließend die Proben in den AutoMax pro-Separator geben und das P-O-S-S-E-L-D-Programm laufen lassen, um die CD11c-exprimierende Zellfraktion zu sammeln.

Inkubieren Sie die angereicherte Suspension der CD11c-positiven Zellen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit anti-CD11c-PEI-sieben und Antikörpern, die gegen die auf diesen Zellen vorhandenen MHC-Klasse-II-Moleküle gerichtet sind. Nach dem Waschen der Zellen mit kaltem PBS plus BSA resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter PBS plus BSA und filtrieren sie durch einen 40-Mikrometer-Nylon-Mesh-Filter. Geben Sie abschließend die gereinigten CD11c-positiven Zellen in ein FACS-Röhrchen zur späteren Quantifizierung in separaten leeren Röhrchen.

Fügen Sie 100 Mikroliter PBS mit BSA zu Fünf-Milliliter-Sammelröhrchen hinzu, um Schäden an den gereinigten Zellen zu verhindern, und sortieren Sie die gefilterte Zellsuspension mittels FACS. Halten Sie die gesammelten Zellen während des gesamten Zellsortierprozesses gekühlt. In diesen Dichtediagrammen befinden sich im Milzgewebe mehr als dreimal so viele konventionelle dendritische Zellen wie in der Lunge. Zusätzlich umfassen im Lungengewebe die CD11c-positiven Zellen eine Zellpopulation, die keine konventionellen dendritischen Zellen sind, wie durch die MHC-Klasse-II-niedrige Ereignisgruppe außerhalb des Tors für konventionelle dendritische Zellen dargestellt.

Auf der linken Seite der Abbildung, wie in diesem Dichtediagramm zu sehen ist, erhöht die magnetische Trennung der gesamten Lungenzellen die Anzahl konventioneller dendritischer Zellen von etwa 1,5 % der Gesamtzellzahl auf etwa 16,5 %. CD11c-positive Makrophagen mit niedriger Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen machen jedoch weiterhin über 70 % der Gesamtzellpopulation aus und verunreinigen somit erheblich die Reinheit der angereicherten Teilpopulation konventioneller dendritischer Zellen der Lunge in diesem Schritt des Isolationsverfahrens. Die Sortierung mittels FACS hingegen verbessert die Reinheit konventioneller dendritischer Zellen auf über 96 %, wie in der Mikroaufnahme oben rechts zu erkennen ist. Die CD11c-hoch, MHC-Klasse-II-hoch exprimierenden konventionellen dendritischen Zellen sind rundliche Zellen mit den typischen Dendriten, während die in der Mikroaufnahme unten rechts sichtbaren CD11c-hoch, MHC-Klasse-II-niedrig exprimierenden Zellen zelluläre Ausstülpungen aufweisen, die eher einer makrophagenartigen Morphologie entsprechen.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, das Lungengewebe und die Einzelzellpräparation unter den angegebenen Temperaturen zu handhaben. Dies ist entscheidend für die Erhaltung der Zellviabilität und der Ausbeute konventioneller dendritischer Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Dendritische-Zell-Subpopulationen aus der Mauslunge isoliert.

Die Isolierung von pulmonalen dendritischen Zellsubpopulationen stellt ein sehr nützliches Werkzeug dar, um Einblicke in die Funktionen dieser Zellen als Reaktion auf Atemwegspathogene und Umweltfaktoren zu gewinnen, die die Immunantwort des Wirts in der Lunge auslösen können.