Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Um die Translokation von Peptiden über Vesikelmembranen zu quantifizieren. Fluoreszenzmarkierte Lipidvesikel werden mit eingeschlossenem Trypsin hergestellt. Ein Trypsin-Inhibitor wird hinzugefügt, um die Aktivität jeglichen exogenen Trypsins zu hemmen, wodurch aktives Trypsin im Vesikel-Lumen verbleibt.

Erst wenn fluoreszenzmarkierte Peptide zu den Vesikeln hinzugefügt werden, wirken ihre fluoreszenten Markierungen als FRET-Donatoren und regen die fluoreszierenden Moleküle auf dem Vesikel zur Emission an. Wenn hingegen Proteine die Membran durchqueren, werden sie durch Trypsin verdaut, und das FRET-Signal geht verloren. Die spektrometrische Analyse zeigt das Ausmaß der Peptid-Translokation an, das sich als zeitabhängige Abnahme des FRET-Signals zwischen den Vesikeln und dem Peptid manifestiert.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, einschließlich anderer Lipidvesikel-Techniken und Verfahren zur Messung des Peptid-Eintritts in Zellen, liegt darin, dass sie Informationen über die Kinetik des Membraneintritts liefert und keine Hinzufügung eines fluoreszenten Labels zu den Peptiden erfordert, sofern diese ein Tryptophan enthalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Entwicklung und Konstruktion membranaktiver Peptide zu beantworten, beispielsweise, welche Eigenschaften für eine effektive Membrantranslokation notwendig sind. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, große unilamellare Lipidvesikel oder UUVs vorzubereiten, die als Membranmimik für den Assay dienen.

Mischen Sie zunächst Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerol und fünf Dimethylaminonaphthalin. Ein sulfonyl Phosphatidylethanolamin in Chloroform. Im Verhältnis 50:45:5 reichen gewöhnlich 0,376 Milligramm Gesamtlipid aus, um ausreichend Vesikel für einen einzelnen experimentellen oder Kontrollversuch herzustellen.

Bereiten Sie ein Vial als Versuchsprobe und ein weiteres als Kontrolle vor und verdampfen Sie das Chloroform unter Verwendung eines Stickstoffgasstroms. Die nach diesem Schritt verbleibenden getrockneten Lipide werden als Lipid-Kuchen bezeichnet. Trocknen Sie die Lipid-Kuchen neun bis 14 Stunden im Vakuum-Exsikkator.

Bereiten Sie als Nächstes eine 10 Millimolar-HEI-Stammlösung, eine 0,4 Millimolar-Schwein-Tripsin-Stammlösung und eine 4,0 Millimolar-Bowman-Birk-Trypsininhibitoren-Stammlösung vor. Die Einzelheiten zur Herstellung finden Sie im beigefügten Dokument. Geben Sie ein gleiches Volumen der 0,4 Millimolar-Tripsin-Stammlösung und der 10 Millimolar-HEIS-Pufferlösung zu den getrockneten Lipidkuchen hinzu. Vortexen Sie dann das Gefäß, um die multilamellaren Vesikel (MLVs) zu rekonstituieren. Um die Kontroll-MLVs zu rekonstituieren, geben Sie ein gleiches Volumen der 0,4 Millimolar-Tripsin-Stammlösung und der 4,0 Millimolar-Trypsininhibitor-Stammlösung zu den getrockneten Lipidkuchen hinzu und vortexen Sie wie zuvor.

Nachdem die mvs rekonstituiert wurden, überführen Sie die MLV-Lösungen von Glasgefäßen in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend unterziehen Sie die MLV-Lösungen fünf Gefrier-Tau-Zyklen, wobei zwischen flüssigem Stickstoff und einem 30 Grad Celsius warmen Wasserbad gewechselt wird. Bereiten Sie danach einen Lipid-Extruder vor, indem Sie zwei Filterträger in Heiss-Puffer befeuchten.

Danach jedes einzelne auf ein angefeuchtetes Teflon-Extruderstück legen und eine Nucleopore-Track-Etch-Membran mit 0,1-Mikrometer-Poren zwischen die beiden Teflon-Extruderstücke einlegen. Anschließend die Extruderstücke in einen metallenen Extruderzylinder geben und einen ringförmigen Abstandshalter über die beiden Extruderstücke setzen. Die metallene Verschlusskappe des Extruderzylinders festdrehen und diesen dann unter Verwendung einer 250-Mikroliter-Glaskolbenpipette in den Halter einsetzen.

Füllen Sie den Extruder-Hohlraum mit 500 Mikrolitern 10 Millimolar. Puffern Sie das Stück, um einen Verlust der Vesikelprobe zu vermeiden. Überführen Sie die Probe in einen 10-Milliliter-Becher.

Beladen Sie anschließend jede MLV-Probe in den Extruder und pressen Sie die Probe mindestens 21 Mal durch die Membran. Um eine gleichmäßige Ella-Vesikelgröße nach der Extrusion sicherzustellen, überführen Sie die großen ELLA-Lipidvesikel oder L UUVs in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie die UUVs bei vier Grad Celsius und verwenden Sie sie innerhalb von 48 Stunden.

Zur Bestimmung der LUV-Konzentration wird der Gesamtgehalt an Phosphor in der Probe ermittelt. Folgende Reagenzien sind gemäß den Angaben im beiliegenden schriftlichen Protokoll herzustellen: 8,9 normales H2SO4, 2,5 % (Gewicht/Volumen) Ammoniummolybdat, 6 % (Gewicht/Volumen) Ascorbinsäure und 0,65 mmolare Phosphatpufferlösung.

Bereiten Sie sechs Phosphor-Standards wie hier gezeigt vor. Bereiten Sie anschließend einen LUV-Blanks mit dem gleichen Volumen von 0,2 Millimolarer Trypsin- und 2,0 Millimolarer Bowman-BIR-Hemmerlösung vor, wie sie für die Kontrollen verwendet wurden. Dies erfolgt, um eventuelle ausgetrocknete Phosphorsalze im Bowman-B-Hemmerpulver zu korrigieren.

Pipettieren Sie anschließend etwa 0,1 Mikromol, gewöhnlich etwa 25 Mikroliter UUVs, im Dreifachansatz in Einweg-Glaskulturröhrchen. Geben Sie danach 450 Mikroliter 8,9 normaler H2SO4 in jedes der Proben-, Standard- und Blindröhrchen. Anschließend werden die Proben, Standards und Blindproben 25 Minuten lang in einen Ofen bei 175 bis 210 Grad Celsius gestellt.

Nachdem 25 Minuten verstrichen sind, nehmen Sie alle Reagenzgläser aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Geben Sie 150 µL 30 % H₂O₂-Lösung zu jedem der Reagenzgläser hinzu. Erhitzen Sie anschließend die Proben, Standards und Blindansätze weitere 30 Minuten bei 175 bis 210 °C.

Nach 30 Minuten die Proben, Standards und Blindansätze von der Hitze nehmen. Falls sich in einigen der Lösungen noch keine Entfärbung eingestellt hat, 50 Mikroliter H2O zu allen Reagenzgläsern hinzufügen und weitere 15 Minuten bei 175 bis 210 Grad Celsius erhitzen. Sobald die Lösungen farblos sind, jeweils 3,9 Milliliter nano-reines H2O, 0,5 Milliliter Ammoniummolydat-Lösung und 0,5 Milliliter Ascorbinsäure-Lösung zu jedem Reagenzglas hinzufügen.

Erhitzen Sie dann alle Reagenzgläser fünf bis sieben Minuten lang. Messen Sie im siedenden Wasserbad die Extinktion jedes Standards und jeder Probe bei 820 Nanometern mit einem Agilent 8 4 5 3 UV-Vis-Spektrophotometer. Die Konzentrationen der experimentellen und der Kontroll-LUVs müssen getrennt gemessen werden.

Das Reagenzglas, das 0,0 Millimol Phosphor enthält, sollte als Blindprobe für alle Standard- und experimentellen LUV-Proben verwendet werden. Das Reagenzglas, das 0,2 Millimolar Trypsin und 2,0 Millimolar Knochen- und Bir-Hemmlösung enthält, sollte als Blindprobe für die Kontroll-LUV-Probe verwendet werden. Die lineare Absorptionskurve in Abhängigkeit vom Phosphorgehalt der Standardproben sollte verwendet werden, um den Gesamtphosphorgehalt und die LUV-Konzentration der Proben zu berechnen.

Zur Herstellung der Peptidlösungen lösen Sie das Peptid in Oppu H2O; die in diesem Assay verwendeten Peptide müssen eine Tryptophan-Seite enthalten. Messen Sie die Absorption der Peptidlösung bei 282 Nanometern im Dreifachansatz. Berechnen Sie die Peptidkonzentration unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für Tryptophan von 5.700.

Inverse molare inverse Zentimeter verdünnen das Peptid in nano-reinem Wasser auf eine Endkonzentration von 30 Mikromolar und lagern es bei minus 20 Grad Celsius. Um die Translokation zu quantifizieren, bereiten Sie experimentelle und Kontrollproben in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Geben Sie jeder Lösung ausreichend UUVs zu, um eine Endkonzentration von 250 Mikromolar zu erreichen.

Fügen Sie so viel Bowman-BIR-Hemmlösung hinzu, dass der Hemmstoff eine Endkonzentration erreicht, die das 10-Fache der Tryin-Konzentration beträgt. Geben Sie ausreichend 10 Millimolar-Heis-Puffer hinzu, um das Endvolumen der Lösung auf 450 Mikroliter einzustellen. Geben Sie 50 Mikroliter Peptidlösung in eine Stana-Micro-Chords-Fluorimeterzelle und platzieren Sie diese in dem Spektrophotometerprogramm.

Ein fluoreszierendes Spektrophotometer, um ein 25-minütiges Fluoreszenz-Kinetik-Experiment durchzuführen, bei dem mindestens einmal pro Sekunde eine Fluoreszenzablesung bei einer Anregungswellenlänge von 280 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 525 Nanometern bei 25 Grad Celsius aufgezeichnet wird. Bei hoher PMT-Empfindlichkeit die experimentelle oder Kontrollprobe zur Peptidlösung im qve hinzufügen. Dadurch sollte die endgültige Peptidkonzentration drei Mikromolar betragen; unmittelbar danach das Fluoreszenz-Kinetik-Experiment beginnen.

Nachdem sowohl die experimentellen als auch die Kontrollproben durchgelaufen sind, berechnen Sie die Translokationsraten wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. Das Verhältnis zwischen s und Peptid ist hoch genug, um sicherzustellen, dass praktisch alle intakten Peptide nahe genug an einer Dansyl-Gruppe liegen, um ein FRET-Signal zu erzeugen, selbst wenn keines von ihnen in die Vesikel transloziert ist. Dies steht im Einklang mit dem ähnlichen FRET, das unter Kontrollbedingungen für Peptide beobachtet wird, die in Vesikel translozieren und solche, die dies nicht tun.

Translokationsassays wurden wie in diesem Video beschrieben durchgeführt. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse eines repräsentativen Peptids, das eine robuste Translokation zeigte. Das Signal in diesem Experiment, dargestellt durch die schwarze Kurve, zeigt einen deutlichen Abfall des FRET-Signals.

Im Laufe der Zeit weisen höhere Translokationsraten Peptide auf, die effizient translozieren. Das Translokationsverhältnis für die hier gezeigten zellpenetrierenden Peptide beträgt 1,19; wöchentlich übersetzende Peptide weisen Translokationsraten nahe eins auf, um den potenziellen Verlust des FRET-Signals aufgrund unvollständiger Trips, Hemmung oder anderer Faktoren, die nicht mit der Translokationsfähigkeit zusammenhängen, auszugleichen. Das FRET-Signal zwischen Peptid und UUVs, die sowohl Trypsin als auch den Bowman-BRK-Trypsin-Inhibitor enthalten, wird gemessen.

Dies ist als graue Kurve dargestellt. Die Bedeutung des Kontrollexperiments mit UUVs, die Trypsininhibitor enthalten, wird durch die hier gezeigten Daten verdeutlicht. In diesem Fall nahm das Peptidsignal im experimentellen Probensatz, das durch die schwarze Kurve repräsentiert wird, um einen ähnlichen Betrag ab wie in der vorherigen Abbildung.

Jedoch zeigt die Kontrollprobe einen schnelleren Abfall für dieses Peptid, sodass seine Netto-Translokation geringer ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lipidvesikel herstellt und die Translokation von Tryptophan enthaltenden Peptiden misst. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Datensammlung unmittelbar nach dem Mischen von Peptid und Vesikeln zu beginnen.