Die Beurteilung Somatische Hypermutation in Ramos B-Zellen nach Überexpression oder Knockdown von spezifischen Genen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Expression eines Gens zu verändern und anschließend dessen Auswirkung auf die somatische Hypermutation zu messen. Dies wird erreicht, indem Bosque-23-Zellen transfiziert werden, um virale Partikel zu erzeugen, die entweder ein Überexpressionskonstrukt oder ein Konstrukt mit SHRA enthalten. In einem zweiten Schritt werden Ramo-Zellen mit den Viren infiziert, was entweder zu einer Herabregulation oder Überexpression des Gens der Untersuchung führt.

Anschließend werden einzelne Zellklone mehrere Wochen lang kultiviert, um den Zellen Zeit für die Anhäufung von Mutationen zu geben. Schließlich kann der Effekt der veränderten Genexpression anhand der Analyse des IgM-Verlusts und der Sequenzierung der IG-Gene bestimmt werden. Diese Methode könnte dabei helfen, neue Faktoren zu identifizieren, die an der Antikörper-Diversifizierung beteiligt sind.

Beginnen Sie damit, 600 µL warmes, bebrütetes DMEM in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen umzupipettieren. Achten Sie dann darauf, genau 30 µL FUgene6 direkt in das Medium zu pipettieren, die Lösung weniger als eine Sekunde lang zu verwirbeln und anschließend das Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren. Fügen Sie danach für eine Lentivirusinfektion wie diese 6 µg S-H-R-N-A-Konstrukt sowie jeweils 1,5 µg P-V-S-V-G-P-M-D-L-G-P-R-R-E und PRSV rev zur DMEM-FUgene6-Mischung hinzu.

Vortexen Sie die Lösung kurz und inkubieren Sie danach erneut zwei Bit bei Raumtemperatur, diesmal jedoch 25 Minuten lang. Transfizieren Sie schließlich eine Bosque-23-Zellkultur bei 50 bis 60 % Konfluenz mit dem D-N-A-D-M-E-M FU Gen sechs. Mischen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.

Am nächsten Tag fügen Sie fünf Milliliter DMEM zu den Zellen hinzu und stellen Sie diese für weitere 24 Stunden in den Inkubator zurück. Am dritten Tag nach der Transfektion entnehmen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze 10 Milliliter Medium aus den transfizierten Box-23-Zellen und befestigen anschließend einen 0,45-Mikrometer-Filter an das Ende der Spritze. Sammeln Sie das filtrierte Medium in einem sauberen 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen. 24 Stunden vor der Infektion säen Sie zwei Milliliter mit zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter RAMO-Zellen in komplettes RPMI in eine 6-Well-Platte aus. Fügen Sie am folgenden Tag drei Mikroliter einer 10 Mikrogramm pro Milliliter Polybrain-Lösung und ein Milliliter Virus zu den RAMO-Zellen hinzu und mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren gründlich.

Fügen Sie für die nicht infizierte Kontrolle ein Milliliter vollständiges RPMI und drei Mikroliter Poly-Brain in eine der Vertiefungen anstelle des Virus hinzu. Infizieren Sie außerdem eine Vertiefung mit einer passenden negativen Kontrolle und eine weitere mit einem Vektor, der GFP enthält, um die Infektionsrate per FACS zu bestimmen. Zentrifugieren Sie nun die 6-Loch-Platte 90 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3000 ×g und stellen Sie die Platte anschließend für 48 Stunden in den Inkubator.

Spinne die infizierten Zellen abschließend vier Minuten lang bei 400 ×g in einem 15-Milliliter-Polypropylenröhrchen ab. Aspiriere das Medium bei Raumtemperatur, wobei darauf zu achten ist, das Zellpellet nicht aufzuwirbeln, und resuspendiere die Zellen in frischem RPMI. Nach der Zellzählung stelle eine Suspension der infizierten Zellen auf 10 Zellen pro Milliliter ein.

In einer Lösung aus RPMI-konditioniertem Medium und FBS auf ein Endvolumen von 10 Milliliter für jede beimpfte Platte. Anschließend mit einer Mehrkanalpipette 96-Well-Platten mit je 100 Mikroliter der verdünnten Zellen pro Vertiefung beimpfen.

Nach einer Inkubation der Platten für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid verwenden Sie ein Mikroskop, um jedes einzelne Loch zu überprüfen. Um das Vorhandensein von Zellen zu bestätigen, da die geeignete Tiefe zur Identifizierung einzelner Zellen schwer zu bestimmen sein kann. Versuchen Sie zunächst, den Fokus auf die am Boden der 96-Loch-Platte angebrachten Lochnummern zu legen.

Danach nach zwei Wochen versuchen, eine Zelle zu finden. Mit dauerhaftem Tinte nach Zellkolonien entlang der Ränder der Vertiefungen suchen. Die Vertiefungen mit kräftigem Zellwachstum markieren und anschließend die Kolonien in 24-Loch-Platten mit einem Milliliter RPMI zur weiteren Inkubation übertragen.

Nach mehreren Tagen des Wachstums überführen Sie die Zellen in eine 6-Loch-Platte und inkubieren die Kulturen weiter. Drei Wochen nach der Aussaat der Zellkolonien in der 6-Loch-Platte Eloqua fünf mal 10 hoch 5 Zellen aus jedem Loch in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zu diesem Zeitpunkt isolieren Sie außerdem die Zellen aus jedem der Kontroll- und HRNA-Knockdown-Löcher sowie eine Probe für eine unbehandelte Kontrolle.

Zentrifugieren Sie nun alle Zellen zweimal bei 400 G für vier Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie die Zellen nach dem ersten Spin mit einem Milliliter PBS. Nach dem zweiten Waschschritt suspendieren wir das Pellet der unbehandelten Kontrolle in 50 Mikrolitern PBS und die anderen Pellets in PBS plus einer 1:20-Verdünnung des mit PE markierten anti-humanen IgM-Antikörpers. Anschließend inkubieren Sie alle Zellproben nach zweimaligem erneutem Waschen der Zellen mit PBS wie zuvor eine Stunde lang auf Eis, entfernen den Überstand und resuspendieren alle Pellets in 100 Mikrolitern PBS.

Überführen Sie anschließend die resuspendierten gefärbten und die Kontrollzellen ohne Färbung in FACS-Röhrchen und analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie. Vergleichen Sie den Prozentsatz der IgM-negativen Zellen der Kontrollen mit denen der S-H-R-N-A-Knockdown-Zellen. Ein retroviraler Überexpressionsträger für ein ID wurde in Bosque-23-Zellen transfiziert.

Die Viren wurden anschließend gewonnen und zur Infektion von Ramos-Zellen verwendet, sowohl vom Wildtyp (wt) als auch von Zellen mit Überexpression von a ID. Die a ID.High-Zellen wurden einzeln aufgesiedelt und drei Wochen lang kultiviert. Danach wurden sie mittels qRT-PCR auf Genexpression analysiert. Wie erwartet zeigen die qRT-PCR-Ergebnisse eine deutliche Zunahme der a ID-Expression nach Infektion der Zellen mit einem a ID-Überexpressionsvektor. Der Verlust von IGM auf den infizierten Zellen wurde ebenfalls mittels FACS evaluiert. Die Oberflächen-IgM-Menge wurde mittels FACS zum Zeitpunkt von drei Wochen aus der vorherigen Abbildung gemessen, und der Prozentsatz des IGM-Verlusts wurde für Wildtyp- und a ID-hohe Zellen berechnet und hier grafisch dargestellt. Wie erwartet wiesen die a ID-überexprimierenden Zellen einen stärkeren Verlust an Oberflächen-IgM auf.

In einem separaten Experiment wurden Lentiviren, die entweder eine irrelevante S-H-R-N-A als Kontrolle oder eine S-H-R-N-A gegen einen hochgradig genauen DNA-Reparaturfaktor enthielten, der vor SHM schützen soll, in Bosque-23-Zellen hergestellt. Die Lentiviren wurden anschließend in einen a-ID-hohen Klon von Ramos-Zellen infiziert. Erneut wurde die Genexpression analysiert und erneut zeigte sich, wie erwartet, ein Abfall der Expression des DNA-Reparaturfaktors in Gegenwart einer gezielten S-H-R-N-A gegen diesen Faktor. Außerdem wurde nach drei Wochen der Verlust von i GM in den Einzelzellklonen untersucht, da angenommen wird, dass der Reparaturfaktor einen Schutz vor Mutationen während der SHM bietet. Ein Anstieg des IGM-Verlusts und der SHM im Fehlen des Faktors tritt auf, wie in dieser Abbildung zu sehen ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man virale Infektionen mit OVEREXPRESSION- oder S-H-R-N-A-haltigen Konstrukten in der RAW-B-Zelllinie durchführt und anschließend die somatische Hypermutation in diesen Zellen misst.