Name: Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Lernen Sie die Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen durch quantitative Echtzeit-PCR und HPLC. Diese Methoden ermöglichen die gleichzeitige Quantifizierung von mRNA- und Proteinebenen.

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Diese Arbeit wird durch NIH GM085261 und ein Georgien Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (zu YF) unterstützt.

<ol><li>Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+linker+histones+are+essential+for+mouse+development+and+affect+nucleosome+spacing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo.</a> Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).</li>
<li>Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+linker+histone+in+chromatin+structure+and+function%3A+H1+stoichiometry+and+nucleosome+repeat+length%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length.</a> Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).</li>
<li>Shen, X., Gorovsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linker+histone+H1+regulates+specific+gene+expression+but+not+global+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.</a> Cell. 86, 475-483 (1996).</li>
<li>Alami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+linker-histone+subtypes+differentially+affect+gene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).</li>
<li>Happel, N., Doenecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+and+its+isoforms%3A+contribution+to+chromatin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function.</a> Gene. 431, 1-12 (2009).</li>
<li>Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+subtypes+differentially+modulate+chromatin+condensation+without+preventing+ATP-dependent+remodeling+by+SWI%2FSNF+or+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF.</a> PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).</li>
<li>Khadake, J. R., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+chromatin-condensing+properties+of+rat+testes+H1a+and+H1t+compared+to+those+of+rat+liver+H1bdec%3B+H1t+is+a+poor+condenser+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin.</a> Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).</li>
<li>Orrego, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+affinity+of+mammalian+histone+H1+somatic+subtypes+for+DNA+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin.</a> BMC Biol. 5, 22-22 (2007).</li>
<li>Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H1+family+histones+in+the+nucleus.+Control+of+binding+and+localization+by+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).</li>
<li>Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+histone+H1+genes%3A+gene+organization+and+differential+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation.</a> J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).</li>
<li>Brown, D. T., Sittman, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+through+overexpression+and+tagging+of+the+variant+type+of+the+mouse+H1e+and+H1c+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes.</a> J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).</li>
<li>Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+somatic+H1+subtypes+are+dispensable+for+mouse+development+even+in+mice+lacking+the+H1%280%29+replacement+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype.</a> Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).</li>
<li>Fan, Y., Skoultchi, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+H1+linker+histone+subtypes+and+their+functions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice.</a> Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6, 986-994 (1996).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Menge der hier vorgestellten Assays ermöglichen eine umfassende Analyse der Expression von Säugetier-Histon-Subtypen. Sorgfältig geplante und qRT-PCR-Assays bieten hochempfindliche und genaue Messungen der RNA-Nachrichten von Säugetier-Histon H1-Gene. Der kritische Teil qRT-PCR-Assays für Histon-Subtyp Gene ist die Herstellung von cDNA unter Verwendung von zufälligen Primers Reverse Transkription. mRNA der meisten Histone, einschließlich der meisten Gene H1, enthalten keine langen Poly-A-Schwanz in anderen zelluläre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> RNase Zap </td><td> Applied Biosystems </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> Trizolreagenz </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-018 </td></tr><tr><td> SuperScriptIII </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> Absolutem Ethanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2818-4 </td></tr><tr><td> IQ SYBR Green </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8880 </td></tr><tr><td> RNeasy Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> Ich Deoxyribonuclease </td><td> Sigma </td><td> AMP-D1 </td></tr><tr><td> Microseal 96-well PCR-Platte </td><td> Bio-Rad </td><td> MSP-9605 </td></tr><tr><td> Microseal &#39;B&#39; Klebedichtungen </td><td> Bio-Rad </td><td> MSB-1001 </td&gt; </tr><tr><td> Saccharose </td><td> Agros Organics </td><td> AC40594 </td></tr><tr><td> Dinatriumhydrogenphosphat Heptahydrat (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP332 </td></tr><tr><td> Natriumchlorid (NaCl) </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB01915 </td></tr><tr><td> Heptahydrat Natriumdihydrogenphosphat (NaH 2 PO 4 · 7H2O) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP-330 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310 </td></tr><tr><td> Kompletter Mini-Proteinase-Inhibitor Cocktail Tablette </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836153001 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E-5134 </td></tr><tr><td> Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB01620 </td></tr><tr><td> Nonidet-40 (NP-40) </td&gt; <td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB01425 </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid (KCl) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366 </td></tr><tr><td> Tris [hydroxymethyl aminomethan] </td><td> Amerikanischen Bioanalytische </td><td> AB02000 </td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid (MgCl2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214 </td></tr><tr><td> Schwefelsäure (H2SO4) </td><td> VWR </td><td> VW3648-3 </td></tr><tr><td> Ammoniumhydroxid (NH 4 OH) </td><td> Agros Organics </td><td> AC42330 </td></tr><tr><td> Bradford-Protein-Assay </td><td> Bio-Rad </td><td> 500-0001 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> EMD </td><td> AX0145-1 </td></tr><tr><td> Trifluoressigsäure (TFA) </td><td> JTBaker </td><td> 9470-01 </td></tr></tbody></table>

expressionsanalyse von säugetier-linker-histon-subtypen

Expression Analysis of Mammalian Linker-histone Subtypes

Histon H1 bindet an den Nukleosomen Kernteilchen und Linker-DNA, die Erleichterung Faltung von Chromatin in Struktur höherer Ordnung. H1 ist für Säugetier-Entwicklung ein wesentlicher und reguliert die Genexpression in vivo 2-4. Unter den hoch konservierte Histon-Proteine ​​ist die Familie von H1 Linker Histonen die heterogene Gruppe. Es gibt 11 H1-Subtypen bei Säugetieren, die differentiell während der Entwicklung und in verschiedenen Zelltypen geregelt sind. Diese H1 Subtypen umfassen 5 somatischen H1s (H1a-e), der Ersatz H1 0, 4 Keimzellen spezifische H1 Subtypen und H1x 5. Das Vorhandensein von mehreren H1 Subtypen, die DNA-Bindungsaffinität und Chromatin Verdichtung Fähigkeit unterscheiden 6-9 bietet eine zusätzliche Modulation der Chromatinstruktur Funktion. Somit ist die quantitative Analyse der Expression einzelnen H1 Subtypen, sowohl von mRNA und Proteinen, zum besseren Verständnis der Regulation der höheren erforderlichenchromosomaler Struktur und Funktion. Hier beschreiben wir eine Reihe von Tests zur Analyse der Expression von einzelnen H1 Subtypen (1) ausgebildet ist. mRNA-Expression von verschiedenen Genen H1 Variante wird durch eine Reihe von hochempfindlichen und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)-Assays, die schneller, genauer und erfordern viel weniger Proben im Vergleich zu der alternativen Ansatz der Northern-Blot-Analyse gemessen. Anders als die meisten anderen zellulären mRNA-Einträge, fehlt mRNAs für die meisten Histone, einschließlich der Mehrheit der Gene H1, eine lange polyA-Schwanz, aber auch eine Stamm-Schleifen-Struktur am 3&#39;-untranslatierten Region (UTR) 10. Daher werden cDNAs aus Gesamt-RNA durch reverse Transkription unter Verwendung von Zufallsprimern statt Oligo-dT-Primer hergestellt. Echtzeit PCR mit Primern, die an jedem H1 Subtypen (Tabelle 1) werden durchgeführt, um eine möglichst quantitative Messung der mRNA-Spiegel von einzelnen H1-Subtyp zu erhaltens. Die Expression von Housekeeping-Gene werden als Steuerelemente für Normalisierung analysiert. Die relative Häufigkeit der Proteine ​​des H1-Subtyp und Histone wird durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (RP-HPLC)-Analyse von Gesamt Histone aus Säugerzellen 11-13 extrahiert wurde. Die HPLC-Methode und Elution hier beschriebenen Bedingungen geben optimale Trennungen von Maus H1-Subtypen. Durch die Quantifizierung der HPLC-Profil, berechnen wir den relativen Anteil der einzelnen Subtypen H1 H1 innerhalb der Familie, sowie Bestimmung der H1 um Nukleosomen-Verhältnis in den Zellen.

Wir beschreiben eine Reihe von Tests zur Expression von H1 Linker Histonen zu analysieren. mRNA einzelner Gene H1 werden quantitativ durch zufällige Primer basieren reverse Transkription durch real-time PCR gefolgt gemessen, während Protein Quantifizierung der H1-Histone durch HPLC-Analyse erreicht wird.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Das Linker-Histon H1 bindet an das Nukleosomen-Kernpartikel und die Linker-DNA und erleichtert so die Faltung des Chromatins in eine Struktur höherer Ordnung. H1 ist essenziell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expressionslevel der Histon-H1-Subtypen durch die Analyse der H1-mRNA-Level sowie die Messung der H1-Proteinlevel zu untersuchen. Für die mRNA-Analyse wird zunächst Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen oder Mausgewebe extrahiert. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in einer reversen Transkription der Gesamt-RNA mit zufälligen Primern, gefolgt von quantitativen Echtzeit-PCR-Assays für jedes der H1-Subtyp-Gene. Die Analyse des Histon-H1-Proteins beginnt mit der Herstellung von Gesamthiston-Extrakten aus Mausgewebe oder kultivierten Zellen.Anschließend erfolgen Fraktionierung und Quantifizierung jedes H-eins-Subtyps sowie des Kern-Histon-H2B mittels umkehrphasiger HPLC-Analyse. Letztendlich zeigen die quantitative Echtzeit-PCR und die umkehrphasige HPLC-Analyse die Expressionsniveaus sowohl von mRNA als auch von Proteinen für jeden H-eins-Subtyp.Wir sind Doktoranden des Dr. Yuhan FES-Labors an der School of Biology des Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen eine Reihe umfassender Analysen zur Untersuchung der Expression von H-ones in mammalischen H-one-Subtypen. Mithilfe dieser Analysen können Sie quantit

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Forschung

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Biology

Biologie

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Dieses Protokoll beschreibt einen voll integrierten Workflow für die Charakterisierung von Histon-post-translationale Modifikationen mittels Massenspektrometrie (MS). Der Workflow umfasst Histon-Reinigung aus Zellkulturen oder Geweben, Histon-Derivatisierung und Verdauung, MS-Analyse unter Verwendung von Nano-Flow-Flüssigkeitschromatographie und Anweisungen für die Datenanalyse. 3 Tage - Das Protokoll wird innerhalb von 2 für die Fertigstellung konzipiert.

Komplette Workflow zur Analyse von Histon-post-translationale Modifikationen Mit Bottom-up-Massenspektrometrie: Von Histone Extraktion in Datenanalyse

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Anwendung der Peptid-Microarray-Technologie auf die Spezifitätsprofilierung von Antikörpern, die Histone und ihre posttranslationalen Modifikationen erkennen.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein dreidimensionales Zellkultursystem verwendet werden kann, um Chromatinmodifikationen in einem nahezu physiologischen Zustand zu modellieren, zu behandeln und zu analysieren.

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Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Diese Methode beschreibt eine einfache und schnelle Strategie zur Charakterisierung und Untersuchung von Histon-Proteoformen.

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Lernen Sie die Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen durch quantitative Echtzeit-PCR und HPLC. Diese Methoden ermöglichen die gleichzeitige Quantifizierung von mRNA- und Proteinebenen.

Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

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