Expressionsanalyse von Säugetier-Linker-Histon-Subtypen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expressionslevel der Histon-H1-Subtypen durch die Analyse der H1-mRNA-Level sowie die Messung der H1-Proteinlevel zu untersuchen. Für die mRNA-Analyse wird zunächst Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen oder Mausgewebe extrahiert. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in einer reversen Transkription der Gesamt-RNA mit zufälligen Primern, gefolgt von quantitativen Echtzeit-PCR-Assays für jedes der H1-Subtyp-Gene. Die Analyse des Histon-H1-Proteins beginnt mit der Herstellung von Gesamthiston-Extrakten aus Mausgewebe oder kultivierten Zellen.

Anschließend erfolgen Fraktionierung und Quantifizierung jedes H-eins-Subtyps sowie des Kern-Histon-H2B mittels umkehrphasiger HPLC-Analyse. Letztendlich zeigen die quantitative Echtzeit-PCR und die umkehrphasige HPLC-Analyse die Expressionsniveaus sowohl von mRNA als auch von Proteinen für jeden H-eins-Subtyp.

Wir sind Doktoranden des Dr. Yuhan FES-Labors an der School of Biology des Georgia Institute of Technology. Heute zeigen wir Ihnen eine Reihe umfassender Analysen zur Untersuchung der Expression von H-ones in mammalischen H-one-Subtypen. Mithilfe dieser Analysen können Sie quantitative Messungen der Expressionsniveaus sowohl von mRNA als auch von Protein in verschiedenen H-one-Subtypen erhalten.

Histon H1 ist das wichtigste chromosomale Strukturprotein, das die höhere Chromatin-Faltung ermöglicht, wobei mehrere Histon-H1-Varianten existieren, die während der Zell-Differenzierung und Entwicklung unterschiedlich exprimiert werden. Die Expressionsprofilierung dieser H1-Subtypen ist notwendig, um die Regulation der höheren Chromatin-Struktur und -funktion besser zu verstehen. Beginnen wir also.

Vor der RNA-Extraktion sollten alle Arbeitsflächen und Pipetten mit 70 %igem Ethanol abgewischt und mit einer RNA-Deskontaminationslösung behandelt werden. Diese Vorgehensweise verringert die Wahrscheinlichkeit einer RNA-Kontamination und -Degradation. Zusätzlich sollten bei allen Schritten Handschuhe getragen werden. Um die RNA-Extraktion aus anheftenden Zellkulturen zu beginnen, das Kulturmedium abpipettieren und die Zellen mit PBS spülen.

Entfernen Sie dann das PBS aus den Mulden. Es ist ausreichend Triol-Reagenz erforderlich, um RNA in hoher Qualität zu erhalten. Verwenden Sie einen Milliliter Triol-Reagenz, um RNA aus einer Mulde einer sechs-Mulden-Platte zu isolieren. Führen Sie anschließend die RNA-Extraktion gemäß der Herstelleranleitung für das Triol-Reagenz durch. Nach der RNA-Extraktion bestimmen Sie die RNA-Konzentration mithilfe des NanoDrop 1000.

Die typische Ausbeute liegt zwischen fünf und 15 Mikrogramm RNA pro 1 × 10⁶ kultivierte Zellen. Bevor mit der cDNA-Synthese fortgefahren wird, sollte die RNA-Qualität mittels GE-Elektrophorese analysiert werden, um eine mögliche Kontamination der RNA mit geringen Mengen genomischer DNA auszuschließen. Behandeln Sie die RNA-Proben gemäß den Herstelleranweisungen mit DNA-freier DNase zur Umkehrtranskription der Gesamt-RNA in cDNA. Verwenden Sie das SuperScript III First-Strand-Synthese-System gemäß den Herstelleranweisungen. Da die mRNA der meisten H1-Gene keine Poly-A-Schwänze aufweist, ist es entscheidend, statt Oligo-dT als Primer zufällige Hexamer zu verwenden.

Für die cDNA-Synthese kann nach der reversen Transkription die cDNA-Amplifikation mittels qRT-PCR erfolgen, die durch das Vorhandensein des Cybergreen-Farbstoffs vor dem qRT-PCR-Assay nachgewiesen wird. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer, spezifisch für jedes H1-Gen und das interne Referenzgen, wurden entworfen, und die Primer-Effizienz wurde mittels Standardkurvenmethode getestet, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Fahren Sie fort, indem Sie jede PCR-Reaktion vorbereiten, indem Sie Primer, cDNA und Cybergreen-Supermix miteinander vermischt werden.

Mischen Sie die Ansätze gründlich in einer 96-Well-Mikrotiterplatte und verwenden Sie mikro-tight haftende Klebesiegel, um sicherzustellen, dass die Platte abgedichtet ist. Vortexen Sie anschließend die versiegelte Platte und zentrifugieren Sie die Reaktionsgemische kurz. Stellen Sie die Platte dann in das My IQ Single-Color-Echtzeit-PCR-Erkennungssystem für die QPCR.

Richten Sie die QPCR-Bedingungen ein und führen Sie den Lauf wie im Anschluss an die Amplifikation beschrieben durch. Überprüfen Sie die Amplifikationskurven auf die PCR-Effizienz und die Schwellenzyklus- oder CT-Werte. Die Schwellenlinie kann automatisch durch die Softwareversion 2.0 des IQ-five-Optiksystems gesetzt werden.

Da Cyber Green jede doppelsträngige DNA nachweist, ist es entscheidend, nach der QPCR eine Schmelzkurvenanalyse durchzuführen, um sicherzustellen, dass das gewünschte Amplikon – und nicht Primer-Dimere oder Kontaminationen – amplifiziert und detektiert wird. Für das Schmelzkurvenanalyse-Programm wird das QPCR-Gerät so programmiert, dass es die Proben von 55 Grad Celsius auf 95 Grad Celsius in 0,5-Grad-Celsius-Schritten erhitzt und dabei Daten sammelt. Da die Temperatur oder TM von doppelsträngiger DNA von der Länge des Amplikons und dem GC-Gehalt abhängt, weisen unterschiedliche Amplikone unterschiedliche Tms auf.

Untersuchen Sie die abgeleiteten Schmelzkurven der QPCR-Produkte, um die spezifische Schmelztemperatur der gewünschten Amplifikate sowie das Fehlen von störenden Amplifikationsprodukten zu bestätigen, wie beispielsweise die hier gezeigten Schmelzkurven der H one A-PCR-Amplifikate mit einer TM von 86 Grad Celsius. Fahren Sie fort mit der Analyse der QPCR-Daten mithilfe der IQ-five-Optical-System-Software. Normalisieren Sie die Expressionswerte der H one-Isoform-Gene anhand der Expression von Housekeeping-Genen, um relative Expressionslevel der H one-Gene zu erhalten.

Nachdem das Organ der Wahl von einer euthanasierten Maus präpariert wurde, spülen Sie es mit eiskaltem PBS ab. In dieser Demonstration erfolgt die Aufbereitung der Gesamt-Histonfraktion an der Leber. Nach der Wäsche wird das Gewebe mit einer Rasierklinge in Stücke zerkleinert. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe in einen Dounce-Homogenisator und geben Sie Sucrose-Puffer zum Homogenisator hinzu, und zwar in einem Volumen von 10 Milliliter pro Gramm Gewebe.

Homogenisieren Sie das Gewebe mit 10 bis 15 Hubstößen. Nach dem Übertragen der Homogenate in ein 15-Milliliter-Röhrchen erfolgt die Zentrifugation der Proben bei 500 U/min für 30 Sekunden. Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig in ein neues Röhrchen überführt und bei 2000 U/min für fünf Minuten zentrifugiert.

Um die Zellen zu pelletieren, resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter Saccharose-Puffer, ergänzt mit 0,5 % NP-40. Überführen Sie die Probe in einen Dounce-Homogenisator und führen Sie 10 Stöße innerhalb einer 20-minütigen Inkubation durch. An diesem Punkt werden die Zellkerne erhalten.

Untersuchen Sie die Qualität der Kerne unter dem Mikroskop. Nachdem die Kerne durch Zentrifugation bei 2000 U/min fünf Minuten lang pelletiert wurden, kann der Überstand verworfen werden. Anschließend resuspendieren Sie das Kernpellet in drei Milliliter Puffer mit hohem Salzgehalt pro Gramm Gewebe.

Überführen Sie die Probe in einen kleinen Down-Homogenisator und homogenisieren Sie sie mit fünf bis zehn Hubbewegungen. Verteilen Sie die Suspension auf drei Eppendorf-Röhrchen. Inkubieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang auf Eis.

Im Anschluss an die Inkubation Zentrifugation bei 14.000 U/min für 10 Minuten durchführen, um das Chromatin zu pelletieren. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die gesamten Histone extrahiert, indem 0,8 Milliliter 0,2 normaler Schwefelsäure zu jedem Chromatinpellet gegeben werden. Mit einem Enton-Probenglasstößel nach unten stossen, um das Pellet gründlich zu zerkleinern, bis das Pellet vollständig dissoziiert ist.

Inkubieren Sie die Proben über Nacht auf einer rotierenden Plattform bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation überführen Sie das Überstand in zwei EOR-Röhrchen. Geben Sie zu jedem Röhrchen 2,5 Volumina eiskaltes Ethanol hinzu.

Lagern Sie die Proben am folgenden Tag über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie anschließend bei 14.000 U/min für 10 Minuten, um die Gesamthistonfraktion zu pelletieren, und entfernen Sie den Überstand. Nach dreimaligem Waschen des Pellets mit 70 %igem Ethanol lassen Sie die offenen Röhrchen 20 bis 30 Minuten lang an der Luft trocknen und führen Sie unmittelbar die HPLC-Analyse durch. Suspendieren Sie den Histonsediment sofort in dem je nach Kapazität der umgekehrten Phase-Säule und des HPLC-Geräts empfohlenen Volumen zweifach destilliertem Wasser und zentrifugieren Sie bei 14.000 U/min für fünf Minuten.

Um unlösliche Rückstände zu entfernen, injizieren Sie 50 bis 100 Mikrogramm Gesamthistonprotein auf die umgekehrte Phase-Säule des HPLC-Systems, beispielsweise den GE ACTA Purifier UPC 900. Beladen. Eine überschüssige Menge an Protein sollte vermieden werden, um ein Verstopfen der Säule zu verhindern. Fraktion acht, das Linker-Histon und die Kernhistone werden mit einem ansteigenden Acetonitril-Gradienten, wie im schriftlichen Protokoll angegeben, eluiert. Der Durchfluss wird bei 214 Nanometern überwacht und die HPLC-Profile werden aufgezeichnet und analysiert. Die Proteinfraktionen können außerdem mit dem GE FRAC nine 20 Fraktionensammler automatisch gesammelt werden, um weitere Analysen durchzuführen.

Hier gezeigte typische Amplifikationskurven von H1-A-Q-P-C-R-Reaktionen unter Verwendung von cDNA, die aus Maus-, Leber- und embryonalen Stammzellen der Maus hergestellt wurde. Die Auswertung des Amplifikationsplots zeigt, dass die dreifachen QPCR-Reaktionen jeder Probe konsistente Signale mit nahezu identischen CT-Werten ergaben, was auf eine hohe Reproduzierbarkeit hinweist. Das Fehlen einer Anreicherung von Amplifikaten in den RT-minus-QPCR-Reaktionen weist darauf hin, dass eine Kontamination mit genomischer DNA nicht vorhanden war oder nur minimal vorlag. Unter Verwendung der CT-Werte der H1-Gene und der Housekeeping-Gene wurden die relativen RNA-Expressionsniveaus jedes H1-Gens berechnet.

Die hier gezeigten Diagramme sind Beispiele für berechnete Ergebnisse der Gene H one A und H one zero. Die relativen Expressionslevel von H one A-mRNA sind in embryonalen Stammzellen der Maus höher als in der Leber der Maus, während die Expression von H one zero in der Leber deutlich höher ist als in den embryonalen Stammzellen. Der Unterschied in der Expression von H one A oder H one zero in embryonalen Stammzellen der Maus im Vergleich zur adulten Leber der Maus ergibt sich ebenfalls aus den HPLC-Profilen der Histone.

H ein null. Das differenzierungsspezifische H ein wird in großer Menge in der Leber der erwachsenen Maus angereichert. Im Gegensatz dazu ist das H ein null-Protein in undifferenzierten embryonalen Stammzellen der Maus nahezu nicht vorhanden.

Andererseits wird H one A in embryonalen Stammzellen stark exprimiert, liegt aber im adulten Mauslebergewebe in geringen Mengen vor, wie die Quantifizierung der H one-Peaks zeigt. Im HPLC-Profildiagramm wird der relative Anteil jedes einzelnen H one-Subtyps innerhalb der H one-Familie in der adulten Mausleber bestimmt. Darüber hinaus können die Werte der einzelnen H one-Subtypen pro Nukleosom aus dem Verhältnis des normalisierten Peakwerts der Absorption bei 214 Nanometern der entsprechenden H one-Subtypen zur Hälfte des normalisierten Werts für H zwei B berechnet werden. Dieser Wert kann ebenso für das gesamte H one pro Nukleosom ermittelt werden.

Einmal beherrscht, kann die Q-R-T-P-C-R-Analyse eines H1-Subtyps an einem Tag durchgeführt werden, und die Histon-Extraktion sowie die HPRC-Analyse können innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden, sofern alles ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Q-R-T-P-C-R-Analyse von Histon H1-Genen ist es entscheidend, eine RNA-Degradation zu vermeiden, Kontaminationen mit genomischer DNA auszuschließen und vor allem zufällige Primer in die Reverse-Transkriptionsreaktion einzubringen. Während der Histon-Extraktion und der HPOC-Analyse ist es wichtig, frisch Proteasinhibitoren dem Extraktionspuffer zuzusetzen, um eine Proteindegradation zu verhindern, und außerdem muss darauf geachtet werden, das Chromatin vollständig aufzulösen, um eine vollständige Histon-Extraktion zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Expression der säugetierischen Histon-H1-Subtypen umfassend auf mRNA- und Proteinebene analysiert.