Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse

In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache, reproduzierbare Methode der Ischiasnervenquetschung und der Gesamtanalyse der Muskelreinnervation nach Ischiasnervenquetschung zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zuerst der Ischiasnerv freigelegt wird, einschließlich der richtigen Anordnung der chirurgischen Retraktoren, um einen guten Zugang zum Nerv zu gewährleisten. Zerquetschen Sie anschließend den Nerv mit einer hämostatischen Zange und markieren Sie den Nerv mit Holzkohle.

Entfernen Sie dann einzelne Muskeln, die vom Ischiasnerv innerviert werden, von der hinteren Extremität. Der letzte Schritt besteht darin, einzelne Muskeln für die Analyse des gesamten Berges nach der Immunfärbung zu präparieren. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass eine reproduzierbare Ischiasnervenquetschung einfach durchgeführt werden kann und Muskellochhalterungen zur Analyse der nachfolgenden Regeneration verwendet werden können.

Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es eine einfache reproduzierbare Technik bietet, um den Ischiasnerv zu zerquetschen und anschließend die axonale Regeneration zu erzielen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Maus für die Operation mit einem Cocktail aus 100 Milligramm pro Kilogramm Ketamin und 10 Milligramm pro Kilogramm Xylazin durch intraperitoneale Injektion anästhesieren, um postoperative Schmerzen zu minimieren. Die Maus erhält außerdem eine subkutane Injektion von 10 Milligramm pro Kilogramm Meloxicam.

Rasieren Sie anschließend beide Hinterviertel vorsichtig mit einer chirurgischen Haarschneidemaschine. Tragen Sie dann die Nare-Haarentfernungscreme auf, um sie vollständig zu erschöpfen. Reinigen Sie die Haut mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze und einem chirurgischen Betadin-Peeling.

Tragen Sie danach eine Augensalbe mit einem sterilen Applikator mit Wattespitze auf die Augen auf. Legen Sie die Maus auf eine saubere Edelstahlplatte über eine vorgewärmte Homöo-Decke und halten Sie die Temperatur des Tieres bei 37 Grad Celsius. Kleben Sie dann alle Gliedmaßen fest.

Positionieren Sie die hintere Extremität vorsichtig symmetrisch, so dass das Kniegelenk einen rechten Winkel zum Körper bildet. Decken Sie anschließend das Operationsfeld mit einem sterilen Tuch unter dem Mikroskop ab. Machen Sie einen halbkreisförmigen Schnitt über die Mittellinie.

Trennen Sie die Haut sanft von der darunterliegenden Muskulatur und falten Sie sie von Zeit zu Zeit um. Tragen Sie etwa 0,1 Milliliter sterile Kochsalzlösung auf, um die Operationsstelle während des Eingriffs feucht zu halten. Als nächstes öffnen Sie die Faszienebene zwischen dem Gesäßmuskel und dem vorderen Kopf des Bizeps femoris.

Um den Ischiasnerv für eine chirurgische Kontrolle freizulegen. Der kontralaterale Ischiasnerv sollte freigelegt und mobilisiert, aber intakt bleiben. Dann ruhen und vernähen Sie die Gesäßmuskulatur.

Legen Sie den experimentellen Ischiasnerv auf die gleiche Weise mit Retraktoren frei. Um die Visualisierung zu vereinfachen. Befreien Sie den Ischiasnerv vorsichtig mit einer Iridektomieschere vom umgebenden Bindegewebe.

Platzieren Sie dann mit der feinen 5 45 Pinzette den Nerv am Unterkiefer der superfeinen hämostatischen Pinzette, richten Sie die drei Faszien nebeneinander und nicht übereinander aus. Die hämostatische Pinzette wurde mit einer Markierung 1,5 Millimeter von ihrer Spitze entfernt graviert. Lege den äußersten Teil des Ischias in einer Linie mit dieser Markierung, bevor du ihn zerquetschst.

Dies gewährleistet eine gleichmäßige Quetschung und dass der Nerv nicht über die Backen der hämostatischen Pinzette hinausragt, wenn er aufgrund der Quetschkraft abgeflacht wird. Wenn der Nerv über die Pinzettenspitzen hinausragt, wird der Nerv nur teilweise gequetscht. Verwenden Sie eine zweite hämostatische Pinzette, die vorgetaucht und mit Kohlenstoffpulver gepulvert wurde, um die Quetschstelle zu markieren.

Zerquetschen Sie den Nerv an derselben Quetschstelle für 15 Sekunden mit drei Klicks. Keine Kohlenstoffmarkierung sollte über die Grenze der ersten Zerkleinerung hinausgehen. Dies ist besonders wichtig, wenn eine genaue Markierung der Quetschstelle erforderlich ist, um die Pinzette in Kohlenstoff vorzutauchen und weit verbreiteten Kohlenstoff an der Operationsstelle auszuschließen.

Öffnen Sie die Pinzette in pulverisiertem Kohlenstoff. Schließen Sie sie dann vorsichtig. Verwenden Sie sterile Gaze, um den Kohlenstoff an der Außenseite der Blutstiller abzuwischen.

Überprüfen Sie die Pinzette unter mindestens dreifacher Vergrößerung, um sicherzustellen, dass die Brechflächen gleichmäßig mit pulverförmigem Kohlenstoff bedeckt sind. Bei Bedarf werden sie wieder eingetaucht und abgewischt und die Gesäßmuskulatur auf die gleiche Weise vernäht wie die kontralaterale Seite. Zum Schluss verschließen Sie den Hautschnitt mit den neun Millimeter großen Reflexclips.

Wenn festgestellt wird, dass neun Millimeter lange Reflexclips die Bewegung einschränken, können kleinere Reflexclips oder sechs autäre Nähte verwendet werden. Entfernen Sie stattdessen nach dem Opfern der Maus vier Muskeln. Die Tibias anterior extensor digitorum longus, peroneus longus und soleus in der Hintergliedmaße sorgfältig, indem sie ihr Bindegewebe an eine mit schwarzem Sard überzogene Schale stecken.

Spülen Sie sie dann in PBS aus. Fixieren Sie sie anschließend 30 Minuten lang in 4%Paraformaldehyd. Um jeden Muskel auf einer mit schwarzer Sarde beschichteten Petrischale zu sezieren, entfernen Sie die Sehnen mit der Iridektomieschere.

Danach dünnen Sie die Muskeln aus, indem Sie die inneren Muskelfasern abziehen Bewahren Sie sorgfältig die äußere Oberfläche des Muskels auf, einschließlich der Endplattenbänder. Montieren Sie dann die entstandenen Muskeln auf Plus-Dias mit Vector Shield und 22 x 40 Millimeter großen Glasabdeckfolien, die zwei Seiten mit klarem Nagellack versiegeln. Wenn sie ordnungsgemäß auf der Rutsche montiert sind, sollten die Plattenbänder in Kontakt mit den Deckgläsern sein.

Hier ist ein Beispiel für eine Quetschstelle in situ an der linken hinteren Extreme. Die Quetschstelle wird durch Ruß angezeigt. Das Sternchen markiert einen Ast des Nervus tibialis, der die Oberschenkelmuskulatur innerviert und als nützlicher Orientierungspunkt dient.

Bei der Quetschoperation ist die Tibiateilung des Nervus ischiasis blau, der Peroneus und grün und der Srel gelb umrandet. Dieser halbdünne Schnitt zeigt eine vollständige Zerkleinerung, die mit der hämostatischen Pinzette durchgeführt wurde. Pfeilspitzen zeigen hier zerquetschte Fasern an.

Eine unvollständige Zerkleinerung mit der abgewinkelten Pinzette ist in einem anderen Halbflossenschnitt angedeutet. Die Pfeilspitze zeigt wiederum zerquetschte Fasern an, während Pfeile konservierte Axone anzeigen. Dies sind die gerenderten Bilder von den gesamten Reittiermuskeln.

Nach der Entfernung des Bindegewebes und der anschließenden Ausdünnung werden die Plattenbänder an jedem Muskel umrandet. Hier ist der Sous-Ganze-Mount-Muskel zu sehen. 14 Tage nach der Ischiasnervenquetschung.

Die Pfeile zeigen Bereiche der neuromuskulären Verbindung, die durch ein Axon reinnerviert wurden. Hier ist die Demonstration der denervierten neuromuskulären Verbindung. Die Lücke 43 der positiven Schwanzellprozesse ist durch die Pfeilspitzen gekennzeichnet.

In dieser denervierten neuromuskulären Verbindung sind keine Axone zu sehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie statische Nerven reproduzierbar zerquetschen und Muskelhormon-Mounts für die Analyse der Regeneration vorbereiten können.