Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test
February 6th, 2012
Ein neuartiger Fluoreszenz- In-situ- Hybridisierung (FISH)-Methode, die gleichzeitig untersucht sowohl numerische und strukturelle Chromosomen-Veränderungen, insbesondere die spezifische chromosomale Translokationen mit Leukämien und Lymphomen assoziiert, der alle 24 menschlichen Chromosomen auf einem einzigen Gerät in einer Hybridisierung wird beschrieben.
Der Octa Chrome Fish Assay untersucht gleichzeitig alle 24 menschlichen Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger. Bereiten Sie zunächst Metaphasen-Spreads auf der spezifischen Folie mit acht Quadraten vor. Führen Sie dann einen automatisierten Scan des Objektträgers durch, um die Lokalisierung aller Metaphasen und die zukünftige Neubewertung aller Zellbilder zu erleichtern.
In der nächsten Position gleiten die acht Quadrate über das Octa-Chrom-Gerät und hybridisieren die Sonden. Die erzielten Ergebnisse können drei verschiedene bemalte ganze Chromosomen in jedem Quadrat zeigen, basierend auf der Anordnung der Chromosomenkombinationen auf dem RO-Gerät. Die Idee zu dieser RO FISH-Methode kam mir, als ich Anfang der 1990er Jahre begann, Fisch in Populationsstudien anzuwenden.
Dann stellte ich meine Idee der dreifarbigen Malerei mit acht quadratischen Folien vor, um die Zelle auf der jährlichen A A CR-Konferenz im Jahr 1994 zu setzen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem klassischen Chromosomenbiegen und dem modernen Spectral Prototyping besteht darin, dass sie alle 24 menschlichen Chromosomen in einer größeren Anzahl von Zellen analysieren kann. Beginnen Sie mit einer Präparation von Metaphase-Zellen, die in Suspension fixiert sind, als Kontrollpipette, tropfen Sie die Zellen auf einen Objektträger und überprüfen Sie die geeignete Dichte.
Tauchen Sie nun in acht quadratische OC-Chrompartikel und gleiten Sie zwei Minuten lang in reines Ethanol. Verteilen Sie in einer Abfolge von abwechselnden Quadraten fünf Mikroliter Zellsuspension auf dem Vorlagenobjektträger, um zu verhindern, dass sich die Zellausbreitungen gegenseitig stören. Trocknen Sie die Proben an der Luft, bevor Sie benachbarte Paare entdecken.
Tragen Sie 20 Mikroliter mit 0,2 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Fleck auf die Mitte jeder Hälfte des Objektträgers auf und legen Sie ein Deckglas an. Führen Sie nun einen automatisierten Scan des Objektträgers durch, um die Metaphasenzellen zu lokalisieren. Verwenden Sie Metaverse-Software, um die Lokalisierung aller Metaphasen und die zukünftige Neubewertung aller Zellbilder zu erleichtern.
Zeigen Sie die Scanergebnisse manuell an und löschen Sie Artefakte, die nicht aus der Metaphase stammen. Entfernen Sie zuerst den DPI-Fleck in zwei XSSC-Puffern und dehydrieren Sie die Proben dann durch eine Reihe von Ethanolwäschen. Trocknen Sie den Objektträger an der Luft und legen Sie ihn dann fünf Minuten lang auf eine 37 Grad heiße Hopfenplatte.
Äquilibrieren Sie nun die Chroma-Sonde, die Multi-Sonden-Hybridisierungskammer und den Hybridisierungspuffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad mit der Markierungsseite nach unten. Stellen Sie das OC chrome Gerät auf eine 37 Grad Celsius heiße Platte. Geben Sie zwei Mikroliter vorwarme Hybridisierungslösung in jeden der acht Bereiche.
Kehren Sie die Vorlage vorsichtig um und richten Sie sie aus. Schieben Sie über das OC Chrome-Gerät. Vergewissern Sie sich, dass die Vorlagenfolie am Octa Chrome-Gerät ausgerichtet ist.
Senken Sie dann den Objektträger vorsichtig auf die Tropfen der Hybridisierungslösung ab und üben Sie sanften, gleichmäßigen Druck aus, um die Hybridisierungslösung an den Rändern jeder der erhabenen Bereiche auf dem OC-Chromgerät zu verteilen. Heben Sie das mattierte Ende des Glasschiebers an und drehen Sie ihn um, so dass sich der Schieber unter dem OC chrome Gerät befindet. 10 Minuten auf eine 37 Grad Celsius heiße Platte stellen.
Dann für fünf Minuten auf eine 75 Grad Celsius heiße Platte geben. Um die Proben für den Hybridisierungsschritt zu denaturieren, überführen Sie sie in eine Hybridisierungskammer mit mehreren Chroma-Sonden mit mehreren Sonden. Setzen Sie den Deckel wieder auf und lassen Sie die Kammer über Nacht im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad schwimmen.
Nehmen Sie den Objektträger vorsichtig aus dem Gerät und waschen Sie in 0,4 überschüssigem SC bei 72 Grad Celsius für zwei Minuten. Führen Sie die zweite Wäsche 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur durch. Fügen Sie 20 Mikroliter DPI in die Mitte jeder Hälfte der Folie hinzu und positionieren Sie einen Deckglas.
Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur, bevor Sie sie mit der Fluoreszenzmikroskopie betrachten. Der Octa-Chromfisch-Assay ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller 24 menschlichen Chromosomen mit einer einzigen Hybridisierung auf einem einzigen Objektträger. Jedes Quadrat trägt drei verschiedene Ganzchromosomen-Malsonden, die direkt mit verschiedenfarbigem Fluor markiert sind.
Eine Vier-Grad-Untersuchung einer normalen Metaphase-Zelle im zweiten Quadrat des Octa-CHRO-Systems zeigt, dass die Chromosomen 8, 21 und 12 rot, grün und blau gefärbt sind. Sie können einzeln mit den jeweiligen Filtern oder gleichzeitig durch einen DAPI Fitzy, Texas Red Dreifachfilter visualisiert werden. Dieser Chromosomenansatz ist nützlich bei der Erkennung abnormaler Zellen mit Leukämie-spezifischen chromosomalen, Translokation und Aneuploidie.
Zum Beispiel ist T 8 21 eine häufige chromosomale Translokation bei akuter myeloischer Leukämie. Trisomie 21 3 Kopien von Chromosom 21 ist eine häufige Aneuploidie bei Leukämie Nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Wissenschaftler auf dem Gebiet der molekularen Zytogenetik und molekularen Epidemiologie, um die am häufigsten bei Leukämie und Lymphom festgestellten Chromosomenumlagerungen zu erforschen und die selektive Ploidie zwischen allen menschlichen Chromosomen bei klinischen Patienten oder Populationen, die toxischen Chemikalien ausgesetzt waren, zu untersuchen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger mit dem Octo Chrome Fish-Assay untersuchen können. Und wir definieren das als Chromosomen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Fluoreszenz in situ Hybridisierungs-Methode (FISH), bekannt als der Octa Chrome Fish Assay. Sie ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller 24 menschlichen Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger und konzentriert sich auf chromosomale Veränderungen, die mit Leukämie und Lymphom assoziiert sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
- Chromosomale Analyse
- Onkologie
Hintergrund
- FISH ist eine Technik zur Erkennung und Lokalisierung des Vorhandenseins oder Fehlens spezifischer DNA-Sequenzen auf Chromosomen.
- Chromosomale Translokationen sind in der Untersuchung von Leukämie und Lymphom von Bedeutung.
- Die Methode ermöglicht eine umfassende Analyse chromosomaler Veränderungen.
- Frühere Methoden erforderten mehrere Hybridisierungen, was diesen Ansatz effizienter macht.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode, die die Erkennung von chromosomalen Anomalien vereinfacht.
- Verbesserung der Effizienz der chromosomalen Analyse in klinischen Umgebungen.
- Bereitstellung eines Werkzeugs für ein besseres Verständnis der genetischen Grundlagen hämatologischer Malignome.
Verwendete Methoden
- Präparation von Metaphasen-Spreizungen auf einem spezialisierten acht Quadraten-Objektträger.
- Automatisiertes Scannen des Objektträgers zur Lokalisierung von Metaphasen für die Analyse.
- Hybridisierung von Sonden unter Verwendung des Octa Chrome-Geräts.
- Visualisierung der Ergebnisse, die verschiedene bemalte ganze Chromosomen basierend auf Anordnungen zeigen.
Hauptergebnisse
- Der Assay visualisiert erfolgreich alle 24 Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung.
- Ergebnisse können drei verschiedene bemalte Chromosomen in jedem Quadrat des Objektträgers anzeigen.
- Erleichtert die Neubewertung von Zellbildern für eine umfassende Analyse.
- Zeigt das Potenzial für die Anwendung in Studien der menschlichen Population.
Schlussfolgerungen
- Der Octa Chrome Fish Assay stellt einen bedeutenden Fortschritt in der FISH-Methodik dar.
- Diese Methode kann die Erkennung chromosomaler Anomalien bei hämatologischen Krebserkrankungen verbessern.
- Sie bietet einen effizienteren Ansatz für Forscher und Kliniker.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The OctoChrome-FISH assay enables simultaneous detection of numerical and structural chromosomal alterations across all 24 human chromosomes in a single hybridization, addressing a key bottleneck in cytogenetic analysis for hematological malignancies. By consolidating whole-genome screening into one slide-based workflow, it enhances throughput and reproducibility in leukemia and lymphoma research, supporting early target validation and mechanistic de-risking in preclinical discovery. This capability improves predictive confidence in identifying translocation-driven oncogenes and aneuploidy patterns relevant to benzene-induced leukemogenesis and other toxicant exposures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing leukemia-specific translocations such as t(9;22), t(15;17), t(8;21), and t(14;18) in their native chromosomal context.
- Operational Value: Reduces need for multiple sequential FISH hybridizations, conserving samples and accelerating target confirmation in discovery biology.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing concurrent assessment of structural rearrangements and genome-wide aneuploidy, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromosomal systems for downstream screening by establishing baseline karyotypes and detecting background alteration rates in exposed populations.
- Operational Value: Standardizes cytogenetic readouts through consistent probe labeling and slide architecture, enhancing reproducibility across laboratories and screening campaigns.
- Scalability Value: Enables high-content analysis of metaphase spreads via automated scanning, facilitating reevaluation and longitudinal tracking of chromosomal stability in longitudinal toxicology studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing direct comparison of chromosomal alterations in cell models, patient samples, and population cohorts exposed to leukemogens like benzene.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed aneuploidies or translocations are random events or exposure-linked patterns, informing risk assessment in translational biomarker development.
- Continuity Value: Supports seamless transition from in vitro findings to in vivo relevance by maintaining chromosomal resolution across model systems and human specimens.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling chromosomal analysis at early hypothesis testing stages and supporting lead identification through mechanistic de-risking of genomic instability.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of chromosomal mechanisms in leukemogenesis by allowing simultaneous screening for multiple known and novel alterations across the genome.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs (e.g., translocation frequency, aneuploidy rates) that allow comparison of compound or exposure effects across conditions.
- Analytics: Generates multiplexed fluorescence readouts compatible with automated imaging and software-assisted karyotyping, enabling objective comparison of chromosomal states.
- Translational Research: Connects in vitro findings to human relevance by detecting identical chromosomal patterns in population studies, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable cytogenetic platform applicable across oncology, toxicology, and pharmacogenomics programs requiring chromosomal integrity assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing false negatives through comprehensive chromosomal coverage.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility via standardized probe sets and slide format, minimizing inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by reducing reagent consumption and hands-on time compared to sequential FISH or SKY approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions by providing early evidence of genomic stability or instability in lead candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cytogenetic preparation for accurate metaphase spread generation and signal interpretation.
- Dependent on access to the OctoChrome device and compatible hybridization chambers for multi-probe simultaneous delivery.
- Necessitates standardization of slide handling, denaturation, and washing protocols to ensure consistent probe penetration and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to non-human model systems may require revalidation of probe specificity and chromosomal painting efficiency.
- Practical limitations include reliance on metaphase-quality samples and potential signal overlap in highly rearranged genomes, requiring careful spectral unmixing.
