Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test
6. Februar 2012
Ein neuartiger Fluoreszenz- In-situ- Hybridisierung (FISH)-Methode, die gleichzeitig untersucht sowohl numerische und strukturelle Chromosomen-Veränderungen, insbesondere die spezifische chromosomale Translokationen mit Leukämien und Lymphomen assoziiert, der alle 24 menschlichen Chromosomen auf einem einzigen Gerät in einer Hybridisierung wird beschrieben.
Der Octa Chrome Fish-Assay untersucht simultan alle 24 menschlichen Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger. Bereiten Sie zunächst Metaphase-Präparate auf dem spezifischen acht Quadrat umfassenden Objektträger vor. Führen Sie anschließend einen automatisierten Scan des Proben-Objektträgers durch, um die Lokalisation aller Metaphasen sowie eine spätere Neubewertung sämtlicher Zellbilder zu erleichtern.
Nächste Position: Die acht quadratischen Felder gleiten über das Octa-Chrom-Gerät, und die Sonden hybridisieren. Die erhaltenen Ergebnisse können drei unterschiedlich gefärbte vollständige Chromosomen in jedem Quadrat zeigen, abhängig von der Anordnung der Chromosomenkombinationen auf dem RO-Gerät. Die Idee zu dieser RO-FISH-Methode hatte ich erstmals, als ich in den frühen 1990er Jahren begann, FISH in populationsgenetischen Studien am Menschen anzuwenden.
Dann stellte ich meine Idee der Dreifach-Farbmalerei vor, acht quadratische Objektträger, um die Zelle auf der jährlichen AACR-Tagung 1994 vorzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der klassischen Chromosomenbiegung und der modernen spektralen Prototypisierung besteht darin, dass sie alle 24 menschlichen Chromosomen in einer größeren Anzahl von Zellen leicht analysieren kann. Beginnen Sie mit der Herstellung von in Suspension fixierten Metaphasezellen als Kontrolle, pipettieren Sie einen Tropfen Zellen auf einen Objektträger und überprüfen Sie die geeignete Dichte.
Tauchen Sie nun acht quadratische OC-Chromblätter ein, geben Sie sie für zwei Minuten in reines Ethanol. Verteilen Sie in einer Abfolge abwechselnder Quadrate jeweils fünf Mikroliter Zellsuspension auf die Vorlagenglasplättchen, um zu verhindern, dass sich die Zellausstriche gegenseitig beeinträchtigen. Lassen Sie die Proben vor dem Auftragen benachbarter Paare an der Luft trocknen.
Geben Sie 20 Mikroliter einer 0,2 Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Färbung in die Mitte jeder Hälfte des Objektträgers und legen Sie einen Deckglaser auf. Führen Sie nun einen automatisierten Scan des Probenobjektträgers durch, um die Metaphasezellen zu lokalisieren. Verwenden Sie Metaverse-Software, um die Lokalisation aller Metaphasen und die spätere Neubewertung aller Zellbilder zu erleichtern.
Die Scannergebnisse manuell überprüfen und nicht-metaphasenartefakte entfernen. Zuerst den DPI-Farbstoff in zwei Portionen XSSC-Puffer entfernen, anschließend die Proben durch eine Abfolge von Ethanol-Waschschritten dehydrieren. Die Objektträger an der Luft trocknen lassen und danach für fünf Minuten auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius stellen.
Bringen Sie nun die Chroma-Probe, die Multi-Probe-Hybridisierungskammer und den Hybridisierungspuffer in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad unter Verwendung der beschrifteten Seite nach unten zum Gleichgewicht. Stellen Sie das OC-Chrome-Gerät auf eine 37 Grad Celsius heiße Heizplatte. Geben Sie zwei µL vorgewärmte Hybridisierungslösung in jede der acht Bereiche.
Drehen und positionieren Sie die Schablone vorsichtig um. Schieben Sie sie über das OC-Chrom-Gerät. Stellen Sie sicher, dass die Schablonenplatte mit dem Octa-Chrom-Gerät ausgerichtet ist.
Danach die Deckglas vorsichtig auf die Tropfen der Hybridisierungslösung senken und sanften, gleichmäßigen Druck ausüben, um die Hybridisierungslösung bis zu den Rändern jeder erhabenen Fläche auf dem OC-Chrom-Gerät zu verteilen. Am mattierten Ende des Objektträgers anheben und umdrehen, sodass der Objektträger unterhalb des OC-Chrom-Geräts liegt. Für 10 Minuten auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius stellen.
Überführen Sie es anschließend für fünf Minuten auf eine 75 Grad Celsius heiße Heizplatte. Um die Proben für den Hybridisierungsschritt zu denaturieren, überführen Sie sie in eine Chroma-Probe-Mehrfach-Hybridisierungskammer. Setzen Sie den Deckel auf und lassen Sie die Kammer über Nacht in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius schwimmen.
Entfernen Sie die Folie vorsichtig aus dem Gerät und waschen Sie sie bei 72 Grad Celsius zwei Minuten lang in 0,4-fachem Überschuss an SC. Führen Sie die zweite Wäsche bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang durch. Geben Sie anschließend 20 Mikroliter DPI in die Mitte jeder Hälfte der Folie und platzieren Sie einen Deckgläser.
Die Proben vor der Beobachtung mittels Fluoreszenzmikroskopie 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Der Octa-Chrom-Fisch-Assay ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller 24 menschlichen Chromosomen durch eine einzige Hybridisierung auf einem einzigen Objektträger. Jedes Quadrat enthält drei verschiedene Whole-Chromosome-Painting-Probe, die direkt mit farblich unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind.
Die Untersuchung einer normalen Metaphasezelle im Quadrat zwei des Octa CHRO-Systems zeigt, dass die Chromosomen 8, 21 und 12 rot, grün bzw. blau markiert sind. Sie können einzeln mithilfe der entsprechenden Filter oder gleichzeitig über einen DAPI Fitzy, Texas Red Dreifachfilter visualisiert werden. Dieser chromosomale Ansatz ist nützlich zur Detektion abnormaler Zellen mit leukämiespezifischen chromosomalen Translokationen und Aneuploidie.
Beispielsweise ist die t(8;21)-Translokation eine häufige chromosomale Translokation bei der akuten myeloischen Leukämie. Die Trisomie 21 – drei Kopien des Chromosoms 21 – ist eine häufige Aneuploidie bei Leukämie nach der Entstehung. Diese Technik ebnete Wissenschaftlern auf den Gebieten der molekularen Zytogenetik und molekularen Epidemiologie den Weg, um die häufigsten bei Leukämie und Lymphom nachgewiesenen chromosomalen Umstrukturierungen zu erforschen und die selektive Ploidie sämtlicher menschlicher Chromosomen bei klinischen Patienten oder Populationen, die toxischen Chemikalien ausgesetzt waren, zu untersuchen.
Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie alle 24 menschlichen Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger mittels des Octo Chrome FISH-Assays gleichzeitig untersucht werden können. Und wir definieren dies als Chromosomen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)-Methode, die als Octa-Chrome-Fish-Assay bekannt ist. Sie ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung aller 24 menschlichen Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung auf einem Objektträger, wobei chromosomale Veränderungen im Zusammenhang mit Leukämie und Lymphom im Fokus stehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
- Chromosomenanalyse
- Onkologie
Hintergrund
- FISH ist eine Technik, die dazu dient, das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer DNA-Sequenzen auf Chromosomen nachzuweisen und zu lokalisieren.
- Chromosomale Translokationen sind von großer Bedeutung für die Erforschung von Leukämien und Lymphomen.
- Die Methode ermöglicht eine umfassende Analyse chromosomaler Veränderungen.
- Frühere Methoden erforderten mehrfache Hybridisierungen, wodurch dieser Ansatz effizienter ist.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Vereinfachung des Nachweises chromosomaler Abnormalitäten.
- Verbesserung der Effizienz der chromosomalen Analyse in klinischen Umgebungen.
- Bereitstellung eines Werkzeugs zum besseren Verständnis der genetischen Grundlagen hämatologischer Malignome.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Metaphaseausstrichen auf einem speziellen Acht-Quadrat-Objektträger.
- Automatisierte Durchmusterung des Objektträgers zur Lokalisierung von Metaphasen für die Analyse.
- Hybridisierung von Sonden mithilfe des Octa Chrome-Geräts.
- Visualisierung der Ergebnisse, die unterschiedliche ganzchromosomale Färbungen basierend auf Anordnungen zeigen.
Hauptergebnisse
- Der Assay ermöglicht die Visualisierung aller 24 Chromosomen in einer einzigen Hybridisierung.
- Die Ergebnisse können drei unterschiedlich gefärbte Chromosomen in jedem Feld des Objektträgers darstellen.
- Erleichtert die erneute Bewertung von Zellbildern für eine umfassende Analyse.
- Zeigt ein Potenzial für die Anwendung in Studien an menschlichen Populationen auf.
Schlussfolgerungen
- Der Octa Chrome Fish-Assay stellt eine bedeutende Weiterentwicklung der FISH-Methodik dar.
- Diese Methode kann die Detektion chromosomaler Aberrationen bei hämatologischen Krebserkrankungen verbessern.
- Sie bietet eine effizientere Vorgehensweise für Forscher und Kliniker.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Der OctoChrome-FISH-Assay ermöglicht die gleichzeitige Detektion numerischer und struktureller chromosomaler Veränderungen über alle 24 menschlichen Chromosomen hinweg in einer einzigen Hybridisierung und löst damit ein zentrales Engpassproblem in der zytogenetischen Analyse hämatologischer Malignitäten. Durch die Konsolidierung der Ganzgenom-Screening-Analyse in einem auf Objektträgern basierenden Workflow wird die Durchsatzleistung und Reproduzierbarkeit in der Leukämie- und Lymphomforschung verbessert, was die frühe Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Risikominimierung in der präklinischen Entdeckungsforschung unterstützt. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung translokationsgetriebener Onkogene sowie von Aneuploidie-Mustern, die für die benzolinduzierte Leukämogenese und andere toxische Expositionen relevant sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung leukämiespezifischer Translokationen wie t(9;22), t(15;17), t(8;21) und t(14;18) im natürlichen chromosomalen Kontext.
- Operativer Wert: Verringert den Bedarf an mehreren sequenziellen FISH-Hybridisierungen, schont Proben und beschleunigt die Bestätigung von Zielstrukturen in der Entdeckungsforschung.
- Predictiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch gleichzeitige Beurteilung struktureller Umbauten und genomweiter Aneuploidie, wodurch die Zuverlässigkeit bei der Zuordnung von Zielstrukturen zu Erkrankungen verbessert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte chromosomale Systeme für nachgeschaltete Screenings vor, indem Basiskaryotypen etabliert und Hintergrundveränderungsraten in exponierten Populationen erfasst werden.
- Operativer Wert: Standardisiert zytogenetische Auslesemethoden durch konsistente Sondemarkierung und einheitliche Objektträgerarchitektur, wodurch die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren und Screening-Kampagnen verbessert wird.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die Analyse von Metaphasepräparaten mit hohem Informationsgehalt durch automatisiertes Scannen und erleichtert so die erneute Bewertung und langfristige Verfolgung der chromosomalen Stabilität in longitudinalen toxikologischen Studien.
Translationale und präklinische Forschung
- Übertragbarer Wert: Verbindet Entdeckung und präklinische Validierung, indem direkte Vergleiche chromosomaler Veränderungen in Zellmodellen, Patientenproben und Populationen, die Leukämie erzeugenden Stoffen wie Benzol ausgesetzt waren, ermöglicht werden.
- Mechanistische Risikominimierung: Klärt, ob beobachtete Aneuploidien oder Translokationen zufällige Ereignisse oder mit der Exposition assoziierte Muster sind, und liefert damit Hinweise für die Risikobewertung bei der Entwicklung translationaler Biomarker.
- Kontinuitätswert: Unterstützt einen nahtlosen Übergang von in-vitro-Befunden zur in-vivo-Relevanz, indem die Auflösung chromosomaler Veränderungen über verschiedene Modellsysteme und humane Proben hinweg beibehalten wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich nahtlos in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und ermöglicht die chromosomale Analyse bereits in frühen Phasen der Hypothesenprüfung sowie die Identifizierung von Leitstrukturen durch die mechanistische Absicherung gegen genomische Instabilität.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung chromosomaler Mechanismen bei der Leukämogenese, indem gleichzeitige Screenings für mehrere bekannte und neuartige genomweite Veränderungen durchgeführt werden.
- Screening: Liefert quantitative, multiplexe Ergebnisse (z. B. Translokationshäufigkeit, Aneuploidieraten), die den Vergleich von Wirkstoff- oder Expositionseffekten unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt multiplexe Fluoreszenzsignale, die mit automatisierter Bildgebung und softwaregestützter Karyotypisierung kompatibel sind und einen objektiven Vergleich chromosomaler Zustände ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit menschlicher Relevanz, indem identische chromosomale Muster in Bevölkerungsstudien nachgewiesen werden, was die Abstimmung von Biomarkern unterstützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare zytogenetische Plattform, die in Onkologie-, Toxikologie- und pharmakogenomischen Programmen einsetzbar ist, die die Beurteilung der chromosomalen Integrität erfordern.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem falsch-negative Ergebnisse durch umfassende chromosomale Abdeckung reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch standardisierte Sonden-Sets und Objektträgerformate und verringert so die Variabilität zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, da im Vergleich zu sequenziellen FISH- oder SKY-Ansätzen weniger Reagenzien verbraucht und weniger manueller Arbeitsaufwand erforderlich ist.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem frühzeitige Hinweise auf genomische Stabilität oder Instabilität von Leitkandidaten bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Expertise in der Fluoreszenzmikroskopie und zytogenetischen Probenvorbereitung, um genaue Metaphasenausstrahlungen zu erzeugen und die Signale korrekt zu interpretieren.
- Setzt den Zugang zum OctoChrome-Gerät und kompatiblen Hybridisierungskammern voraus, um mehrere Sonden gleichzeitig applizieren zu können.
- Erfordert die Standardisierung von Protokollen für die Objektträgerbehandlung, Denaturierung und Waschschritte, um eine gleichmäßige Sondenpenetration und konstante Signal-Rausch-Verhältnisse sicherzustellen.
- Die Anpassung an nicht-menschliche Modellsysteme kann eine erneute Validierung der Sondenspezifität und der Effizienz der chromosomalen Malerei notwendig machen.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Abhängigkeit von Proben mit Metaphase-Qualität sowie in möglichen Signalüberlappungen bei stark umgestalteten Genomen, was eine sorgfältige spektrale Entmischung erfordert.
