Herstellung von Tissue Microarrays, Immunhistochemie Färbung und Digitalisierung Innerhalb des Human Protein Atlas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine effiziente Methode zu verwenden, um gleichzeitige Informationen aus mehreren Geweben für die Proteinexpression in einem Hochdurchsatzprojekt wie dem humanen Proteinatlas zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst repräsentative Bereiche von formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben ausgewählt werden. Als nächstes werden markierte Bereiche gestanzt und die ausgewählten Kerne zu einem einzigen Paraffinblock, einem Gewebe-Microarray, zusammengesetzt.

Dann werden Schnitte aus der TMA geschnitten und eine Immunhistochemie durchgeführt. Schließlich wird das Proteinexpressionsmuster analysiert und die Daten werden auf dem humanen Proteinatlas veröffentlicht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Proteinexpression in Geweben und Zellen durch Gewebe-Microarrays und Immunhistochemie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Durchführung von Immunhistochemie aus einzelnen Gewebeparenblöcken, besteht darin, dass wertvolles biologisches Material eingespart werden kann und die Experimente reproduzierbarer sind. Ein weiterer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie sowohl die HNO-Kosten als auch die Bearbeitungszeit im Labor einsparen können. Dieses Verfahren wird von Ian Call Bay, einem Labortechniker aus meinem Labor, demonstriert, um eine standardisierte Länge der Gewebekerne zu erhalten.

Markieren Sie das Mandrette. Es wird empfohlen, auf jeder Seite des Paraffinblocks einen Rand von 2,5 bis 3,0 Millimetern zu lassen, um ein Reißen des Paraffins zu vermeiden, um die richtigen Stempel zu montieren. Lösen Sie die Innensechskantschrauben, mit denen der Stempel an Ort und Stelle gehalten ist, und positionieren Sie den Stempel so, dass die Nut in der Stempelnabe fest an der Metallstange im Kunststoff-V-Block anliegt.

Ziehen Sie die Schrauben fest und achten Sie darauf, dass die Kante des Metallclips waagerecht ist. Führen Sie links den Empfängerstempel und rechts den Spenderstempel ein. Verwenden Sie die XY-Einstellknöpfe und ihre digitalen Mikrometeranzeigen, um die Stempel entlang der X- und Y-Axi-Achsen zu bewegen.

Um die Maschine zurückzusetzen, drücken Sie die Null a BS-Taste, um zwischen Zoll und Millimeter umzuschalten, drücken Sie die Zoll-Millimeter-Taste. Wenn Sie einen Ein-Millimeter-Stempel für eine neun x acht Schablone verwenden, sollte der Abstand zwischen den Löchern zwei Millimeter betragen, gemessen zwischen den Zentren der Löcher, um zu verhindern, dass der Empfängerstempel zu weit nach unten gedrückt und der Stempel beschädigt wird. Stellen Sie die maximale Tiefe für das Schieben des Stempels ein, indem Sie eine leere Kassette in den Halter einlegen und die Tiefenanschlagschraube in der oberen linken Ecke der Z-Führung verwenden. Stellen Sie die untere Position des Empfängerlochers auf einen Millimeter über dem unteren Rand der Kassette ein. Nachdem Sie den relevanten Bereich auf einem Gewebeschnitt ausgewählt und markiert und eine Schablone für die Gewebe-Microarray-Produktion entworfen haben, setzen Sie den Empfängerblock in die Halterung ein und befestigen Sie die Schrauben mit dem kleinsten Schraubendreher.

Vermeiden Sie es, die Schrauben zu fest anzuziehen, um zu verhindern, dass sich das Paraffin von der Kassette löst. Schieben Sie den Empfängerstempel etwa fünf Millimeter nach unten in den Empfängerblock und drehen Sie den Stempel mit dem Griff am Stempel hin und her. Einmal den nach unten drückenden Druck langsam ablassen, damit die Federn den Stempel nach oben bewegen können.

Verwenden Sie die Formatvorlage, um den Stempel zu leeren und den Paraffinkern zu entsorgen. Bewegen Sie dann den Revolver, um zum Spenderstempel zu wechseln. Platzieren Sie anschließend die Spenderblockbrücke mit dem Spenderblock über dem Empfängerblockhalter.

Verwenden Sie einen entsprechenden Hämatin- und Eosin-Färbeobjektträger, wo der interessierende Bereich markiert wurde, um das zu entnehmende Gewebe zu lokalisieren. Halten Sie den Spenderblock manuell mit der linken Hand in Position und drücken Sie den Stempel mit der rechten Hand. Drücken Sie nicht auf das Mandrin. Der Tiefenanschlag blockiert die Stanzbewegung nicht an der richtigen Position für den Donorblock, daher ist es wichtig, das Drücken zu stoppen, wenn die zweite Markierung auf dem Mandrin sichtbar ist.

Drehen Sie den Griff am Locher einmal langsam. Lassen Sie den Abwärtsdruck los, während Sie den Spenderblock weiterhin auf der Spenderblockbrücke halten. Entfernen Sie die Brücke und den Spenderblock.

Stellen Sie sicher, dass der Spenderlocher mit dem zuvor gemachten Loch ausgerichtet ist. Stellen Sie die Stempelposition mit den Stellschrauben ein. Wenn der Spenderlocher und das Loch im Empfängerblock nicht ausgerichtet sind, schieben Sie den Locher vorsichtig nach unten, bis seine Spitze den oberen Rand des Lochs im Empfängerblock erreicht.

Während Sie diese Position halten, entleeren Sie den Gewebekern mit dem Mandrin in das Loch. Die Kernoberfläche sollte mit der Blockoberfläche ausgerichtet sein. Bewegen Sie den Revolver zurück zum Empfängerstempel.

Bewegen Sie sich mit den XY-Einstellknöpfen zur nächsten Position und wiederholen Sie den Vorgang erneut, indem Sie ein Sample aus dem Empfängerblock stanzen, bis das Array vollständig ist. Um den Empfängerblock zu entfernen, lösen Sie die Schrauben in der Halterung. Lege den Block mit der Vorderseite nach unten auf einen Glasschieber, lege ihn auf ein geeignetes Gitter und backe den Block bei 42 Grad Celsius 40 Minuten lang.

Nehmen Sie die Schiene und den Block aus dem Ofen und glätten Sie die Oberfläche des Blocks, indem Sie vorsichtig über den Glasschieber streichen. Legen Sie den Block mit dem Objektträger für 10 Minuten auf eine Kühlplatte. Entferne den Glasschieber vom Block.

Der Block ist nun fertig und bereit für das Schneiden. Nach dem Schneiden, Färben und Digitalisieren des Gewebe-Microarrays mit einem Antikörper gegen ein Protein von Interesse. Suchen Sie im Atlas der menschlichen Proteine nach dem Protein, indem Sie auf die Website www.proteinatlas.org.

Geben Sie den Namen eines Proteins von Interesse, die Ensemble-ID, die Uni-Prote-Zugangsnummer oder den HGNC-Namen ein, z. B. Insulin. Klicken Sie auf das gewünschte Protein und scrollen Sie nach unten zur Zusammenfassung von normalem Gewebe und Organen. Die Übersicht zeigt die Proteinexpression in der Bauchspeicheldrüse.

Klicken Sie auf die Registerkarte. Mehr Gewebedaten. Es erscheint die Normalgewebeansicht, sortiert nach Organen.

Klicken Sie auf Pankreas, um die IHC-Ergebnisse für drei Antikörper anzuzeigen, die gegen dasselbe Protein gerichtet sind. Klicken Sie auf ein Bild, um ein hochauflösendes Bild der Bauchspeicheldrüse zu sehen In dieser Abbildung sind Beispiele für die Qualität von Gewebe-Microarrays dargestellt, ein gerades und korrekt ausgerichtetes Array mit ausreichend Abstand zwischen den Zeilen und Spalten und dem Rand des Paraffins. Hier sind einige der Kerne zu nah am Rand, was wahrscheinlich zu Problemen beim Schneiden führt.

Dieser Gewebe-Microarray wurde zu lange gebacken und kollabierte ohne die richtige Vorlage. Hier wird ein richtig geschnittener Abschnitt mit geraden und ausgerichteten Säulen mit Hämat, Toin und Eosin gebeizt. Eine schlechte oder verschmutzte Klinge kann zu Rissen führen, wie hier gezeigt, oder zu komprimierten Abschnitten wie diesem.

Keimzellen in Lymphknoten zeigen einen optimal titrierten Antikörper, der zu einer spezifischen zytoplasmatischen Färbung ohne Hintergrund führt, wie hier zu sehen. Eine negative oder schwache Färbung liegt vor, wenn die Konzentration des Primärantikörpers zu niedrig ist oder wenn das Zielprotein in den immungefärbten Geweben nicht vorhanden ist. Dieser Gewebeschnitt ist durch eine zu hohe Konzentration an Primärantikörpern überfärbt.

Die dunkle Farbe führt zu Schwierigkeiten bei der Bestimmung der subzellulären Lokalisation aufgrund von Spillover, Kreuzreaktivität und falscher Positivität. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Gewebemarker-Array herstellt und wie man es bei der Analyse der Proteinexpression in der Immunhistochemie verwendet. Sie sollten auch ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Atlas für menschliche Proteine nach Proteinexpression in menschlichen Geweben und Zellen durchsuchen können.