Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese: Ex-vivo- RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine schnelle Bewertung der Genfunktion bei der Entwicklung der Großhirnrinde unter Verwendung von organspezifischen Schnitten durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Plasmide, coex, ein exprimierendes und inhibitorisches RNA-Molekül sowie einen GFP-Marker in die embryonale Großhirnrinde eingebracht werden. Kurze elektrische Impulse werden auf das Gehirn angewendet, wodurch die Plasmid-DNA in die neuronalen Vorläuferzellen transfiziert wird.

Anschließend werden die Gehirne disseziert, eingebettet und in Schnitte geteilt, um organotypische Schnitte zu erzeugen, die ex vivo eine neuronale Morphogenese durchlaufen können. Die organotypischen Schnitte können auf kortikale Neuronensubpopulationen mit Migrations- oder morphologischen Defekten untersucht werden, indem die GFP-markierten Zellen direkt beobachtet werden. Hallo, willkommen in meinem Labor an der Brown University in der Abteilung für Molekularbiologie. Heute werden Dr. Liza und zwei Studierende, Kat Zer und Mark Seba, die ex vivo-Elektroporationstechnik und die Kultur organotypischer Schnitte demonstrieren, eine äußerst nützliche Methode für neurodevelopmentale Studien.

Mit dieser Methode können Schlüsselfragen in verschiedenen Bereichen der Neuroentwicklung beantwortet werden, darunter Neurogenese, neuronale Migration und neuronale Morphogenese. Da die Analyse in einer annähernden Nachbildung der IBU-Umgebung durchgeführt wird, bietet sie eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung transgener oder Knockout-Tiere für Gene unbekannter Funktion. Schließlich hängt der Erfolg dieser in-vivo-Elektroporations-Experimente im Vergleich zur in-vivo-Elektroporations-Technologie nicht von chirurgischer Geschicklichkeit ab, erfordert kürzere Einarbeitungszeit und kann mit geringerem fachlichem Können durchgeführt werden.

Nach der Tötung einer trächtigen weiblichen Maus sezieren Sie die Embryonen in eiskaltes, vollständiges HBSS aus und halten Sie diese in ihren individuellen Plazentasäcken. Danach lösen Sie in der kalten HBSS-Lösung einen Embryo aus dem Sack, schneiden den Kopf hinter der ersten Wirbelsäule ab, setzen eine Injektion an, platzieren den Kopf mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze auf einem Stück Paraform-Papier, das auf einer Petrischale liegt. Injizieren Sie sechs bis acht Mikroliter der DNA-Fast-Green-Mischung durch das dritte Ventrikel.

Dadurch füllt sich die Mischung in den kortikalen Vesikeln in beiden Seitenventrikeln. Für die Elektroporation werden BTX-Pinzettenelektroden aus Platin verwendet. Positionieren Sie die positive Elektrode auf der Seite des Kortex, die elektroporiert werden soll.

Beispielsweise sollte die Elektrode zur transkraniellen Elektroporation auf dem Kopf für den dorsalen Kortex platziert werden. Um eine hohe Transfektionseffizienz zu erzielen, stellen Sie die DNA-Konzentration stets auf ein Mikrogramm pro Mikroliter ein und verwenden Sie DNA, die aus einer Maxi-Präparation isoliert wurde. Falls erforderlich, verwenden Sie ein endotoxinfreies Reinigungsset, um die DNA nach der Elektroporation zu reinigen.

Den Kopf vor der Dissektion mindestens fünf Minuten auf Eis inkubieren. Es ist sehr wichtig, die richtige Menge elektrischer Impulse und Stromstärke bei der Elektroporation zu verwenden, um die jungen embryonalen Gehirne nicht zu schädigen. Nach der Elektroporation wird das Gewebe sehr empfindlich.

Es ist wichtig, die Dissektionen sehr sorgfältig durchzuführen, da Haut und Schädel an den Meningen der kortikalen Vesikel ziehen können, was diese beschädigen könnte, wenn sie aus dem Schädel entfernt werden. Nach fünf Minuten das Gehirn in kaltem HBSS dissezieren, indem man zunächst einen kleinen Einschnitt an der Kopfseite vornimmt und die Haut von den Seiten des Kopfes ablöst.

Danach vorsichtig mit feiner Pinzette die Pia von dem Gehirn ablösen. Entfernen Sie das intakte Gehirn aus dem Schädel. Bewahren Sie das Gehirn anschließend in eiskaltem HBSS auf und bereiten Sie die Gewebeeinbettung vor.

Füllen Sie die Formen mit 3 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Stellen Sie die Formen auf Eis, damit sich die Agarose nahe dem Boden der Form verfestigt. Achten Sie zunächst darauf, dass die Gehirne weiterhin gestützt und zentriert bleiben.

Entfernen Sie nun mit feinen Pinzetten vorsichtig ein Gehirn aus dem HBSS, nehmen Sie überschüssiges Puffermedium mit einem Kim-Tuch oder Filterpapier auf und legen Sie das Gehirn in das Niedrigschmelzpunkt-Agros. Anschließend verwenden Sie eine Pipettenspitze, um das Gehirn innerhalb der Form zu drehen, um den Kontakt zwischen Agros und Gewebe zu maximieren. Nachdem alle Gehirne übertragen wurden, positionieren Sie jedes Gehirn in etwa in derselben Orientierung und Tiefe innerhalb seiner Form.

Die Aros erstarren in etwa fünf Minuten. Arbeiten Sie daher schnell. Lassen Sie die Aros vollständig erstarren, indem Sie sie weitere fünf Minuten auf Eis inkubieren.

Schneiden Sie überschüssiges Aros vor dem Montieren der Blöcke ab. Befestigen Sie anschließend die Agros-Blöcke mithilfe eines schnell härtenden Kunststoffklebers aneinander, wobei jedes Gehirn in der Stapelung mit den Riechkolben nach oben ausgerichtet sein sollte. Sobald die Blöcke verbunden sind, schneiden Sie das Aros so zurecht, dass jedes Gehirn durch den Vibratom geschnitten werden kann.

Bringen Sie sie anschließend sofort in eiskaltes HBSS ein. Um die Blöcke zu schneiden, stellen Sie die Schneidegeschwindigkeit des Vibratoms auf eine niedrige Geschwindigkeit ein, etwa die Hälfte der maximalen Geschwindigkeit, und setzen Sie die Schwingungsfrequenz der Klinge auf die höchste Einstellung. Erzeugen Sie dann 250 Mikrometer dicke koronale Schnitte, nehmen Sie die Schnitte mit einem gebogenen feinen Spatel auf und überführen Sie sie mit einem feinen Pinsel oder einer Pinzette in Gewebekammern.

Falls das Gewebe aus dem Agaroseblock herausfällt, wurde der Kontakt zwischen Gewebe und Agarose im Gewebekulturhauben nicht ausreichend hergestellt. Bereiten Sie eine sechswellige Platte mit 1,8 Milliliter Schnittkulturmedium pro Vertiefung vor und geben Sie Organotypische Inserts mit Laminin-Polyl-Lysin-Beschichtung in jede Vertiefung. Fügen Sie 500 Mikroliter Schnittkulturmedium auf die Oberseite der organotypischen Gewebeschnitteinlagen hinzu. Überführen Sie anschließend bis zu fünf Schnitte in jedes Insert.

Als Nächstes entfernen Sie jegliche überschüssige Nährlösung von der Oberseite der Schnitte, um sicherzustellen, dass die Schnitte ihre Morphologie so weit wie möglich bewahren und minimale Zelltod aufweisen. Es ist wichtig, dass eine gesunde Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erhalten bleibt und die Schnitte nicht in der Nährlösung schwimmen. Inkubieren Sie die Schnitte abschließend bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator.

Ersetzen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediumvolumens unter der Membran. Die Schnitte sollten nicht auf dem Medium schwimmen. Neuronen, die elektroporierte Konstrukte exprimieren, können bereits acht Stunden nach der Elektroporation nach der gewünschten Kultivierungszeit sichtbar gemacht werden. Fixieren Sie die Schnitte in der Membran zur Analyse.

Waschen Sie jeden organischen typischen Insert fünf Minuten lang mit warmer PBS. Führen Sie insgesamt drei PBS-Waschungen durch und fixieren Sie das Gewebe anschließend eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit 4 % Paraformaldehyd. Nach der Fixierung können die Gewebe mit zellulären Markern analysiert oder einfach mit H&E-Färbung gefärbt werden. Nach einer Stunde waschen Sie die Schnitte dreimal für jeweils 10 Minuten mit 1× PBS.

Dann permeabilisieren Sie die Schnitte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer Lösung aus 10 % Ziegen-Serum in 1× PBS unter leichtem Schütteln. Anschließend färben Sie die Gewebe mit den Antikörpern eine Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie die Färbung durch drei Waschschritte zu je 10 Minuten in 1× PBS unter leichtem Schütteln, während Sie warten.

Legen Sie Objektträger mit Mattglas in eine Wasserwanne, die tief genug ist, um die Gewebe nach dem Aufbringen auf die Objektträger zu überfluten. Um die Schnitte zu montieren, schneiden Sie zunächst die Membran mit einem Skalpell frei.

Zweitens überführen Sie mit feinen Pinzetten bis zu fünf membranöse Schnitte auf jeden in Wasser getauchten Objektträger. Drittens entfernen Sie überschüssiges Wasser von jedem Objektträger. Viertens geben Sie einen Tropfen Einbettmedium auf jeden Gehirnschnitt.

Und schließlich vorsichtig einen Deckgläser auf die Schnitte legen und eventuelle Luftblasen entfernen. Die Schnitte sind dann je nach Menge der elektroporierten DNA und dem embryonalen Entwicklungsstadium bereit für die Mikroskopie. Bei der Elektroporation zeigte sich eine variable Transfektionseffizienz.

Acht Stunden nach der Transfektion mit einem P-Silencer begannen die GFP-Vektorzellen, GFP zu exprimieren. Während eines längeren Kultivierungszeitraums durchlaufen die Zellen eine normale Abfolge neurogener Ereignisse, einschließlich Proliferation, Migration und früher neuronaler Differenzierung. Diese Schnitte behielten ihre Morphologie fünf Tage lang bei, vorausgesetzt, die Medium-Luft-Grenzfläche wurde während des Durchführens dieses Verfahrens sorgfältig aufrechterhalten.

Es ist wichtig, das gesamte Experiment von dem Moment an, in dem das Tier euthanasiert wird, bis zu dem Zeitpunkt, zu dem die Schnitte in die Membraneinsätze gegeben werden, unter zwei Stunden durchzuführen, um den Zelltod nach diesem Verfahren zu minimieren. Weitere Maßnahmen wie die Zugabe exogener Faktoren zur organotypischen Lyse können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Rolle verschiedene Wachstumsfaktoren oder pharmakologische Wirkstoffe bei den unterschiedlichen neurodevelopmentalen Mechanismen spielen.