Name: Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese: Ex-vivo- RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Ex-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Genfunktion in der Entwicklung des murinen Hirnrindens. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Neurogenese und neuronaler Migration.

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Wir danken Dr. Shirin Bonni für die Bereitstellung der PSIL-GFP-Konstrukt, Dr. Alper Uzun für die Darstellung von 1, und die Leduc Bioimaging Anlage für die konfokale Mikroskopie. EMM wird durch den Career Award für die medizinische Wissenschaft von der Burroughs Wellcome Fund, ein NARSAD Young Investigators Award und NIH NCRR Cobre RR018728 P20-01 unterstützt. SBL wird durch NIH P20 NCRR Cobre RR018728-01 unterstützt wird, und erhielt Unterstützung von PHS NRSA 5T32MH019118-20.

1. Vorbereiten Kultur-Lösungen und Medien (nicht im Video) <ol><li> Planen 1 Liter physiologischer Kochsalzlösung vollständiger Hanks-Lösung (HBSS) mit 1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH 7,4), 30 mM D-Glucose, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 und 4 mM NaHCO 3. Fügen Sie doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O). Filter mit einem 0,2-um-Filter und Speicher bei 4 ° C sterilisieren </li><li> Slice Kulturmedium unter Verwendung von 35 ml Basal Medium Eagle Medium, 12,9 ml vollständigem HBSS, 20 mM D-Glucose (1,35 ml 1 M Lösung), 1 mM Glutamax (0,25 ml einer 200 mM Lösung), 0,5 ml Penicillin Streptomycin-100x Lager. Filter sterilisiert mit einer 0,2-um-Filter, fügen hitzeinaktiviertem Pferdeserum bis zu einer Endkonzentration von 5%. </li><li> Planen Laminin Arbeitslösung durch Herstellung einer 1 mg / ml Stammlösung Laminin mit sterilem destilliertem entionisiertem Wasser. Es werden 100 ul Aliquots in 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen und bei -80 ° C einfrieren </li><li> Planen Poly-L-Lysin arbeiten, sosung durch Zugabe von 5 ml sterilem H 2 O bis 5 mg Poly-L-Lysin zu einer 1 mg / ml Stammlösung zu machen. Bereiten Sie 1 mL Aliquots und bei -20 ° C. </li><li> Planen Beschichtungslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin und 100 ul Laminin auf ein Endvolumen von 12 ml mit sterilem Wasser. Machen Sie diese Lösung jedes Mal frisch. </li></ol> 2. Vorbereiten organotypischen Inserts (nicht im Video) <ol><li> Bereiten Sie zwei Sechs-Well-Platten mit einem Kultur-Einsatz pro Loch mit einer sterilen Pinzette. Geben Sie 2 ml steriles ddH 2 O unter den Kultur-Einsätze. </li><li> 1 ml der Beschichtungslösung auf der Oberseite der Membran dabei nicht Punktion der Membran. Inkubieren über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Entfernen Beschichtung Medien und Waschen Sie die Membran mit sterilem H 2 0 dreimal. Lassen Einsätze vor Gebrauch trocknen. In 1,8 ml Slice Kulturmedium und in 37 ° C-Inkubator. Wickeln Sie die nicht verwendeten Platten mit Parafilmund lagern bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen. </li></ol> 3. Vorbereitung für die Elektroporation (nicht im Video) <ol><li> Bereiten Sie RNAi-Konstrukten für die Elektroporation. Doppel-Strang-RNA-Haarnadel-Einsätze wurden in ein pSilencer kloniert. Das Plasmid enthält: 1) eine U6-Promotor, der die Doppelstrang-RNA-Generation antreibt; und 2) eine GFP-Expression Kassette durch den CMV-Promotor 8,9 angetrieben. Dieses Plasmid wurde zuvor von Konishi et al 9 und andere 7,8 beschrieben. Plasmide werden unter Verwendung eines Qiagen Maxi-Prep-Kit, und bei einer Konzentration von 1 mg / ml. </li><li> Um DNA sichtbar während der Injektion ist, bereiten Sie einen 0,5% schnell grünen Farbstoff-Lösung und nutzen es um 1:20 mit der DNA, die injiziert (in der Regel 20 uL von DNA mit 1 ul schnell grün) werden. Links über DNA-grünen Farbstoff schnell Mischung kann bei -20 ° C bis zu einer Woche aufbewahrt werden. </li><li> Saubere Dissektion Bereich, dissecting Werkzeuge und Vibratom Gefäß mit 70% Ethanol. Entspannen komplette HBSS, so dass es eiskalt ist. Gefühlt Vibratom Schiff durch die Verpackung Eis um es im Inneren des Vibratom mit etwas Wasser zum raschen Abkühlen. Bereiten Sie 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt mit kompletten HBSS. Mikrowelle für 1 min. Vermeiden Sie zu kochen. An einem 42 ° C im Wasserbad bis zum Gebrauch. </li><li> Die Elektroporation Parameter sind wie folgt festgelegt. Für einen Einsatz E15 Embryo 35 V, 5 Impulse, Länge 100 ms, 900 ms Intervall zwischen den Impulsen. Für ältere Tiere, die Elektroporation gewährleisten, verwenden Sie eine höhere Spannung bis 50 V oder erhöhen Sie die Anzahl der Impulse bis zu 8 Impulse. Um eine Beschädigung des Gewebes bei jüngeren Tieren, verwenden Sie entweder weniger Impulse oder bis zu 2 Pulse und niedrigere Spannung bis zu 25 V. Diese Parameter können variiert werden und empirisch ermittelt abhängig von dem Alter des Tieres. </li></ol> 4. Dissection und Elektroporation (im Video) <ol><li> Nach Tötung einer schwangeren Frau, sezieren Embryonen aus in eiskaltes komplette HBSS. Keep jeder Embryo in ihrer individuellen Plazenta-Säcke. </li><li> Sezieren Embryo aus und schnitt den Kopf nach dem ersten Wirbel. Halten Sie in eiskaltem HBSS komplette. </li><li> Für die Injektion setzen Sie den Kopf auf einem Stück Parafilm auf einer Petrischale. Mit maßgeschneiderten Hamilton-Spritze (siehe Tabelle I) injizieren etwa 6 bis 8 &amp;mgr; l DNA: schnell grünen Farbstoff-Mix durch den dritten Ventrikel, um in beiden Seitenventrikel in den kortikalen Vesikel zu füllen. Alternativ kann eine Injektion direkt in jedes lateralen Ventrikel durchgeführt werden. </li><li> Für die Ex-vivo-Elektroporation, verwenden BTX-Pinzette Platinelektroden. Legen Sie die positive Elektrode auf der Seite des Kortex Sie wollen also oben auf dem Kopf für die dorsale Kortikalis elektroporieren. </li><li> Nach der Elektroporation, bebrüten die Köpfe auf Eis für mindestens 5 Minuten vor dem Sezieren. </li><li> Gehirne sezieren in eiskaltem HBSSby er einen kleinen Schnitt an der Seite des Kopfes und Peeling die Haut von den Seiten des Kopfes. Als nächstes wird mitfeinen Pinzette vorsichtig ablösen, der pia aus dem Gehirn. Entfernen Sie das intakte Gehirn aus dem Schädel, dabei nicht auf den Kortex beschädigt werden. </li></ol> 5. Einbetten und Schneiden von elektroporiertem Rinden (im Video) <ol><li> Übertragen Sie 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in eine große Form auf Eis gestellt. Der Boden der Form beginnt, wird schneller, die Gehirne von versinkt bis auf den Boden der Form verhindern zu verfestigen. Sanft, übertragen Gehirn mit feinen Pinzetten eins nach dem anderen nach dem Entfernen der überschüssigen Puffer mit einem Kimwipe oder Filterpapier. Verwenden Sie eine 10 ul Pipettenspitze zu wirbeln die Gehirne im Inneren der Form, um maximale Schnittstelle zwischen der Agarose und Hirngewebe zu gewährleisten. </li><li> Orient die Gehirne aller Gehirne zu gewährleisten sind in der gleichen Ausrichtung und bei etwa dem gleichen Niveau in der Agarose. Lassen Sie die Agarose für ca. 5 min zu verfestigen. Verwenden Sie Bindekleber (Crazy Glue), um die Agarose-Blöcke, so dass die Riechkolben werden im Stehen zu befestigen. Sobald die Blöcke angebracht sind, sofort hinzuzufügen ice kaltem HBSS und schneiden Sie die Agarose zu machen, dass einzelne Segmente werden für jedes Gehirn erhalten. </li><li> Um die Blöcke in Scheiben schneiden, legen Sie die Vibratom die Geschwindigkeit auf eine niedrige Geschwindigkeit (etwa die Hälfte des Maximums) und stellen Sie die Klinge Schwingungsfrequenz bei der höchsten Einstellung. Generieren Sie 250-um dicke koronare Scheiben schneiden. Abrufen Scheiben mit einem gebogenen feinen Spatel und übertragen Sie sie auf Gewebe Brunnen mit einem feinen Pinsel oder einer Pinzette. </li><li> In Gewebekulturen Haube, übertragen Scheiben in beschichteten Einsätze. Fügen Sie 500 ul der Scheibe Kulturmedien zu jedem Einsatz, um die Übertragung einfach. Bis zu 5 Scheiben können pro Einsatz gebracht werden. Entfernen Sie überschüssige Medien aus der Oberseite der Scheiben und Inkubation bei 37 ° C in befeuchteten Inkubator. </li></ol> 6. Kultur und Analyse der organotypischen Slices (im Video) <ol><li> Um gesund Scheiben zu erhalten, sollte frisches Medium hinzugefügt mindestens jeden zweiten Tag unter der Membran durch den Ersatz der Hälfte der Medien jedes Mal sein. </li><li> Um Scheiben nach dem d analysierenesired Tagen in Kultur, fixieren Scheiben in der Membran. Waschen mit 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 37 ° C dreimal für jeweils 10 Minuten Zeit. Als nächstes wird mit 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht beheben bei 4 ° C oder für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Scheiben können mit verschiedenen zellulären Marker analysiert werden oder gefärbt mit Hoechst allein zu elektroporierte und nicht-elektroporierten Zellen sichtbar zu machen. Permeabilisieren und blockieren Scheiben für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10% Ziegenserum, 0,1% Triton in 1 × PBS unter leichtem Schütteln. </li><li> Färbung mit Hoechst für 1 Stunde bei Raumtemperatur, Waschen insgesamt 3 Mal mit 1 × PBS 10 min jeweils unter leichtem Schütteln. </li><li> Für die Montage von Scheiben schneiden die Membran mit einem Skalpell und einer feinen Pinzette verwenden, um die Membran mit Scheiben auf ein Milchglas zu übertragen Folien in einer Wasserkammer. Bis zu 5 Scheiben können pro Objektträger aus Glas gelegt werden. Entfernen Sie überschüssiges Wasser und einen Tropfen Flourmount Lösung in jedes Gehirn in Scheiben schneiden. Vorsichtig einen Deckglas oben auf den Hirnschnitten und entfernen Sie einy Luftblasen. Analysieren Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop. </li></ol> 7. Alternative Paraffineinbettung von organotypischen Slices (nicht im Video) <ol><li> Organotypische Scheiben auch für Paraffin für eine feinere morphologische Analyse eingebettet werden, zu diesem Zweck die Membran mit den organotypischen Scheiben können in 4% PFA, wie oben beschrieben befestigt werden. </li><li> Die festen Scheiben werden in 1% Agarose (auf 37 ° C vorgewärmt) eingebettet ist, und verfestigt Eis für 30 min. Die Agarose-Blöcke können dann nach in 4% PFA bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Die Agarose-Block mit dem organotypischen wird dann in Paraffin eingebettet und verarbeitet werden, wie zuvor für Immunfluoreszenz 10 beschrieben. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Eine schematische Darstellung der Elektroporation von murinen Cortex und Kultur von organotypischen Schnitten in 1 gezeigt. Diese Methode ist eine nützliche Strategie für rapid Bewertung der Funktion von Genen in der neuronalen Entwicklung 11 verwickelt. Je nach der Menge an DNA elektroporiert und der embryonalen Phase bei Elektroporation, wird die Transfektionseffizienz zu variieren. Scheiben beginnen, die GFP mindestens 8 Stunden nach der Elektroporation und Zellen wird die normale Abfolge der Ereignisse neurogenen (Proliferation, Migration, und Anfang der neuronalen Differenzierung) in Kultur zu unterziehen. Abbildung 2 zeigt ein elektroporierte Hirnschnitt, die Ausdruck einer Kontrolle wird pSilencer-GFP Vektor und kann man beobachten, neuronale Vorläuferzellen, die Migration Neuronen und differenzierten Neuronen in der Scheibe. Organotypische Slices ihrer Morphologie solange behalten, wie sie in einem guten Medien-Luft-Grenzfläche auf den Membranen erhalten werden und auch bis zu mindestens 5 Tagen in Kultur verwendet werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig1.jpg" /> Abbildung 1. Illustration von Ex-vivo-Elektroporation und organotypischenKultur Assay. E14.5 Embryonen sind, präpariert und einzeln mit DNA mit schnellen grünen Farbstoff gemischt injiziert, um die Injektionsstelle zu visualisieren. DNA kann in beiden der lateralen Ventrikel injiziert werden, wie in der Abbildung oder im dritten Ventrikel dargestellt, um der lateralen Ventrikel zu füllen. Nach der Injektion werden Gehirne mit einer Rechteckwelle Elektroporator elektroporiert, indem die positive Elektrode auf der gewünschten Seite des Gehirns. Gehirne werden in 3% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und geschnitten unter Verwendung eines Vibratom eingebettet. 250 um Hirnschnitten auf 0,4 um Einsätze platziert und bis zu einer Woche kultiviert. GFP nach 8 Stunden nach der Transfektion beobachtet werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3621/3621fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Analyse der elektroporierte Hirnschnitten. Elektroporiertem Hirnschnitten wurden für Hoechst gefärbt. Dorsale Kortikalis zeigt neuronale Vorläuferzellen elektroporiert bei der ventrikulären Zone (VZ). Neuronen im CortiCAL-Platte (cp) werden begrenzt durch die Randzone (mz). Weiße Pfeile zeigen die Migration Neuronen. In diesem Fall wurden Gehirne von E15.5 injiziert und Elektroporation mit einem GFP-Kontroll-Vektor pSilencer. Die Abschnitte repräsentieren kortikalen Explantate 4 Tage nach der Elektroporation. Maßstabsbalken 100 um. Fehlerbehebung: <ol><li> Niedrige Transfektionseffizienz: Passen Sie die Konzentration von DNA verwendet werden, um mindestens 1 ug / ul. Verwenden Sie immer sehr sauber DNA aus einer Maxi Prep gegebenenfalls Gebrauch eine Endo-free-Kit Quiagen die DNA zu reinigen. </li><li> Zellen in einer anderen Bereich des Gehirns als die gewünschte transfiziert: Sicherstellen, dass die Elektroden korrekt mit der positiven Elektrode in Richtung auf die Seite des Gehirns zu elektroporiert positioniert werden. </li><li> Organotypische Scheiben verlieren Morphologie: Change Medien jeden Tag und sorgen für die Scheiben nicht schwebend in Medien </li><li> Scheiben kommen aus der Agarose, wie sie in der vi geschnitten werdenbratome: Stellen Sie sicher, dass eine gute Schnittstelle gemacht wird, wenn die Einbettung der Gehirne in der Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt. </li></ol>

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<li>Sepp, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+outgrowth+genes+using+genome-wide+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi.</a> PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).</li>
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<li>Hand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Neurogenin2+specifies+the+migration+properties+and+the+dendritic+morphology+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Neuron. 48, 45-45 (2005).</li>
<li>Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Electroporation+as+a+Tool+for+Genetic+Manipulation+in+Vivo+to+Study+Psychiatric+Disorders%3A+From+Genes+to+Circuits+and+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors.</a> Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Diese Verfahren, die die Ex-vivo-Elektroporation von Plasmiden, die doppelsträngige RNA-Haarnadeln 8 und Kultur der organotypischen Slices 4 bieten mehrere deutliche Vorteile. Erstens erlauben diese Methoden für eine schnelle Beurteilung der RNAi-derived Phänotypen. Die Einbeziehung einer Expressionskassette GFP-codierende in der gleichen pSilencer Vektor, der die U6-Promotor, der die doppelsträngige RNA-Haarnadel treibt enthält ermöglicht eine schnelle Identifizierung und Charakterisierun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze </td><td> HAMILTON </td><td> 80008 </td><td> 31 Gauge, 0,5 cm lang, PT-4 (Ebene der Punkt Abschrägung), 10 &amp;mgr; l Volumen </td></tr><tr><td> Platinum Tweezertrodes </td><td> BTX </td><td> 45-0489 </td><td> 5mm Größe </td></tr><tr><td> ECM830 Elektroporator </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td></td></tr><tr><td> BTX-Fußschalter </td><td> BTX </td><td> 45-0208 </td><td> Für den Einsatz mit ECM830 Elektroporator </td></tr><tr><td> Vibrierender Klinge Mikrotom </td><td> LEICA </td><td> VT1000 S </td><td></td></tr><tr><td> 6 - gut zu Gericht mit Beilagen verwenden </td><td> FALCON </td><td> 353502 </td><td> Enthält Kerben auf Einsätze passen </td></tr><tr><td> Zellkultureinsätze </td><td> FALCON </td><td> 353090 </td><td> 0,4 Mikrometer </td&gt; </tr><tr><td> Fast Green </td><td> SIGMA </td><td> F7252 </td><td></td></tr><tr><td> Niedrig schmelzender Agarose </td><td> FISHER </td><td> BP165-25 </td><td> DNA-Klasse </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5899 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B-1522 </td><td></td></tr><tr><td> 10x HBSS ohne Ca und Mg </td><td> GIBCO </td><td> 14180-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-freier Säure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H4034 </td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zur untersuchung der neuronalen morphogenese:<em&gt; ex-vivo-</em&gt; rnai elektroporation in embryonale murine cerebral cortex

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

Die Großhirnrinde leitet höheren kognitiven Funktionen. Diese sechs Schichtstruktur in einer Innenseite-Zuerst-, Außen-letzten Weise, in der die ersten geboren Neuronen bleiben näher an den Ventrikel während die letzten geboren Neuronen an den ersten geboren Neuronen in Richtung der Oberfläche des Gehirns 1 durchwandern erzeugt. Neben der neuronalen Migration 2, ist ein wichtiger Prozess für die normale Funktion der kortikalen Regulation der neuronalen Morphogenese 3. Während die neuronalen Morphogenese in vitro in primären Kulturen untersucht werden können, gibt es viel zu aus, wie diese Prozesse werden im Gewebe reguliert Umgebungen gelernt werden. Wir beschreiben Techniken, um neuronale Migration und / oder Morphogenese in organotypischen Schnitten der Großhirnrinde 4,6 analysieren. Ein pSilencer modifizierte Vektor verwendet wird, die sowohl eine U6-Promotor, der die doppelsträngige Haarnadel-RNA antreibt und einen separaten Expressionskassette, die GFP-Protein codiert, b angetriebenya CMV-Promotor 7-9. Unser Ansatz ermöglicht die schnelle Beurteilung von Defekten in Neuritenwachstum auf spezifischen Knockdown von Kandidatengenen und wurde erfolgreich in einem Screen für Regulatoren der Neuritenwachstum 8 verwendet. Da nur ein Teil der Zellen die RNAi-Konstrukte zum Ausdruck bringen wird, erlauben die organotypischen Slices für ein Mosaik Analyse der potenziellen Phänotypen. Darüberhinaus ist der Analyse in einem in der Nähe Angleichung der in vivo-Umgebung durchgeführt wird, bietet es eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren für Gene unbekannter Kortex. Schließlich, im Vergleich zu in vivo Elektroporation Technologie, ist der Erfolg der Ex-vivo-Elektroporation Experimente nicht auf die Entwicklung von Fähigkeiten beherrschen Operation abhängig und kann mit einer kürzeren Ausbildung Zeit und Geschick durchgeführt werden.

Um eine rasche Beurteilung der Funktion von Genen in der Entwicklung der Hirnrinde führen, beschreiben wir Verfahren, die die<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elektroporation von Plasmiden co-exprimieren, inhibitorische RNA (RNAi) und GFP in murinen embryonalen Kortex. Dieses Protokoll ist offen für das Studium der verschiedenen Aspekte der Entwicklung des Nervensystems, wie zB Neurogenese, neuronale Migration und neuronalen Morphogenese einschließlich Dendriten und Axonen Auswuchs.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Der cerebrale Kortex steuert höhere kognitive Funktionen. Diese sechsschichtige Struktur entsteht nach dem Prinzip „inside-first, outside-last“, bei dem die ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine schnelle Bewertung der Genfunktion bei der Entwicklung der Großhirnrinde mithilfe von organspezifischen Schnitten durchzuführen. Dies wird erreicht, indem Plasmide, coex, exprimierende und inhibitorische RNA sowie einen GFP-Marker in die embryonale Großhirnrinde eingebracht werden. Kurze elektrische Impulse werden auf das Gehirn angewendet, wodurch die Plasmid-DNA in die neuronalen Vorläuferzellen transfiziert werden kann.Anschließend werden die Gehirne disseziert, eingebettet und in Schnitte geteilt, um organspezifische Schnitte zu erzeugen, die ex vivo eine neuronale Morphogenese durchlaufen können. Mithilfe dieser organspezifischen Schnitte lassen sich kortikale Neuronensubpopulationen mit Wander- oder morphologischen Defekten identifizieren, indem die GFP-markierten Zellen direkt beobachtet werden. Hallo, willkommen heute in meinem Labor an der Brown University, Abteilung für Molekularbiologie. Dr. Liza sowie zwei Studenten, Kat Zer und Mark Seba, werden die ex-vivo-Elektroporationstechnik und die Kultur organspezifischer Schnitte demonstrieren, eine äußerst nützliche Methode für neurodevelopmentelle Untersuch

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das...

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Dieses Protokoll enthält Anweisungen für die direkte Beobachtung von radial migrierenden kortikalen Neuronen. In der utero- Elektroporation werden die organotypische Scheibenkultur und die konjunkturelle Bilddarstellung kombiniert, um die Effekte der Überexpression oder der Abregulation von Genen von Interesse bei der Migration von Neuronen direkt und dynamisch zu untersuchen und ihre Differenzierung während der Entwicklung zu analysieren.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das entwickelt wurde, um die Aktivität kortikaler Interneureuritoren zu manipulieren, die in den Kortex von frühen postnatalen Mäusen transplantiert wurden.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

Dieses Protokoll demonstriert eine einfache und robuste Methode zur Untersuchung des In-situ-Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik. Es beschreibt, wie ex vivo physiologisch relevante akute Hirnschnitte hergestellt werden können und stellt eine benutzerfreundliche Analysepipeline zur Verfügung.

In situ Visualisierung des Axonwachstums und der Wachstumskegeldynamik in akuten ex vivo embryonalen Hirnschnittkulturen

Erfahren Sie die Ex-vivo-Elektroporation zur Untersuchung der Genfunktion in der Entwicklung des murinen Hirnrindens. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Neurogenese und neuronaler Migration.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:

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