Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese: Ex-vivo- RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, eine schnelle Beurteilung der Genfunktion in der Entwicklung der Großhirnrinde mit Hilfe von organotypischen Schnitten durchzuführen. Dies wird durch die Einführung von Plasmiden, Coex, exprimierender und inhibitorischer RNA und A GFP-Markern in die Großhirnrinde der Murn erreicht. Kurze elektrische Stöße werden an das Gehirn appliziert, so dass die Plasmid-DNA die neuronalen Vorläuferzellen transfizieren kann.

Als nächstes werden die Gehirne präpariert, eingebettet und geschnitten, um organotypische Schnitte zu erzeugen, die ex vivo eine neuronale Morphogenese durchlaufen können. Die organotypischen Schnitte können durch direkte Beobachtung der GFP-markierten Zellen nach kortikalen Neuronen-Subpopulationen mit wandernden oder morphologischen Defekten durchsucht werden. Hallo, willkommen in meinem Labor an der Brown University in der Abteilung für Molekularbiologie, Dr. Liza und zwei Studenten, Kat Zer und Mark Seba, werden heute die Ex-vivo-Elektroporationstechnik und die organotypische Schnittkultur demonstrieren, die eine sehr nützliche Technik für neurologische Entwicklungsstudien ist.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in verschiedenen Aspekten der Neuroentwicklung zu beantworten, einschließlich der Neurogenese, der neuronalen Migration und der neuronalen Morphogenese. Da diese Analyse in einer Annäherung an die IBU-Umgebung durchgeführt wird, bietet sie eine kostengünstige und schnelle Alternative zur Erzeugung von transgenen oder Knockout-Tieren für Gene mit unbekannter Funktion. Schließlich hängt der Erfolg dieser vivo-Elektrooperationsexperimente im Vergleich zur In-vivo-Elektrooperationstechnologie nicht von einer kompetenten Chirurgie und der Entwicklung von Fähigkeiten ab und kann mit einer kürzeren Trainingszeit und einer geringeren Fertigkeit durchgeführt werden.

Nachdem Sie eine trächtige weibliche Maus eingeschläfert haben, zerlegen Sie die Embryonen in eiskalte, vollständige HBSS und bewahren Sie sie in ihren einzelnen Plazentasäcken auf. Lassen Sie dann in der kalten HBSS-Lösung einen Embryo aus dem Sack los und schneiden Sie seinen Kopf nach dem ersten Wirbel für eine Injektion ab, legen Sie den Kopf mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze auf ein Stück Paraform-Papier auf eine Petrischale. Injizieren Sie sechs bis acht Mikroliter DNA fast green mix durch den dritten Ventrikel.

Von dort aus füllt die Mischung beide Seitenventrikel in den kortikalen Vesikel. Für die Elektroporation werden BTX-Pinzetten-Platinelektroden verwendet. Platzieren Sie die positive Elektrode in Richtung der Seite des Kortex, die elektroporiert werden soll.

Zum Beispiel sollte sich die Elektrode auf dem Kopf befinden Für den dorsalen Kortex. Für eine hohe Transfektionseffizienz stellen Sie die DNA-Konzentration immer auf ein Mikrogramm pro Mikroliter ein und verwenden Sie DNA, die aus einem Maxi-Präparat isoliert wurde. Verwenden Sie bei Bedarf ein endotoxinfreies Kit, um die DNA nach der Elektroporation aufzureinigen.

Inkubieren Sie den Kopf mindestens fünf Minuten lang auf Eis, bevor Sie ihn präparieren. Es ist sehr wichtig, bei der Elektroporation die richtige Menge an elektrischen Impulsen und Strom zu verwenden, um eine Schädigung der jüngeren embryonalen Gehirne zu vermeiden. Nach der Elektroporation wird das Gewebe sehr brüchig.

Es ist wichtig, die Dissektionen sehr sorgfältig durchzuführen, da die Haut und die Schule an den Hirnhäuten der kortikalen Vesikel ziehen können, was die kortikalen Vesikel beschädigen könnte, wenn sie aus dem Schädel entfernt werden. Präparieren Sie nach fünf Minuten das Gehirn in Kälte. HBSS beginnt damit, einen kleinen Schnitt an der Seite des Kopfes zu machen und die Haut an den Seiten des Kopfes abzuschälen.

Als nächstes schälen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Pia aus dem Gehirn. Entferne das intakte Gehirn aus dem Schädel. Wenn Sie fertig sind, halten Sie das Gehirn in eiskaltem HBSS und bereiten Sie sich darauf vor, das Gewebe einzubetten.

Beginnen Sie mit dem Befüllen der Formen mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 3 %. Agros. Lege die Formen auf Eis, damit sich das Agros in der Nähe des Bodens der Form verfestigt. Erstens, sicherzustellen, dass das Gehirn gestützt und zentriert bleibt.

Entfernen Sie nun mit einer feinen Pinzette vorsichtig ein Gehirn aus dem HBSS, absorbieren Sie überschüssigen Puffer mit einem Kim-Tuch oder Filterpapier und stellen Sie das Gehirn auf den niedrigen Schmelzpunkt ein. Agros. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze, um das Gehirn in der Form zu wirbeln, um den Kontakt zwischen Agros und Gewebe zu maximieren. Nachdem alle Gehirne übertragen wurden, positionieren Sie jedes Gehirn in ungefähr der gleichen Ausrichtung und Tiefe innerhalb seiner Form.

Die Aros verfestigen sich in etwa fünf Minuten. Arbeiten Sie also schnell. Lassen Sie die Aros vollständig erstarren, indem Sie weitere fünf Minuten auf Eis inkubieren.

Schneiden Sie überschüssige Aros ab, bevor Sie die Blöcke montieren. Befestigen Sie dann die Agros-Blöcke mit einem schnell haftenden Kunststoffkleber aneinander, jedes Gehirn in einem Stapel sollte mit seinen Riechkolben nach oben positioniert werden. Sobald die Blöcke befestigt sind, schneide die Aros ab, um sicherzustellen, dass jedes Gehirn vom Vibrato zerschnitten wird.

Tauchen Sie sie dann sofort in eiskaltes HBSS. Um die Blöcke zu schneiden, stellen Sie die Geschwindigkeit des Vibratos auf eine niedrige Geschwindigkeit ein, etwa die Hälfte des Maximums, und stellen Sie die Vibrationsfrequenz des Blattes auf die höchste Stufe ein. Erzeugen Sie dann 250 Mikrometer dicke koronale Scheiben, entnehmen Sie die Scheiben mit einem gebogenen feinen Spatel und übertragen Sie sie mit einer feinen Bürste oder Pinzette in die Gewebevertiefungen.

Wenn das Gewebe aus dem Agros herausfällt, wurde der Gewebe-Agros-Kontakt in einer Gewebekulturhaube nicht ausreichend gebildet, bereiten Sie eine Sechs-Well-Platte mit 1,8 Millilitern Scheibenkulturmedium pro Well vor und platzieren Sie in jedem Well organotypische Inserts mit dem Code von Laminin Polity Lysin. Nun, geben Sie 500 Mikroliter Scheibennährmedium auf die Oberseite der organotypischen Scheibeneinsätze. Übertragen Sie dann bis zu fünf Scheiben auf jede Einlage.

Entfernen Sie anschließend überschüssige Medien von der Oberseite der Scheiben, um sicherzustellen, dass die Scheiben ihre Morphologie so weit wie möglich erhalten und einen minimalen Zelltod aufweisen. Es ist wichtig, dass eine gesunde Flüssigluft-Grenzfläche erhalten bleibt und die Scheiben nicht im Medium schwimmen. Zum Schluss inkubieren Sie die Scheiben bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator.

Tauschen Sie alle zwei Tage die Hälfte des Medienvolumens unter der Membran aus. Die Scheiben sollten nicht auf dem Medium schweben, Neuronen, die elektroporierte Konstrukte exprimieren, können bereits acht Stunden nach der Elektroporation nach den gewünschten Tagen der Kultivierung sichtbar gemacht werden. Fixieren Sie die Scheiben für die Analyse in der Membran.

Waschen Sie jede Bio-typische Einlage fünf Minuten lang mit warmem PBS. Führen Sie insgesamt drei PBS-Waschungen durch und fixieren Sie das Gewebe dann eine Stunde lang mit 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Nach der Fixierung können die Gewebe mit zellulären Markern analysiert oder einfach mit Haken gefärbt werden. Nach einer Stunde waschen Sie die Scheiben mit drei 10-minütigen Wäschen in einem XPBS.

Anschließend die Scheiben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in einer 10%igen Ziegenserumlösung in einem XPBS unter leichtem Schütteln durchlässig machen. Anschließend färben Sie die Taschentücher mit Haken eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Entfernen Sie den Fleck mit drei 10-minütigen Wäschen in einem XPBS mit leichtem Schütteln während der Wartezeit.

Lege die Objektträger aus Milchglas in eine Wasserkammer, die tief genug ist, um das Taschentuch zu baden, nachdem sie auf die Objektträger gelegt wurden. Zum Mounten der Scheiben. Schneiden Sie zunächst die Membran mit einem Skalpell frei.

Übertragen Sie anschließend mit einer feinen Pinzette bis zu fünf membrangebundene Scheiben auf jeden Objektträger, der in Wasser getaucht ist. Drittens, entfernen Sie überschüssiges Wasser von jeder Rutsche. Viertens, tragen Sie einen Tropfen Bodenhalterungslösung auf jede Gehirnscheibe auf.

Und zum Schluss legen Sie vorsichtig einen Deckslip auf die Scheiben und entfernen Sie alle Luftblasen. Die Scheiben sind dann bereit für die Mikroskopie, abhängig von der Menge der elektroporierten DNA und dem Embryonalstadium. Bei der Elektroporation wurde festgestellt, dass die Transfektionseffizienz variiert.

Acht Stunden nach der Transfektion mit einem P-Schalldämpfer begannen GFP-Vektorzellen mit der Expression von GFP. Während einer längeren Kultivierungsperiode durchlaufen Zellen eine normale Abfolge neurogener Ereignisse, einschließlich Proliferation, Migration und früher neuronaler Differenzierung. Diese Schichten behielten ihre Morphologie fünf Tage lang bei, vorausgesetzt, die Medienluftschnittstelle wurde während des Versuchs dieses Verfahrens gut gepflegt.

Es ist wichtig, das gesamte Experiment von dem Moment an, in dem das Tier eingeschläfert wird, bis zu dem Moment, in dem die Scheiben in die Membraneinsätze gelegt werden, in weniger als zwei Stunden durchzuführen, um den Zelltod nach diesem Verfahren zu minimieren. Andere wie die Hinzufügung exogener Faktoren zur organotypischen Lyse können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten wie: Welche Rolle spielen verschiedene Wachstumsfaktoren oder pharmakologische Wirkstoffe bei den verschiedenen neurologischen Entwicklungsmechanismen?