Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Dieses Protokoll bietet eine In-vitro-Strategie, um Stammzellen aus Chitosan-Mikrosphären in ein Kollagengel-Gerüst zu bringen, zu ernten und zu kultivieren. Die primären Adipozyten-Stammzellen emulgieren dann und gewinnen ein Präparat aus Chitosan-Mikrosphären zurück. Als nächstes säen Sie die Stammzellen auf die Chitosan-Mikrosphären und kultivieren sie in einer Membrankulturplatte mit einer Porengröße von acht Mikrometern, um ein CS-geladenes CSM herzustellen, und mischen Sie schließlich das Mikrosphären-Verabreichungssystem mit einem dreidimensionalen Kollagengelgerüst.

Letztendlich bietet dieses CSM-System Potenzial für den Einsatz in der regenerativen Medizin und bei der Verabreichung von Medikamenten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zellinjektion oder Mikroverkapselung ist die Fähigkeit der Zellen, sich an ein Trägermaterial zu binden und nach der ersten Anwendung bestehen zu bleiben. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da Esan-Mikrosphären eine inhärente statische Ladung haben.

Und das Aufladen von Zellen über einem Mikrosphärenbett wird eine Herausforderung darstellen, ohne sie zu stören. Exzisieren und waschen Sie perineales und epidermales Fettgewebe aus einem Wickel, zerkleinern Sie das Gewebe und geben Sie dann ein bis zwei Gramm in 25 Milliliter HBSS mit 1 % FBS. Nach der Zentrifugation wird die frei schwebende Fettgewebeschicht in einem 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben gesammelt.

Fügen Sie 25 Milliliter Kollagenase Typ zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion auf einem Orbitalschüttler. Entfernen Sie nun vorsichtig die flüssige Fraktion unterhalb der Öl- und Fettschicht und filtern Sie nacheinander durch Nylon-Netzfilter von 170 Mikrometern. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation nach zwei Wäschen mit 25 Millilitern.

HBSS Resus, suspendieren Sie das Pellet in 30 Millilitern ergänztem Mesen pro Wachstumsmedium. Die gereinigten aus Fett gewonnenen Stammzellen werden in zwei T 75-Kulturflaschen aufgeteilt und das A SC-Präparat in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius amplifiziert. Bei diesem CSM-Protokoll handelt es sich um einen Wasser-in-Öl-Emulgierungsprozess, bei dem eine ionische Koer-Technik zum Einsatz kommt.

Emulgieren Sie sechs Milliliter einer wässrigen Chitosanlösung in 100 Millilitern eines Ölphasengemisches unter gleichzeitigem Überkopf- und Magnetrühren in entgegengesetzter Richtung für eine Stunde zu der stabilen Wasser- und Ölemulsion, fügen Sie vier Stunden lang alle 15 Minuten 1,5 Milliliter 1,5 Milliliter 1%iges Kaliumhydroxid in n Oktal zu. Nach Abschluss der ionischen Vernetzungsreaktion die Ölphase langsam dekantieren und die Kügelchen sofort mit 100 Millilitern Aceton auffüllen. Waschen Sie die Kugeln mit Aceton, bis die Ölphase vollständig entfernt ist.

Trocknen Sie dann die zurückgewonnenen Kugeln in einem Vakuum. Bestimmen Sie mit dem Partikelgrößenanalysator die durchschnittliche CSM-Partikelgrößenoberfläche pro Milligramm und das kubische Volumen der Einheit. Waschen Sie CSM dreimal mit sterilem Wasser, um Salzreste zu entfernen.

Sterilisieren Sie nun das CSM-Präparat mit absolutem Alkohol für die Verwendung in Zellexperimenten in einem 50-Milliliter-Glasröhrchen, mischen Sie fünf Milligramm Mikrokügelchen mit einem Milliliter 0,5%iger TNBS-Lösung, inkubieren Sie vier Stunden lang bei 40 Grad Celsius. Dann drei Milliliter sechs normale Salzsäure zugeben und zwei Stunden bei 60 Grad Celsius inkubieren. Nachdem Sie die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie fünf Milliliter entionisiertes Wasser und 10 Milliliter Ethelether hinzu.

Um das freie TNBS zu extrahieren, wird ein Fünf-Milliliter-Aliquot der wässrigen Phase entfernt und in einem Wasserbad 15 Minuten lang auf 40 Grad Celsius erwärmt, um den Restether nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur zu verdampfen. Mit einem Spektralphotometer mit 15 Millilitern Wasser verdünnen. Messen Sie die Absorption der präparierten Chitosan-Mikrokügelchen bei 345 Nanometern mit TNBS als Blindwert.

Messen Sie auch das Chitosan, das für die CSM-Zubereitung verwendet wurde. Berechnen Sie nun die Anzahl der freien Aminogruppen des CSM im Verhältnis zur Gesamtzahl der Aminogruppen in Chitosan. Äquilibrieren Sie fünf Milligramm des sterilisierten CSM über Nacht in sterilem HBSS.

Übertragen Sie das CSM auf einen Acht-Mikron-Membraneinsatz für 24-Well-Kulturplatten. Nachdem sich das CSM abgesetzt hat, saugen Sie das HBSS vorsichtig an. Geben Sie nun 300 Mikroliter Anzuchtmedium auf die Innenseite des Einsatzes und 700 Mikroliter Anzuchtmedium auf die Außenseite des Einsatzes. Wiederbelebung.

Suspendieren Sie die aus Fett gewonnenen Stammzellen in 200 Mikrolitern Wachstums-, Medium- und Samenmaterial über dem CSM in der Kulturplatte. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie das mit SC beladene CSM in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Zellen zu stören, die in die Einsatzmembran migriert sind.

Entfernen Sie nun das restliche Medium und geben Sie 250 Mikroliter frisches Wachstumsmedium in jedes Röhrchen. Fügen Sie 25 Mikroliter mit fünf Milligramm MTT-Lösung pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie vier Stunden lang. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 250 Mikroliter Dimethylsulfoxid-Wirbel hinzu, um die Form der Komplexzentrifuge zu lösen, das CSM bei 2.700 G für fünf Minuten.

Messen Sie die Überstandsextinktion bei 570 Nanometern mit 630 Nanometern als Referenz. Fahren Sie fort, um die mit dem CSM assoziierte Zellzahl im Verhältnis zum Absorptionswert zu bestimmen, der aus der bekannten Anzahl lebensfähiger A-SC erhalten wird. Mischen Sie fünf Milligramm eines mit SC beladenen CSM mit 7,5 Milligramm pro Milliliter. Kollagen Typ eins, das aus Ratten gewonnen wird.

Schwanzsehne, den pH-Wert mit zwei normalen Natriumhydroxiden auf 6,8 einstellen und in eine Kulturplatte füllen. Jetzt zum Fibrillat einsetzen, auf eine 12-Well-Platte geben und 30 Minuten inkubieren. Frischen Sie das Medium für die Kollagen-A-S-C-C-S-M-Gele jeden zweiten Tag der Inkubationszeit auf.

Überwachen, Freisetzen und Migrieren von Zellen aus CSM in das Gel mit Standard-Mikroskopietechniken. Das folgende Beispiel beschreibt die in vitro Strategie, aus Fett gewonnene Stammzellen aus Chitosan-Mikrosphären in ein Kollagen-Gel-Gerüst zu bringen. REM- und TEM-Aufnahmen deuten auf eine Präparation von porösem CSM einheitlicher Größe hin.

Die Inkubation der Mikrosphären mit primären Fettstammzellen ergibt 4.000 Zellen pro Milligramm CSM Calcium am. Die Färbung eines SC zeigt eine Ausbreitung über das CSM mit Ausdehnung der Filopodien in die porösen Spalten der Mikrosphäre. Wenn die zellbeladenen CSM mit dem Kollagengel gemischt wurden, wandern die Zellen in das Gel und können im Laufe der Zeit verfolgt werden.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich unmittelbar auf die Therapie von massivem und chronischem Gewebeverlust. Dieses Behandlungsschema hat jedoch aufgrund seiner Vielseitigkeit ein viel größeres Potenzial, sich in eine Vielzahl von Zellen und/oder Biomaterialien zu integrieren, die zur Behandlung unterschiedlicher Grade von Weich- und Herzgewebeverlusten verwendet werden. Ich bezweifle, dass diese Methode einen Einblick in die Verabreichung von Wirtszellen geben kann.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. Injektionsmittel, die Verabreichung von therapeutischen Medikamenten und die Entwicklung von Hybridsystemen, um sowohl Zellen als auch therapeutische Medikamente zusammen zu verabreichen.