Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die neuronale Aktivität mittels Calcium-Bildgebung gleichzeitig mit der Beobachtung des Fressverhaltens zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Fliege in die Fliegenapparatur eingesetzt wird. Anschließend wird der Kopf der Fliege präpariert, um das Gehirn freizulegen.

Die Fliegenapparatur mit der präparierten Fliege wird dann auf dem Mikroskopständer positioniert. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Stimulation von pro Bois mit einem Zuckerdocht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Aktivierung eines identifizierten Neurons mittels Kalzium-Bildgebung zeigen, korreliert mit der Probus-Ausstülpung durch Videoaufzeichnung des Verhaltens.

Die Idee zu dieser Methode hatte ich erstmals, als ich über die Augen von Bieren nachdachte, die auf der Wasseroberfläche schwimmen. Wir Biere haben geteilte Augen und können sowohl über als auch unter der Wasseroberfläche sehen. Ein heikler Punkt meines Experiments ist, dass das Gehirn und die SCUs nahe beieinanderliegen, aber wenn sie sauber getrennt sind, wie die Augen von uns Bieren, können wir die SCUs trocken halten, während das Gehirn im Satelliten freigelegt ist.

Dazu habe ich eine sehr einfache Trennwand direkt oberhalb der SCUs angebracht, um die trockene Seite vom Breitenbereich zu trennen. Gestalten Sie eine Plattform aus dem Deckel einer 35-Millimeter-Falcon-Schale, indem Sie die Seitenwand schmelzen und so formen, dass sie einen geeigneten Winkel und eine geeignete Dicke aufweist. Bohren Sie ein Loch in die Plattform, um den Fliegenkopf aufzunehmen, sodass die Mundteile frei nach außen zugänglich sind. Schneiden Sie das Ende einer Pipettenspitze so weit ab, dass der Fliegenkörper gerade hineinpasst, und kleben Sie die Spitze dann auf die Plattform.

Nachdem eine erwachsene Fliege 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius gehungert hat, betäuben Sie die Fliege, indem Sie sie mit einer Pinzette in ein 15-Milliliter-Kunststoffröhrchen geben und dieses auf Eis stellen. Führen Sie eine Fliege in die Kammer der Fliegen ein, und schieben Sie sie vorsichtig hinein, bis sie sich nicht mehr bewegen kann.

Versiegeln Sie die umgebenden Teile des proximalen Rüssels oder Rostrums, indem Sie einen kleinen Tropfen lichthärtenden Kleber an den Seiten und oberhalb des Rostrums auftragen und diesen mit einer Wimper oder einem ähnlichen Werkzeug vorsichtig verteilen. Tragen Sie den Kleber außerdem von der Innenseite der Fliegen aus auf den Zwischenraum zwischen dem dorsalen Kopfbereich und der inneren Kante des Lochs auf. Härteten Sie den Kleber abschließend mit der schwächsten blauen Beleuchtung aus, die zum Aushärten ausreicht, um die Fliege nicht zu schädigen.

Um den Kopf der Fliege zu stabilisieren und den ventralen Teil des SOG freizulegen, befestigen Sie einen Faden, um den Rostrum teilweise angehoben zu halten. Wenn die Fliege fixiert ist, füllen Sie die Oberfläche der Plattform mit einer zuckerfreien Salzlösung. Öffnen Sie die Kopfkapsel mit einer Wolframklinge und einer Pinzette mit geschärften Spitzen, die wir als geschärfte Pinzette bezeichnen, um den SOG freizulegen.

Scis-Zips. Dies ist eine Demonstration von Scis-Zips, bei der eine Faser von einem Kim-Tuch zum Vergleich abgeschnitten wird. Zunächst erfolgt dies mit Iris-Scheren im Sichtfeld und anschließend vor einem millimeterunterteilten Lineal.

Zunächst mit der Wolframklinge einen Einschnitt entlang der hinteren Kante führen. Anschließend mit der geschärften Pinzette die Seiten- und vordere Kante durchtrennen. Das geschnittene Cuticula-Stück mit der Pinzette anheben und entfernen.

Schneiden Sie die Antennen und Antennennerve mit der Pinzette ab. Entfernen Sie anschließend gezielt die Luftsäcke zwischen dem SOG und der Cuticula, um das Gehirn zu stabilisieren und Bewegungsartefakte zu vermeiden. Schneiden Sie danach die Speiseröhre am Ende zum Pharynx hin und am Ende, das in das SOG verläuft, durch, um die Verbindung zwischen Pharynx und Gehirn zu trennen.

Danach, nachdem Muskel 16 identifiziert und herausgezogen wurde, alle Tracheen, die das Gehirn und das Cuticula verbinden, ablösen. Die Fliegen auf die Probehalterung eines rotierenden Scheiben-Konfokalmikroskops geben und auf das Wassereintauchobjektiv für die Bildaufnahme umstellen. Anschließend einen einzelnen optischen Schnitt bei vier Hertz mit einer Belichtungszeit von 122 Millisekunden unter Verwendung eines 491 Nanometer Anregungslasers aufnehmen, der auf den Bereich von Interesse fokussiert ist.

Verwenden Sie eine Spritzennadel mit einem kleinen Docht aus japanischem Papier, der aus der Spitze herausragt, um der Fliege Saccharose anzubieten. Geben Sie einen kleinen Tropfen Saccharoselösung auf den Docht und saugen Sie ihn anschließend mit einem Injektor auf, der über einen flexiblen Schlauch mit der Nadel verbunden ist, wobei Sie die Nadel mit einem Joystick-Manipulator halten.

Legen Sie den durchtränkten Papierdocht kurzzeitig auf die Spitze der Fühler, jedoch nur für einen Augenblick, um eine Sättigung zu vermeiden. Überwachen Sie die Ausdehnungsreaktion des PROBUS oder das PER-Verhalten gleichzeitig mit der Kalzium-Bildgebung unter Verwendung einer an ein Stereomikroskop angebundenen CCD-Kamera, und stellen Sie sicher, dass die Daten innerhalb einer Stunde nach der Präparation erfasst werden.

Hier ist eine typische Verlängerungsreaktion des Proboscis auf eine Stimulation mit einem WIC, der 100 Millimolar Saccharose enthält. Wässrige Lösung, abgebildet mit einem 491 Nanometer Laser für G-CAMP-Fluoreszenz. Die gleichzeitige Kalzium-Bildgebung während des Verlängerungsverhaltens des Proboscis, hier zuerst vor und dann nach der Stimulation gezeigt, ermöglicht die Visualisierung der durch Saccharose induzierten GAMP-3.0-Antworten im Motoneuron für den Protractor-musculus des Rostrums.

Bei der zeitlichen Quantifizierung der auf Saccharose induzierten GAMP 3.0-Antwort zeigt sich, dass die Motoneuronen auf einen Saccharose-Reiz mit einem starken Anstieg der Fluoreszenz reagieren, gefolgt von einer Wiederherstellungsphase von mehreren Sekunden bis zur Ausgangsbasis. Die Plattform ermöglicht auch andere Methoden wie Elektrophysiologie oder Optogenetik bzw. Psychogenetik oder chemische Aktivierung von Neuronen oder TimeLapse-Lab-Bildgebung von GFP-markierten Strukturen, um zusätzliche Fragen wie die Korrelation zwischen synaptischer Plastizität und Gedächtnis zu beantworten.