Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die neuronale Aktivität durch Kalziumbildgebung gleichzeitig mit der Beobachtung des Fressverhaltens zu überwachen. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Fliege in den Fliegenapparat eingeführt wird. Als nächstes wird der Fliegenkopf präpariert, um das Gehirn freizulegen.

Der Apparat der Fliege mit der präparierten Fliege wird dann auf dem Mikroskoptisch positioniert. Der letzte Schritt des Eingriffs ist die Stimulation von Pro Bois mit einem Zuckerdocht. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Aktivierung eines identifizierten Neurons durch Kalziumbildgebung zeigen, die mit der Probus-Ausdehnung korreliert, indem das Verhalten auf Video aufgezeichnet wird.

Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich über Augen von schlagenden Bieren nachdachte, die auf der Wasseroberfläche schwimmen. Wir Biere haben gespaltene Augen und können sowohl über als auch unter der Wasseroberfläche sehen. Ein kniffliger Punkt meines Experiments ist, dass das Gehirn und die SCUs nahe beieinander liegen, aber wenn sie schön getrennt sind wie die Augen von uns Bieren, können wir die SCUs trocken halten, während das Gehirn im Satelliten freigelegt ist.

Dazu habe ich eine sehr einfache Trennwand direkt über den SCUs gemacht, um die trockene Fläche von der Breite zu trennen. Forme eine Plattform aus dem Deckel einer 35-Millimeter-Falkenschüssel, indem ich die Seitenwand schmelze und sie schnitze, um einen angemessenen Winkel und eine angemessene Dicke zu bilden. Bohren Sie ein Loch in die Plattform, um den Fliegenkopf aufzunehmen, so dass die Mundwerkzeuge frei nach außen zeigen. Schneide das Ende einer Pipettenspitze gerade breit genug ab, um den Körper der Fliege aufzunehmen, und klebe die Spitze dann auf die Plattform.

Nach dem Hungern fliegt ein ausgewachsenes Tier 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Betäuben Sie die Fliege, indem Sie sie mit einer Pinzette in ein 15-Milliliter-Plastikröhrchen legen und auf Eis stellen. Führe eine Fliege in die Kammer der Fliegen ein und schiebe die Fliege vorsichtig hinein, bis sie sich nicht mehr bewegen kann.

Versiegeln Sie die umgebenden Teile des proximalen Rüssels oder Rostrums an der Innenkante des Lochs, indem Sie eine kleine Menge lichthärtenden Kleber auf die Seiten und über dem Rostrum auftragen und den Kleber mit einer Wimper oder einem ähnlichen Werkzeug vorsichtig verteilen. Trage den Kleber auch von der Innenseite der Fliegen auf den Raum zwischen dem dorsalen Teil des Kopfes und der Innenkante des Lochs auf. Zum Schluss härten Sie den Kleber mit der schwächsten Beleuchtung von blauem Licht aus, das für die Aushärtung ausreicht, um eine Beschädigung der Fliege zu vermeiden.

Um den Kopf der Fliege zu stabilisieren und den ventralen Teil des SOG freizulegen, befestigen Sie einen Faden, um das Rostrum teilweise angehoben zu halten. Füllen Sie die Oberfläche der Plattform mit saccharosefreier Kochsalzlösung. Öffnen Sie die Kopfkapsel, um das SOG mit einer Wolframklinge und einer Pinzette mit geschärften Spitzen, die wir die geschärfte Pinzette nennen, freizulegen.

Reißverschlüsse. Dies ist eine Demonstration von Scis-Reißverschlüssen, bei denen zum Vergleich eine Faser aus einem Kim-Tuch geschnitten wird. Dies geschieht zunächst mit einer Irisschere im Gesichtsfeld und dann vor einem ein Millimeter großen Graduiertenlineal.

Machen Sie zunächst mit der Wolframklinge einen Schnitt durch die hintere Kante. Schneiden Sie dann mit der geschärften Pinzette die Seite und die vorderen Ränder durch. Heben Sie das abgeschnittene Nagelhautstück mit der Pinzette an und entfernen Sie es.

Schneide die Antennen und Antennennerven mit der Pinzette durch. Entfernen Sie dann selektiv Luftsäcke zwischen SOG und Nagelhaut, um das Gehirn zu stabilisieren und Bewegungsartefakte zu verhindern. Als nächstes schneiden Sie die Speiseröhre am Ende in Richtung Rachen und am Ende in den SOG, um die Verbindung zwischen dem Rachen und dem Gehirn zu entfernen.

Nachdem Sie Muskel 16 identifiziert und herausgezogen haben, lösen Sie alle Luftröhren, die das Gehirn und die Nagelhaut verbinden. Platzieren Sie die Fliegen auf dem Tisch eines konfokalen Spinning-Disc-Mikroskops und wechseln Sie für die Bildgebung zur Wasserimmersionslinse. Nehmen Sie dann einen einzelnen optischen Schnitt bei vier Hertz mit einer Belichtungszeit von 122 Millisekunden unter Verwendung einer 491-Nanometer-Anregungslaserfokussierung auf den interessierenden Bereich auf.

Verwenden Sie eine Spritzennadel mit einem kleinen Docht aus Japan. War es Papier, das aus der Spitze herausragte, um der Fliege Saccharose anzubieten? Geben Sie einen kleinen Tropfen Saccharoselösung auf den Docht und saugen Sie ihn dann mit einem Injektor an, der über einen flexiblen Schlauch mit der Nadel verbunden ist, wobei ein Joystick-Manipulator die Nadel hält.

Setze den getränkten Waschpapierdocht auf die Spitze der Proben auf, aber nur für einen Augenblick. Um eine Sättigung zu vermeiden. Überwachen Sie die PROBUS-Extensionsreaktion oder das PER-Verhalten mit einer CCD-Kamera, die gleichzeitig mit der Kalziumbildgebung an ein Dissektionsmikroskop angeschlossen ist, und stellen Sie sicher, dass Sie die Daten innerhalb einer Stunde nach der Dissektion erfassen.

Hier ist eine typische Prob-Bois-Extensionsreaktion auf Stimulation mit einem WIC mit 100 millimolare Saccharose dargestellt. Wässrige Lösung, abgebildet mit einem 491-Nanometer-Laser für G-CAMP-Fluoreszenz. Die simultane Calcium-Bildgebung während des Reaktionsverhaltens der Prosaverlängerung, die hier zunächst vor und dann nach der Stimulation gezeigt wird, ermöglicht die Visualisierung von Saccharose-induzierten GAMP 3.0-Reaktionen im Motoneuron für den Winkelmesser des Rostrum-Muskels.

Im Stern des Zustands zeigt die Quantifizierung der Saccharose-induzierten GAMP 3.0-Antwort, dass die Motoneuronen auf einen Saccharose-Stimulus mit einem starken Anstieg der Fluoreszenz reagieren, gefolgt von einer Wiederherstellungsphase von mehreren Sekunden bis zur Ausgangslinie. Die Plattform ermöglicht andere Methoden wie Elektrophysiologie oder optogenetische oder psychogenetische oder chemische Aktivierung von Neuronen oder TimeLapse-Laborbildgebung von GFP-markierten Strukturen, um zusätzliche Fragen wie die Korrelation zwischen synaptischer Plastizität und Gedächtnis zu beantworten.