Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay
30. Oktober 2011
Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Isolierung und Expansion menschlicher Glioblastom-Multiforme-Tumorzellen unter Verwendung des Neurosphären-Ansatzes. Dies wird erreicht, indem das gewonnene Tumorgewebe zunächst zerkleinert, anschließend mechanisch dissoziiert und schließlich die resultierenden Zellen zur Kultivierung in Neurosphären-Kultur ausgesät werden. In diesem Video zeigen wir, wie man stammzellähnliche Zellen aus menschlichem Glioblastom-Tumorgewebe mithilfe der Neurosphären-Kultur-Methode isoliert und expandiert.
Diese Methode kann auch zur Kultivierung von Zellen aus anderen Hirntumoren sowie aus soliden Tumoren wie Brust-, Prostata-, Leber- und Lungenkrebs verwendet werden. Gut, beginnen wir. Nach Erhalt des resezierten GBM-Tumorgewebes aus der Operation wird das Medium entfernt.
Der Tumor wird zwei- oder dreimal mit steriler PBS gewaschen, um Kontaminanten wie Blut und Ablagerungen zu entfernen. Nach dem Waschen wird der resezierte Tumor in eine sterile Petrischale gelegt. Zuerst wird der Tumor in kleinere Stücke geschnitten, dann wird ein Teil des Tumorgewebes in eine separate Petrischale überführt und mit einem Skalpell der Größe 10 in kleine Stücke zerkleinert.
Dadurch wird die für die enzymatische Dissoziation verfügbare Oberfläche vergrößert. Das Zerkleinern kann je nach Größe des Tumors eine bis drei Minuten dauern. Geben Sie nun drei bis fünf ml vorgewärmtes Trypsin zum zerkleinerten Gewebe hinzu und überführen Sie es in ein steriles 15-ml-Falcon-Röhrchen.
Stellen Sie das 15-ml-Röhrchen für 10 bis 15 Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad. Schütteln Sie das Röhrchen alle fünf Minuten. Um eine bessere Gewebeverdauung sicherzustellen, geben Sie ein gleiches Volumen Trypsininhibitor hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Die Aktivierung von Trypsin wird durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren sichergestellt. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 800 RRP M oder 110 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem ml neuronalem Stammzell-Grundmedium, wobei Sie die Pipettenspitze an den Boden des Röhrchens anlegen.
Pipettieren Sie drei bis sieben Mal auf und ab, um Klumpen aufzubrechen, bis eine milchige Suspension entsteht, da übermäßiges Pipettieren zu Zelltod führen kann. Setzen Sie einen 40-Mikron-Filter auf ein 50-ml-Röhrchen. Geben Sie nun 10 bis 15 ml Basalmedium zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Zellsuspension durch den 40-Mikron-Filter laufen lassen, um so Schmutzpartikel und nicht assoziierte Klumpen zu entfernen.
PT die Zellen und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei ml komplettem Medium. Pipettieren Sie dann vorsichtig mehrmals auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.
Mischen Sie 10 µL Zellsuspension in 90 µL Trypanblau. Mischen Sie die Suspension gut durch und übertragen Sie 10 µL auf ein Hämozytometer. Führen Sie eine Zellzählung wie hier gezeigt durch.
Eine Einzelzell-Suspension ohne Zellklumpen ist erforderlich, um eine genaue Zellzahl zu erhalten. Trian-blue-positive Zellen nicht einbeziehen. Beim Zählen, um die Zellen in einem T-80-Fläschchen zu säen.
Geben Sie 20 ml vollständiges Neuro-Stammzell-Medium in ein 50-ml-Gefäß. Fügen Sie die entsprechende Menge Zellsuspension hinzu, um eine Dichte von 200.000 Zellen pro ml zu erreichen. Geben Sie nun EGF hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml zu erreichen.
Fügen Sie Heparin 0,2 % in einer Konzentration von einem Mikroliter pro ml hinzu. Geben Sie abschließend BFGF zu, um eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro ml zu erreichen. Mischen Sie die Zellen in komplettem Medium, das mit Wachstumsfaktoren angereichert ist.
Überführen Sie dann die Suspension in eine T-80-Flasche. Die Flasche wird anschließend für sieben bis zehn Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 gestellt. Nach acht Tagen im Kulturmedium sind die Sphäroide vollständig ausgewachsen und können weitergegeben werden.
Sammeln Sie den Inhalt des Kolbens und überführen Sie ihn in eine 50-ml-Zentrifuge. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 U/min für fünf Minuten. Entfernen Sie das Überstandsmittel unter Vakuum und resuspendieren Sie das Pellet in einem ml vorgewärmtem Trypsin.
Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang im Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Geben Sie eine gleiche Menge Trypsininhibitor hinzu und mischen Sie gründlich, um eine Aktivierung sicherzustellen. Anschließend pelletieren Sie die Zellen.
Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem ml komplettem Medium, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, um sie zu homogenisieren. Führen Sie eine Zellzählung wie zuvor beschrieben durch, um die Zellen in einem T-80-Fläschchen mit 20 ml komplettem Medium in einem 50-ml-Röhrchen zu säen. Geben Sie eine geeignete Menge der Zellsuspension hinzu, um eine Dichte von 50.000 Zellen pro ml zu erreichen.
Fügen Sie nun Wachstumsfaktoren einschließlich E-G-F-B-F-G-F und Heparin in der zuvor beschriebenen Konzentration hinzu. Verrühren Sie die resultierende Zellsuspension vorsichtig und überführen Sie sie anschließend in eine T-80-Flasche. Stellen Sie die Flasche für sieben bis zehn Tage in den Inkubator. Hier sehen Sie ein Beispiel einer primären GBM-Kultur.
Nach vier Tagen in diesem Stadium können Sie erkennen, dass sich die Zellen vermehren und beginnen, Sphären zu bilden. Große kugelförmige Zellverbände sollten zu diesem Zeitpunkt nicht beobachtet werden. Diese wären auf eine unangemessene Gewebepräparation zurückzuführen.
Nach einer Kultivierungsdauer von sieben bis zehn Tagen haben sich Sphäroide unterschiedlicher Größe gebildet. Wenn die Sphäroide einen Durchmesser von durchschnittlich 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben, sind sie bereit für die Passage. Dies ist ein Beispiel einer GBM-Kultur nach der achten Passage. Auch hier sind Sphäroide unterschiedlicher Größe zu erkennen; gesunde Sphäroide weisen mikroskopische Ausstülpungen an ihrem Rand auf.
Die Herstellung einer Einzelzell-Suspension ist ein sehr wichtiges Anliegen bei der Kultur von Sphäroiden. Andernfalls könnte man bereits am Tag nach der Zellansaat Zellaggregate beobachten. Diese Aggregate könnten fälschlicherweise als Sphäroide angesehen werden, wobei zu beachten ist, dass mindestens eine Woche benötigt wird, bis perforierende Zellen echte Sphäroide bilden.
Die Menge an Trümmern in der Kultur primärer Tumorsphäroide variiert je nach vielen Faktoren wie der Herkunft des Gewebes, der Präzision, mit der das Gewebe entfernt wurde, sowie der Gewebeverarbeitungstechnik. Wir hoffen, dass Sie dieses Video als hilfreich empfinden, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
Übersicht
Dieses Video-Protokoll demonstriert die Isolierung und Expansion von stammzellähnlichen Zellen aus operativ entferntem menschlichen Glioblastom-Multiforme-(GBM-)Tumorgewebe unter Verwendung der Neurosphären-Assay-Kulturmethode. Das Protokoll beschreibt die Schritte von der Gewebeprophylaxe bis zur Zellkultur und gibt Einblicke in die Techniken, die für eine erfolgreiche Zellvermehrung eingesetzt werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Onkologie
Hintergrund
- Glioblastom multiforme (GBM) ist ein hochaggressiver Hirntumor.
- Die Isolierung von stammzellähnlichen Zellen ist entscheidend für die Untersuchung der Tumorbiologie.
- Mithilfe von Neurosphären-Kulturmethoden lässt sich das Wachstum dieser Zellen in vitro ermöglichen.
- Dieses Protokoll kann ebenfalls auf andere Hirn- und solide Tumore angewendet werden.
Zweck der Studie
- Isolierung und Expansion von stammzellähnlichen Zellen aus GBM-Gewebe.
- Bereitstellung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung der Glioblastom-Biologie.
- Unterstützung der Forschung zu potenziellen therapeutischen Zielstrukturen.
Verwendete Methoden
- Entnahme und Waschen von Tumorgewebe.
- Zerkleinern und enzymatische Dissoziation des Gewebes.
- Zellzählung und Ausplattieren in Neurokugelkultur.
- Zugabe von Wachstumsfaktoren zur Zellvermehrung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von stammzellähnlichen Zellen aus GBM-Gewebe.
- Bildung von Neurosphären als Hinweis auf gesundes Zellwachstum.
- Nachweis der Bedeutung einer Einzelzell-Suspension für die Kultur.
- Beobachtung der Sphären-Morphologie als Indikator für die Gesundheit der Kultur.
Schlussfolgerungen
- Der Neurosphären-Assay eignet sich effektiv für die Kultur von GBM-Stammzell-ähnlichen Zellen.
- Eine sachgemäße Gewebepräparation ist entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse.
- Diese Methode kann dazu beitragen, das Verständnis von GBM zu verbessern und Therapien zu entwickeln.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Mit dem Neurosphären-Assay können glioblastomstammähnliche Zellen isoliert und expandiert werden, wodurch ein krankheitsrelevanter Ansatz für die Validierung von Zielstrukturen und die mechanistische Absicherung in der Onkologie-Drug-Entwicklung bereitgestellt wird. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagegenauigkeit, indem er Tumorzellpopulationen modelliert, die für das Verständnis des GBM-Fortschreitens und der therapeutischen Resistenz entscheidend sind. Er unterstützt frühe Entdeckungsarbeitsabläufe, indem skalierbare und reproduzierbare zelluläre Modelle für die Assay-Entwicklung und die Identifizierung von Leitverbindungen generiert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von tumorinitiierenden Zellpopulationen, um therapeutische Hypothesen und Wegabhängigkeiten beim Glioblastom (GBM) zu klären.
- Operationaler Wert: Bietet ein reproduzierbares Verfahren zur Isolierung stammzellähnlicher Zellen aus chirurgisch entferntem humanem Gewebe zur funktionellen Zielstrukturvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die präklinische Risikominimierung durch Modellierung der Selbsterneuerung und tumorigenen Potenzial von Krebsstammzellen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt uniforme Neurosphären-Kulturen, die für Screenings mit hohem Informationsgehalt bezüglich Wirkstoffe geeignet sind, die auf Stammzell-Pfade abzielen.
- Operativer Wert: Etabliert standardisierte Kulturbedingungen mit definierten Wachstumsfaktor-Zusätzen (EGF, bFGF, Heparin) zur Reproduzierbarkeit von Assays.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Passage und Expansion primärer Kulturen, wodurch langfristige Studien zur Wirkstoffantwort ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem genomische und phänotypische Eigenschaften primärer GBM-Tumoren in vitro bewahrt werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Abstimmung von Biomarkern durch die Analyse der Sphäromorphologie und -größe (150–200 µm) als Indikatoren für die Kulturgesundheit.
- Risikominderung: Ermöglicht die Bewertung des therapeutischen Einflusses auf die Selbstvermehrung stammzellähnlicher Zellen und unterstützt somit Entscheidungen über die Weiterentwicklung in die präklinische Phase.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Neurosphären-Assay ist in die frühe Entdeckungsphase integriert und unterstützt die Zielvalidierung durch funktionelle Assays in stammzellähnlichen Zellmodellen, bevor die Identifizierung von Leitverbindungen und präklinische Wirksamkeitstests erfolgen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Isolierung tumorinitiierender Zellen ermöglicht, um Treiber des Glioblastom-Fortschritts und der Rezidivbildung zu untersuchen.
- Screening: Liefert quantitative und reproduzierbare Neurosphärenbildung als funktionellen Endpunkt für die Wirkstoffscreening und Modulation von Signalwegen.
- Analytik: Bietet messbare Parameter wie Sphärendurchmesser, Anzahl und Morphologie zur Beurteilung der Kulturintegrität und der Wirkstoffantwort.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckungsforschung mit präklinischen Arbeiten, indem sie die stammzellähnlichen Eigenschaften der Zellen erhält, die für die Modellierung der Tumorheterogenität entscheidend sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung mehrerer solider Tumoren, darunter Brust-, Prostata-, Leber- und Lungenkrebs, wie im Protokoll beschrieben.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert das Zielvertrauen, indem die zelluläre Subpopulation modelliert wird, die für die Tumorbildung, -progression und -rezidive verantwortlich ist.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher, indem standardisierte Schritte zur Dissoziation, Filtration und Ausplattierung durchgeführt werden, um Einzelzell-Suspensionen zu erhalten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominderung von Zielstrukturen durch funktionelle Stammzelltests ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem Verbindungen identifiziert werden, die die Selbstvermehrung und Differenzierung von Krebsstammzellen modulieren.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im sterilen Gewebemanagement, der enzymatischen Dissoziation und den Kultivierungstechniken von Neurosphären.
- Setzt den Zugang zu sterilen Zellkulturschreibtischen, Zentrifugen und Hämozytometern zur Zellzählung und Bestimmung der Zellviabilität voraus.
- Erfordert standardisierte Protokolle für die Gewebeaufbereitung, um Ablagerungen und Klumpenbildung zu minimieren, die die Qualität der Sphären beeinträchtigen.
- Erfordert eine Anpassung der Wachstumsfaktorkonzentrationen entsprechend der Tumorquelle und Gewebequalität, da Variabilität die Bildung von Neurosphären beeinflusst.
- Ist durch die Notwendigkeit frischen oder sachgemäß konservierten Tumorgewebes begrenzt, um die Isolierung und Expansion vitaler, stammzellähnlicher Zellen sicherzustellen.
