Name: Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Expansion von stammzellähnlichen Zellen aus humanem Glioblastomgewebe mittels Neurosphären-Assay. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung für Tumorbiologie-Forschung.

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Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapy; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Florida-Zentrum für Hirntumor Forschung gefördert.

1. Erhebung von Primärdaten GBM Tissue <ol><li> Ein Glioblastom mutliforme (GBM) Tumor ist von einem Patienten mit der Diagnose Krebs und Chirurgie erhalten. </li><li> Arrangements muss mit der Neurochirurgie Team vorgenommen werden. Der Neurochirurg wird der resezierten GBM Tumor in einer angemessenen Größe Röhrchen mit neuralen Stammzellen (NSC) Basalmedium mit 10-15% Antibiotika (Peniciline / Streptomycin) ergänzt Platz. Kalte Medium muss auf OP-Saal durch Labor zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kalten HEPES-gepufferte Minimum Essential Medium (HEM) oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer hohen Konzentration von Antibiotika kann auch für diesen Zweck verwendet werden. </li><li> Die resezierten Tumorgewebes ist das Labor auf Eis angeliefert und unter der Haube. </li></ol> 2. Dissoziation des Primärtumors in Single-Cell Suspension <ol><li> Excess der ursprünglichen Medium / PBS wird aus der Falcon-Röhrchen abgenommen und die Probe wird 2-3 mal mit 5-10m gewaschenl PBS / NSC Basalmedium zu entfernen Blut und Schmutz. Die PBS / Medium wird entfernt und die GBM Tumorgewebe wird in einer Petrischale. </li><li> Das Gewebe wird in kleine Stücke geschnitten und gehackt mit einem Nr. 10 Skalpell in kleine Stücke, um die Oberfläche für Trypsinierung zu erhöhen. Wiegemesser kann 1-3 Minuten je nach Größe des Tumors. </li><li> Das zerkleinerte Gewebe wird in 3-5ml vorgewärmtes% 0,05 Trypsin-EDTA für 10-15 Minuten bei 37 ° C Wasserbad trypsiniert. Eine elektronische Pipette wird verwendet, um die winzigen Tumor Stücke und Trypsin in ein 15ml Falcon-Röhrchen übertragen. </li><li> Ein gleiches Volumen von Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zugesetzt wird, um die enzymatische Reaktion Trypsin nach der Inkubationszeit zu stoppen. </li><li> Trypsin Inaktivierung durch Pipettieren der Suspension nach oben und unten mehrfach gesichert. Dann wird die Suspension pelletiert unten durch Zentrifugation bei 800rpm (110g) für 5min. </li><li> Der Überstand wird verworfen und die Gewebestücke werden in 1 ml steriler NSC ba resuspendiertsal Medium. Die Klumpen sind durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren (3-7 mal), bis eine glatte milchig einzigen Zellsuspension erreicht dissoziiert. Die Zahl der Pipettierschritte direkt abhängig von der Größe der Partikel in der zerkleinerte Gewebe. Lange und kräftige mechanische Dissoziation sollte vermieden werden, da es in Zelltod und eine Reduktion in der Sphäre Bildung könnte Folge sein. </li><li> Um un-dissoziierte Teile und Trümmer zu entfernen, ist 10-15 ml Basismedium in das Röhrchen gegeben und die Zellsuspension durch ein 40 Mikron Zelle Sieb in eine 50ml Tube gefiltert. </li><li> Die filtrierte Suspension wird bei 800rpm (110g) für 5min zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend verworfen. </li><li> Pelletiert Zellen werden dann in 1-2ml komplette NSC Medium zur Zellzählung resuspendiert. </li></ol> 3. Zellzahl und Plating <ol><li> 10 l der Zellsuspension auf 90 ul von 0,04% Trypanblau in einer 1ml Eppendorf-Röhrchen aufgenommen. Hinweis: andere geeignete Zelle Verdünnunggen können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Pipette auf und ab, um die Aussetzung zu mischen. 10 ul der Zellen / Trypanblau Mischung auf Zählkammer überführt, um die Zelldichte zu zählen. </li><li> Die Zellen werden in kompletten NSC Medium (eine Mischung aus NSC Basalmedium und NSC Verbreitung Ergänzung zu einem 9:1-Verhältnis) mit 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF und 1μl/ml von 0,2% Heparin (2μg/ml) ergänzt in verchromt geeigneten Zellkultur Gefäße. 5, 20 und 40 ml Medium für T25, T80 und T175-Kolben verwendet werden, bzw.. Antibiotika können das Medium bei einer Konzentration von 1:100 hinzugefügt werden, um Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern. </li><li> Der Kolben wird in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO 2 platziert. </li></ol> 4. Passagieren und Ausbau der GBM abgeleitet Kugeln: <ol><li> Wenn die Neurosphären einer durchschnittlichen Größe von 150-200 &amp;mgr; m im Durchmesser erreicht, wird die Kultur bereit für Subkultur. Der Inhalt jeder Flasche entnommen und in eine geeignete Größe sterile tiss platziertue Kultur Rohr, und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 1 ml% 0,05 Trypsin-EDTA resuspendiert. </li><li> Um eine optimale Trypsinierung, wird die Zellsuspension bei 37 ° C im Wasserbad für 2-3 min inkubiert. Zum Stoppen der Trypsin-Aktivität ein gleiches Volumen an Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zur Zellsuspension gegeben und die Zellsuspension vorsichtig und pipettiert nach unten. </li><li> Die Zellsuspension wird bei 800 rpm (110g) für 5 min zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgenommen und die Zellen werden in 1 ml der NSC-Medium resuspendiert. </li><li> Eine Zellzahl erfolgt wie oben beschrieben. </li><li> Die Zellen werden in einer Konzentration von 5x10 4 Zellen / ml in kompletten NSC Medium mit Wachstumsfaktoren und vernickelt in entsprechender Größe Gewebekultur Schiffe wie in den vorangegangenen Teil beschrieben ausplattiert. </li><li> Sekundäre Neurosphären werden in ca. 7-10 Tagen entsteht, wenn bei 37 ° C in einer feuchtenified Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach dem Ausstreichen der einzelnen Zellen von GBM Tumorgewebe entnommen, vermehren sich Tumorstammzellen-ähnliche Zellen und erzeugen kleine Cluster von Zellen wenige Zellen in 3-4 Tagen zusammen (siehe Video und Bild 1). Wie diese Cluster wachsen, erhalten sie eine Kugelform, so dass von 7-8 Tagen, korrekten Phase helle Kugeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 150-200 Mikrometern (Sehen Sie das Video und Abbildung 2). Bei höherer Vergrößerung, gesunde Bereiche in der Regel zeigen microspikes an ihrer Peripherie. Nachdem große Kugel wie Trauben in 1-2 Tagen nach Einleitung Kultur ist durch die Existenz von nicht-dissoziierten Klumpen an der binging der Kultur und sollte nicht als echte Kugeln verwechselt werden. Die Menge der Ablagerungen in Primärtumor Bereich Kultur hängt von der ursprünglichen Quelle des Gewebes abhängig und ob es umfasst alle umliegenden Hirngewebe. Proper Gewebe Präparationstechnikeneinschließlich enzymatischer und mechanischer Dissoziation und anschließender Filtration der Probe mit einer ausreichenden Menge Medium kann in weniger Geröll in der Kultur führen. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Primary GBM Bereich Kultur 4 Tage nach dem Ausplattieren. Tumorstammzellen-ähnlichen Zellen vermehren sich und erzeugen kleine Gruppen von Zellen in 3-4 Tagen. Original-Vergrößerung, 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Gang sind GBM Bereich Kultur 8 Tage nach dem Ausplattieren. Original-Vergrößerung, 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Um neuralen Stamm-und Vorläuferzellen aus normalen Erwachsenen und fetale Gehirn 1, 2, 3, 4 zu isolieren und auch Tumorstammzellen-ähnliche Zellen aus Krebsgewebe wie Lungen-5, Prostata-6, 7 und Brust Gehirn 8, 9 der Neurosphäre Assay wurde häufig als die Methode der Wahl eingesetzt. Mit diesem einfachen und reproduzierbaren Test kann man erzeugen, eine unbestimmte Anzahl von Zellen aus resezierten Tumorgewebes, die ähnliche Merkmale wie somatische Stammzellen zeigen, ex vivo Multipotenz, die Fähigkeit, neue Tumoren nach der Implantation zu schaffen und sich selbst zu erneuern. Diese Zellen könnten verwendet werden, um die grundlegenden Krebs Zellbiologie einschließlich Zell-Zell-Interaktionen, und die Differenzierung, Migration, Invasion und Zelltod zu untersuchen. Darüber hinaus bieten isoliert Tumorstammzellen-ähnlichen Zellen ein unschätzbares Werkzeug zu untersuchen, wie Tumore zu bilden, Fortschritt und Rückfall und auch auf die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen ableiten, die schließlich Erkenntnisse zu therapeutischen könnte entwirrenOptionen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) </td><td> Medium ergänzen </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> % 0,05 Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM-Komponente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM-Komponente </td></tr><tr><td> * Destilliertes Wasser </td><td> Reagens </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNase I </td><td> Reagens </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Sojabohnentrypsininhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nr. 10 Skalpell </td><td> Chirurgisches Werkzeug </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischale </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Kleine Pinzette </td><td> Chirurgische Instrumente </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> Sieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25-Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc internationalen </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80-Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc international </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Rekonstituierte in PBS </td></tr></tbody></table> * Um HEM machen, mischen 1x10L Paket MEM and160ml 1M HEPES und bringen das Volumen auf 8,75 L mit destilliertem Wasser. Setzen Sie den End-pH um 7.4 Eind lagern bei 4 ° C. ** Zur Vorbereitung Trypsin-Inhibitor-Lösung, stellen Sie zunächst 10 ml DNase I-Lösung (100 mg DNase in 100 ml HEM gelöst) und fügen Sie dann 0,14 g Trypsin-Inhibitor zur DNase-Lösung und endlich das Volumen bis zu 1 Liter mit HEM. Keep Aliquots der Endprodukte in -20 ° C Gefrierschrank.

isolation und expansion der menschlichen glioblastoma multiforme tumorzellen unter verwendung der neurosphäre assay

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Stem-like Zellen in Tumoren wie Brust-, Lungen-, Darm-, Prostata und Gehirn isoliert worden. Ein kritischer Punkt bei all diesen Tumoren, insbesondere in Glioblastom mutliforme (GBM), zu identifizieren und zu isolieren tumorauslösende Zellpopulation (s), um ihre Rolle in der Tumorentstehung, Progression, und ein erneutes Auftreten zu untersuchen. Understanding tumorauslösende Zellpopulationen werden Hinweise auf der Suche nach wirksamen Therapien für diese Tumoren liefern. Die Neurosphäre Assay (NSA) aufgrund seiner Einfachheit und Reproduzierbarkeit als die Methode der Wahl für die Isolierung und Vermehrung von vielen dieser Tumorzellen eingesetzt. Dieses Protokoll zeigt die Neurosphäre Kultur-Methode zu isolieren und zu erweitern Stamm-ähnliche Zellen in operativ entfernt menschlichen GBM Tumorgewebe. Die Verfahren beinhalten eine erste chemische Verdauung und mechanische Dissoziation von Tumorgewebe und anschließend plating die daraus resultierenden einzigen Zellsuspension in NSA Kultur. Nach 7-10 Tagen, primäre Neurosphären von 150-200 um im Durchmesser beobachtet werden und sind für die weitere Passage und Expansion bereit.

Dieses Video zeigt, Protokoll der Isolierung und Expansion von Stammzellen, wie Zellen, die aus operativ entfernt menschlichen Glioblastom mutliforme (GBM) Tumorgewebe mit dem Neurosphäre Assay Kultur-Methode.

Isolation und Expansion der menschlichen Glioblastoma multiforme Tumorzellen unter Verwendung der Neurosphäre Assay

Stammzellähnliche Zellen wurden in Tumoren isoliert, unter anderem in Brust-, Lungen-, Kolon-, Prostata- und Hirntumoren. Ein kritisches Problem bei all diesen Tumoren, insbesondere bei ...

Das Ziel dieses Protokolls ist die Isolierung und Expansion menschlicher Glioblastom-Multiforme-Tumorzellen unter Verwendung des Neurosphären-Ansatzes. Dies wird erreicht, indem das gewonnene Tumorgewebe zunächst zerkleinert, anschließend mechanisch dissoziiert und schließlich die resultierenden Zellen zur Kultivierung in Neurosphären-Kultur ausgesät werden. In diesem Video zeigen wir, wie man stammzellähnliche Zellen aus menschlichem Glioblastom-Tumorgewebe mithilfe der Neurosphären-Kultur-Methode isoliert und expandiert.Diese Methode kann auch zur Kultivierung von Zellen aus anderen Hirntumoren sowie aus soliden Tumoren wie Brust-, Prostata-, Leber- und Lungenkrebs verwendet werden. Gut, beginnen wir. Nach Erhalt des resezierten GBM-Tumorgewebes aus der Operation wird das Medium entfernt.Der Tumor wird zwei- oder dreimal mit steriler PBS gewaschen, um Kontaminanten wie Blut und Ablagerungen zu entfernen. Nach dem Waschen wird der resezierte Tumor in eine sterile Petrischale gelegt. Zuerst wird der Tumor in kleinere Stücke geschnitten, dann wird ein Teil des Tumorgewebes in eine separate Petrischale überführt und mit einem Skalpell der Größe 10 in kleine Stücke zerkleinert.Dadurch wird die für die enzymatische Dissoziation verfügbare Oberfläche vergrößert. Das Zerkleinern kann je nach Größe des Tumors eine bis drei Minuten dauern. Geben Sie nun drei bis fünf ml vorgewärmtes Trypsin zum zerkleinerten Gewebe hinzu und überführen Sie es in ein steriles 15-ml-Falcon-Röhrchen.Stellen Sie das 15-ml-Röhrchen für 10 bis 15 Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad. Schütteln Sie das Röhrchen alle fünf Minuten. Um eine bessere Gewebeverdauung sicherzustellen, geben Sie ein gleiches Volumen Trypsininhibitor hinzu, um die Reaktion zu stoppen.Die Aktivierung von Trypsin wird durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren sichergestellt. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 800 RRP M oder 110 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem ml neuronalem Stammzell-Grundmedium, wobei Sie die Pipettenspitze an den Boden des Röhrchens anlegen.Pipettieren Sie drei bis sieben Mal auf und ab, um Klumpen aufzubrechen, bis eine milchige Suspension entsteht, da übermäßiges Pipettieren zu Zelltod führen kann. Setzen Sie einen 40-Mikron-Filter auf ein 50-ml-Röhrchen. Geben Sie nun 10 bis 15 ml Basalmedium zur Zellsuspension hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie die Zellsuspension durch den 40-Mikron-Filter laufen lassen, um so Schmutzpartikel und nicht assoziierte Klumpen zu entfernen.PT die Zellen und saugen Sie den Überstand ab. Resuspendieren Sie die Zellen in ein bis zwei ml komplettem Medium. Pipettieren Sie dann vorsichtig mehrmals auf und ab, um die Suspension zu homogenisieren.Mischen Sie 10 µL Zellsuspension in 90 µL Trypanblau. Mischen Sie die Suspension gut durch und übertragen Sie 10 µL auf ein Hämozytometer. Führen Sie eine Zellzählung wie hier gezeigt durch.Eine Einzelzell-Suspension ohne Zellklumpen ist erforderlich, um eine genaue Zellzahl zu erhalten. Trian-blue-positive Zellen nicht einbeziehen. Beim Zählen, um die Zellen in einem T-80-Fläschchen zu säen.Geben Sie 20 ml vollständiges Neuro-Stammzell-Medium in ein 50-ml-Gefäß. Fügen Sie die entsprechende Menge Zellsuspension hinzu, um eine Dichte von 200.000 Zellen pro ml zu erreichen. Geben Sie nun EGF hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro ml zu erreichen.Fügen Sie Heparin 0,2 % in einer Konzentration von einem Mikroliter pro ml hinzu. Geben Sie abschließend BFGF zu, um eine Endkonzentration von 10 Nanogramm pro ml zu erreichen. Mischen Sie die Zellen in komplettem Medium, das mit Wachstumsfaktoren angereichert ist.Überführen Sie dann die Suspension in eine T-80-Flasche. Die Flasche wird anschließend für sieben bis zehn Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 gestellt. Nach acht Tagen im Kulturmedium sind die Sphäroide vollständig ausgewachsen und können weitergegeben werden.Sammeln Sie den Inhalt des Kolbens und überführen Sie ihn in eine 50-ml-Zentrifuge. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 U/min für fünf Minuten. Entfernen Sie das Überstandsmittel unter Vakuum und resuspendieren Sie das Pellet in einem ml vorgewärmtem Trypsin.Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang im Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Geben Sie eine gleiche Menge Trypsininhibitor hinzu und mischen Sie gründlich, um eine Aktivierung sicherzustellen. Anschließend pelletieren Sie die Zellen.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem ml komplettem Medium, indem Sie die Zellsuspension vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, um sie zu homogenisieren. Führen Sie eine Zellzählung wie zuvor beschrieben durch, um die Zellen in einem T-80-Fläschchen mit 20 ml komplettem Medium in einem 50-ml-Röhrchen zu säen. Geben Sie eine geeignete Menge der Zellsuspension hinzu, um eine Dichte von 50.000 Zellen pro ml zu erreichen.Fügen Sie nun Wachstumsfaktoren einschließlich E-G-F-B-F-G-F und Heparin in der zuvor beschriebenen Konzentration hinzu. Verrühren Sie die resultierende Zellsuspension vorsichtig und überführen Sie sie anschließend in eine T-80-Flasche. Stellen Sie die Flasche für sieben bis zehn Tage in den Inkubator. Hier sehen Sie ein Beispiel einer primären GBM-Kultur.Nach vier Tagen in diesem Stadium können Sie erkennen, dass sich die Zellen vermehren und beginnen, Sphären zu bilden. Große kugelförmige Zellverbände sollten zu diesem Zeitpunkt nicht beobachtet werden. Diese wären auf eine unangemessene Gewebepräparation zurückzuführen.Nach einer Kultivierungsdauer von sieben bis zehn Tagen haben sich Sphäroide unterschiedlicher Größe gebildet. Wenn die Sphäroide einen Durchmesser von durchschnittlich 150 bis 200 Mikrometern erreicht haben, sind sie bereit für die Passage. Dies ist ein Beispiel einer GBM-Kultur nach der achten Passage. Auch hier sind Sphäroide unterschiedlicher Größe zu erkennen; gesunde Sphäroide weisen mikroskopische Ausstülpungen an ihrem Rand auf.Die Herstellung einer Einzelzell-Suspension ist ein sehr wichtiges Anliegen bei der Kultur von Sphäroiden. Andernfalls könnte man bereits am Tag nach der Zellansaat Zellaggregate beobachten. Diese Aggregate könnten fälschlicherweise als Sphäroide angesehen werden, wobei zu beachten ist, dass mindestens eine Woche benötigt wird, bis perforierende Zellen echte Sphäroide bilden.Die Menge an Trümmern in der Kultur primärer Tumorsphäroide variiert je nach vielen Faktoren wie der Herkunft des Gewebes, der Präzision, mit der das Gewebe entfernt wurde, sowie der Gewebeverarbeitungstechnik. Wir hoffen, dass Sie dieses Video als hilfreich empfinden, und wünschen Ihnen viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

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