Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Methode, die als Tandem-Affinitätsreinigung bekannt ist, zu verwenden, um Proteinbindungspartner zu isolieren. Hallo, ich bin dLAN Bailey von der Sektion für Virologie am Imperial College London. In unserem Labor arbeiten wir an Virus-Wirt-Interaktionen für verschiedene Mitglieder der Virusfamilie.

Die Identifizierung von Proteinen, die mit anderen zellulären oder viralen Proteinen interagieren, ist ein guter Ausgangspunkt, um das Zusammenspiel zwischen dem Virus und seinem Wirt während der Infektion zu untersuchen. In diesem Video erkläre ich einen Ansatz, den wir in unserem Labor verwenden, die Tandem- und E-Reinigung oder das Tap-Tagging. Der in dieser Studie verwendete Tap-Tag ist ein N-terminaler Tag, der aus zwei Einheiten des Proteins G und einem Streptokokken-Adin-bindenden Peptid besteht.

Diese werden durch eine TEV-Protease-Spaltsequenz getrennt, die eine spezifische Elution des Köderproteins ermöglicht. In diesem Beispiel, murin, EIF vier E befindet sich am C-Terminus dieses Fusionskonstrukts. Das Tap-Tagging-Protokoll ist ein sechsstufiges Verfahren.

Nach der Transfektion und Erzeugung von Zelllinien werden die Zellen dazu angeregt, das tag-abat-Protein zu exprimieren, bevor sie in einem milden Lysepuffer liegen. Zwei Affinitätsreinigungsschritte und zwei spezifische Lösungen werden verwendet, um den Köder und mögliche Interaktionspartner zur Erzeugung von Zelllinien zu reinigen. HEC 2 93-Zellen sollten mit der P met four-Expressionsvektorkodierung transfiziert werden.

Die mit dem Zapfhahn markierten Köderproteinzellen werden dann mit hundert Mikrogramm pro mil Hygromycin B selektiert. Da das Plasmid episo erhalten bleibt, besteht keine Notwendigkeit, spezifische Klone zu isolieren. 10 konfluente Zellen werden durch Behandlung mit 10 mikromolarem Cadiumchlorid für 16 Stunden induziert, bevor sie in das Medium abgeschabt werden. Die suspendierten Zellen werden dann in 15-M-Röhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugation pelletiert.

Diese Zellen werden dann dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, bevor sie schließlich pelletiert werden. Die Zellen der zweiten Stufe liegen durch wiederholtes Pipettieren in fünf mil kaltem Lysepuffer, bevor sie fünf Minuten lang auf Eis gelassen werden. Um eine effiziente Lyse zu gewährleisten, werden die Zellen dann durch eine schmale, stumpfe Nadel gespritzt und aufgefroren.

Das resultierende Fett wird in 1,5-mil-Röhrchen aufgeteilt und die Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugation entfernt. Bemerkenswert ist, dass die Pelletgröße nach diesem Zentrifugationsschritt deutlich reduziert wird. Die Lysatüberstände werden dann in einem 15-mil-Falcon-Rohr kombiniert und durch einen 0,45-Mikrometer-Filter geleitet, um zusätzliche Ablagerungen zu entfernen.

Für die anschließende Analyse sollten 50 Mikroliter Aliquots dieses Lysats entnommen werden. Diese Probe wird als erste Probe bezeichnet. Schritt drei, Bindung an Kaninchen IgG Aeros.

In dieser Phase des Protokolls werden die Protein-G-Tags durch Kaninchen-IgG-aros immunpräzipitiert. Um Aros-Perlen zuzuordnen, entfernen Sie das Ende der Affenspitze. Dies hilft, eine Beschädigung der Perlen zu vermeiden.

Suspendieren Sie die Kaninchen-IgG-Aro-Lösung vorsichtig, indem Sie die Flasche schwenken, bevor Sie die Aros in ein 15-mil-Röhrchen entfernen. Waschen Sie die Aros dreimal in gekühltem Lysepuffer unter Verwendung einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, um die Kügelchen bei jedem Schritt zu klären. Die pelletierten Kaninchen-IgG-Kügelchen sollten nach der Zentrifugation sichtbar sein.

Entfernen Sie nach jedem Schritt vorsichtig den Puffer, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem die letzte Wäsche abgeschlossen ist, geben Sie das gefilterte und geklärte Lysat zu den verpackten Kügelchen und inkubieren Sie es drei Stunden lang oder über Nacht. Bevorzugt bei vier Grad C mit einem rotierenden Mischer.

Nach der Immunpräzipitation werden die Agros-Kügelchen heruntergeschleudert und der Überstand für die anschließende Analyse entfernt. Bei Bedarf können Sie mit einer feinen Bauspitze die restliche Flüssigkeit aus diesem Rohr entfernen. Bei diesem Überstand handelt es sich um eine zweistufige TEV-Proteasespaltung der Probe.

In diesem Schritt wird der Köder von den Protein-G-Tags abgespalten. Dieser Schritt ermöglicht die spezifische Spaltung des Köderproteins, effektiv ein Elutionsschritt aus dem IgG der Immunpräzipitation des Kaninchens. Bereiten Sie die TEV-Spaltmischung vor und fügen Sie diese mit der Affenspitze zu den Aros-Kügelchen hinzu, wobei das Ende entfernt wurde, übertragen Sie diese Mischung in ein silikonisiertes Mikrozentrifugenröhrchen und drehen Sie sie um, um die Aros vor der nächtlichen Inkubation bei vier Grad C in Suspension zu mischen, entfernen Sie einen Alico dieser TEV-Spaltreaktion zur Analyse.

Dies ist Beispiel drei. Eine Inkubation über Nacht auf dem rotierenden Mischer sollte es ermöglichen, dass die TEV-Reaktion nahezu abgeschlossen ist. Schritt fünf, Bindung, um die strepten Adin-Kügelchen zu immobilisieren.

In diesem Schritt werden der Cleve-Köder und alle potenziellen Bindungspartner aus der Lösung affinitätsgereinigt. Zuerst wird die TEV-Spaltungsreaktion mit den Kaninchen-IgG-Aros-Kügelchen zentrifugiert. Um die Aros zu pelletieren, entfernen Sie ein OTT des geklärten Überstands für die Analyse.

Dies ist Beispiel vier. Entfernen Sie vorsichtig alle verbleibenden Überstände, die Ihr Köderprotein enthalten, in ein frisches Röhrchen. Auch hier gilt: Verwenden Sie fein.

Bauen Sie Peppe-Spitzen auf, um alle möglichen Überstände zu entfernen. Bewahren Sie die Kaninchen-IgG-Aros-Kügelchen für die anschließende Analyse auf. Dies ist Beispiel fünf.

Um eine Beschädigung der Streptokokken-Adin-Perlen zu vermeiden, entfernen Sie das Ende von einer Haustierspitze. Suspendieren Sie die Kügelchen vorsichtig wieder und entfernen Sie einen Alico auf eine silikonisierte Tube. Die Streptokokken werden in Kügelchen mit S-Puffer gewaschen und durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt.

Nach jeder Wäsche. Entfernen Sie nach jeder Wäsche vorsichtig den Puffer. Strept Adin Perlen sind sehr klein und lassen sich auch bei feiner Verwendung leicht verschieben.

Tipps zum Erstellen von Haustieren. Nachdem die Stepp Adin Perlen gewaschen wurden. Geben Sie den Überstand aus der TEV-Spaltungsreaktion zu diesen Kügelchen und inkubieren Sie die Reaktion drei Stunden lang oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit einem rotierenden Mischer.

Nach der Inkubation hat die Zentrifuge die Havein-Kügelchen entfernt und das Sup natum entfernt. Dies ist Beispiel sechs. Bemerkenswert.

Das Beit-Protein ist nun mit den verbleibenden Kügelchen im Röhrchen assoziiert. Waschen Sie die Streptavidin-Kügelchen, die Ihr Köderprotein enthalten, mit Lysepuffer. Um zusätzliche kontaminierende Proteine zu entfernen, entfernen Sie die restliche Waschlösung von den Kügelchen und lassen Sie sie auf Eis.

Sechster Schritt, Biotin-Elution. In diesem Schritt wird den Streptavidin-Kügelchen Biotin zugesetzt. Durch die Wechselwirkung zwischen Biotin und den Streptavidin-Kügelchen wird der Köder verdrängt, der wieder in Lösung geht.

Die Biotinlösung direkt zu den Kügelchen geben und zum Mischen invertieren. Inkubieren Sie die Reaktion drei Stunden lang oder über Nacht bei vier Grad Celsius mit einer rotierenden Mischzentrifuge, dem Biotin-Aeros-Gemisch, und sammeln Sie das Gemisch vorsichtig in einem frischen Röhrchen. Dies ist Ihr letztes EIT, das als Stichprobe sieben bezeichnet wird.

Die restlichen Stepp-Havein-Kügelchen sind Probe acht. Aufgrund seiner geringen Proteinkonzentration muss dieses endgültige Eluat vor der Analyse konzentriert werden. Dies wird durch niedrige Molekulargewichte erreicht, das Abschalten von Spin-Säulen und die Reduzierung des Volumens durch Zentrifugation und regelmäßige Überwachung des Prozesses erreicht.

Diese konzentrierte Probe kann gespalten und auf SDS-Seitengelen durch Kumasi- und Silberfärbung analysiert werden. Wenn die Proben mittels Massenspektrometrie analysiert werden sollen, empfehlen wir die Verwendung von handelsüblichen Fertiggelen. Anschließend können einzelne Banden extrahiert und die Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert werden.

In diesem Fall war der Köder murin, EIF für E-Protein. Der Vorteil des Tap-Systems besteht darin, dass Sie die Möglichkeit haben, Ihr Protein von Interesse in einer bestimmten Zelllinie zu exprimieren, und abhängig von der Zelllinie, an der Sie interessiert sind, gibt es Ihnen auch die Möglichkeit, das Protein in relativ niedrigen Mengen zu exprimieren. Sie entscheiden sich dafür, und alle posttranslationalen Modifikationen und Lokalisierungen bleiben erhalten, so dass Sie den nativen Komplex oft reinigen können.